CC BY
45
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРИМЕСЕЙ ВО ФРУКТОВЫХ СОКАХ И
МУЛЬТИСОКАХ
Самойлов Артем Владимирович
канд. биол. наук, зав. научно-исследовательской испытательной лабораторией по определению ГМИ в сырье и пищевой продукции ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности,
г. Видное, Московской обл.
E-mail: gmivniikop@rambler.ru Колпаков Евгений Юрьевич аспирант, научный сотрудник научно-исследовательской испытательной лабораторией по определению ГМИ в сырье и пищевой продукции ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности, г. Видное, Московской обл.
E-mail: gmivniikop@rambler.ru
THE USE OF MOLECULAR STUDIES TO IDENTIFY IMPURITIES IN FRUIT JUICES AND MIXED JUICES
Artem Samoylov
candidate of Biology Sciences, Head of Research Testing Laboratory by definition of
GMO in food and feed products, Russian Research Institute of Canning and Vegetable-Drying Technology, Vidnoye, Moscow's region.
Evgeniy Kolpakov
graduate student, Research Collaborator of Research Testing Laboratory by definition of GMO in food andfeed products, Russian Research Institute of Canning and Vegetable-Drying Technology, Vidnoye, Moscow's region.
АННОТАЦИЯ
Рассмотрена возможность применения молекулярных маркеров рода Prunus для выявления состава фруктовых соков из плодов абрикоса, персика, нектарина, вишни, черешни. Праймеры PruC2m, UDAp-404 и UDP96-003 специфичны к черешне, персику и вишне соответственно.
ABSTRACT
Considered the possibility of using molecular markers to identify the genus Prunus tampering with fruit juice from the fruit of apricot, peach, nectarine, cherry, sweet cherry. Primers PruC2m, UDAp-404 and UDP96-003 are specific to the sweet cherry, peach and cherry, respectively.
Ключевые слова: фруктовые соки, примеси, ДНК, ПЦР, олигонуклеотидные праймеры
Keywords: fruit juices, impurities, DNA, PCR, oligonucleotide primers
Род Prunus (Слива) включает большое количество видов плодовых растений, плоды которых используются в пищу, в том числе в виде соков. По ITIS (Integrated Taxonomic Information System) род Prunus подразделяется на подрод Amygdalus (Миндаль), включающий вид Prunus duclis (Миндаль) и вид Prunus persica (Персик) подрод Prunus (Слива), включающий вид Prunus domestica (Слива домашняя) и вид Prunus armeniaca (Абрикос), подрод Cerasus (Вишня), включающий вид Prunus cerasus (Вишня) и вид Prunus avium (Черешня). Следует отметить существование такой вариации персика как нектарин, или персик неопушённый (Prunus persica var. Nucipersica), являющийся результатом почковой мутации; при этом, на одном дереве могут произрастать одновременно и плоды персика, и плоды нектарина [9].
В структуре потребления соков в России, персиковый и вишнёвый соки, а также сокосодержащие на их основе напитки, занимают 4,1 % и 2,1 % соответственно [2].
На сегодняшний день состав соков и соковой продукции регламентируются Федеральным законом № 178-ФЗ [4], а также Государственным стандартом (ГОСТ), в частности, он, устанавливает пороги недопустимых модификаций состава соков и соковой продукции, где указывает на запрет добавления вишнёвого и других соков «красных» фруктов в гранатовый сок [1].
Одной из часто встречающихся форм фальсификации соков является купажирование дорогих соков (смешивание) с дешёвыми соками без декларирования этого факта. Например: сок абрикоса добавляют в сок персика, яблочный сок смешивают с виноградным, мандариновый сок с апельсиновым. В смеси соков сложно выявить их ингредиентный состав, также сложно определить добавление соков, схожих по вкусовым качествам с исходным
соком; в связи с этим, фальсификация либо не определяется, либо приходится прибегать к дорогостоящим методам высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрометрии, либо к сложным аналитическим методам химического анализа. Причём ни один из этих методов не гарантирует обнаружения незначительного присутствия других соков [3].
В последнее время, молекулярные технологии успешно помогают описывать генетическое разнообразие. Указывать на сходства и различия, а также родственность, помогают различные типы молекулярных маркеров, таких как: RAPD (случайно амплифицированная полиморфная ДНК), RFPL (фрагменты ограниченного полиморфизма), AFPL (фрагменты с усиленным полиморфизмом) и SSR (простые повторяющиеся последовательности) [5]
Метод ПЦР позволяет обнаружить присутствие посторонней ДНК в составе исследуемой продукции. Данный метод высокочувствителен и способен выявлять ДНК искомого продукта, даже при его концентрации до 5 %, а вероятность его обнаружения составляет 99,9 %.
На сегодняшний день разработаны ДНК-системы анализа пищевых продуктов и сырья для обнаружения генетически модифицированных ингредиентов (ГМИ), выявления пищевых патогенных микроорганизмов, аллергенов, а также идентификации видовой принадлежности мясных и растительных ингредиентов [3].
На основании имеющихся молекулярно -генетических приёмов представляется возможным разработать метод, предназначенный для выявления возможной фальсификации, связанной с замещением сырьевого состава соками плодов растений рода Prunus.
Объекты и методы исследования
Материалом для исследования являлись соки, полученные из плодов абрикоса, персика, нектарина, вишни и черешни. Соки отбирали в пробирки объёмом 15 мл. Для выделения ДНК из каждой пробы отбирали по 200 мкл сока и переносили в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф объёмом 1,5 мл.
Выделение ДНК проводили по протоколу комплекта реагентов для выделения ДНК «ПРОБА-ЦТАБ» (ООО «ДНК-Технология», Россия, Москва). Концентрацию экстрагированной ДНК оценивали с помощью спектрофотометра Varian Cray 100 Scan.
Для оптимизации параметров амплификации были отобраны 6 пар праймеров, среди которых праймеры черешни, вишни, абрикоса, персика. Синтез праймеров осуществлялся фирмой ООО «СибЭнзим-М» (Россия, Новосибирск). Нуклеотидные последовательности праймеров приведены в таблице 1.
Таблица l.
Нуклеотидные последовательности праймеров
Название праймера Последовательность праймеров Источник
PruC2m TGG CCA AGT AAT TAT TCA AAC C CAA AAT ACC ACT TCA TGT AAC AAC Hongxiga, 2010 [7]
UDAp-404 CAT GAA CAG GGT CAA AAG CA TAT ATC CTT ACG CGG CCT CA Messina, 2004 [8]
UDP98-022 CTA GTT GTG CAC ACT CAC GC GTC GCA GGA ACA GTA AGC CT Testolin, 2004 [ll]
UDP98-024 CCT TGA TGC ATA ATC AAA CAG C GGA CAC ACT GGC ATG TGA AG Testolin, 2004 [ll]
UDP96-00l AGT TTG ATT TTC TGA TGC ATC C TGC CAT AAG GAC CGG TAT GT Cipriani et al., 1999 [6]
UDP96-003 TTG CTC AAA AGT GTC GTT GC ACA CGT AGT GCA ACA CTG GC Cipriani et al., 1999 [6]
Расчёт температуры отжига проводили по формуле Уоллеса:
Tm= 2 (А + Т) + 4 (G+ C)
где: значения: A, T, G, C соответствуют количеству нуклеотидов аденина, тимина, гуанина и цитозина [10].
Постановку ПЦР проводили с использованием набора реагентов GenPak PCR Core (ООО «Лаборатория ИзоГен», Россия, Москва) на программируемом амплификаторе «ТерцикТМ» (ООО «ДНК -Технология», Россия, Москва). В
состав реакционной смеси объёмом 20 мкл входили: дюлиент — 10 мкл, готовый раствор праймеров — 5 мкл, образец ДНК — 5 мкл, Taq ДНК полимераза, дезоксинуклеозидфосфаты — 200 мкМ и хлорид магния — 2,5 мM.
Продукты ПЦР разделяли электрофоретически в 2 % агарозном геле (ООО «Компания Хеликон» Россия, Москва) в ТВЕ-буфере (121,1 г Трис-НС1, 51,35 г борной кислоты, 3,72 г ЭДТА в 1 л бидистилированной воды) с добавлением бромистого этидия (ООО «Компания Хеликон», Москва) (20 мг/мл) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Продукты ПЦР визуализировали в ультрафиолетовом свете с длиной волны 366 нм и фотографировали.
Результаты исследований
Наиболее важным параметром амплификации является температура отжига праймеров. Оптимальной является та температура, при которой реакция проходит без образования неспецифических продуктов. Нормальный диапазон температуры отжига праймеров — 36—75 °С. Первоначально, при постановке реакции, использовали данные из литературных источников. Однако не во всех случаях реакция проходила успешно. Для получения оптимального и достоверного результата мы постепенно повышали значение температуры отжига праймеров. Так, для пары праймеров Ц0Р96-001 полученную из литературных источников температуру 57 °С, мы повышали до 67 °С. Перечень температурных режимов приведён в табл. 2.
Таблица 2.
Перечень параметров температуры отжига
Название праймера Температура отжига из литературного источника Температура отжига расчётная Температура отжига оптимизированная
РгиС2ш 56 °С 58 °С 60 °С
ШАр-404 56 °С 58 °С 57 °С
ШР98-022 57 °С 62 °С 61 °С
ШР98-24 57 °С 62 °С 61 °с
ШР96-001 57 °С 62 °С 67 °С
ШР96-003 57 °С 60 °С 63 °С
Для проведения ПЦР были выбраны следующие универсальные временные отрезки: 4 мин — первичная денатурация, амплификация: 15 с — денатурация, 60 с — отжиг праймеров, 30 с — полимеризация.
Подобранные условия позволили хорошо визуализировать результаты полимеразной цепной реакции и зафиксировать их (Рис. 1).
Рисунок 1 Результаты ПЦР анализа с использованием пар праймеров: а — РгиС2т, б — иВЛр-404, в — иВР98-022, г — иВР98-024, д — иВР96-001, е — иВР96-003. 1 — отрицательный контроль, 2 — сок абрикоса, 3 — сок персика, 4 — сок нектарина, 5 — сок вишни, 6 — сок черешни
Как видно из представленных снимков во всех случаях качественная реакция прошла успешно с образованием визуализируемых полос ампликонов. Стоит отметить, что праймеры РгиС2ш, ЦОАр-404 и ЦЮР96-003 оказались видоспецифичны только к одному из образцов, а праймеры ЦОР98-022, ЦЮР98-024 и И0Р96-001 проявляют полиморфизм по отношению к нескольким пробам. Результаты качественной реакции для идентификации фруктовых соков приведены в табл. 3.
Таблица 3.
Результаты качественного анализа соков разными наборами праймеров
PruC2m Абрикос Персик Нектарин Вишня Черешня +
UDAp-404 + — — — —
UDP98-022 — + + + +
UDP98-024 + + — — —
UDP96-001 — + + + —
UDP96-003 — — — + —
Для определения возможности выявления факта смешивания разных образцов соков была поставлена задача выявить внесение постороннего сока в образец в пропорции 1:20. Пробы формировали следующим образом: проба 1 — 9,5 мл персикового сока + 0,5 мл сока абрикоса, проба 2 — 9,5 мл гранатового сока + 0,5 мл сока вишни, проба 3 — 9,5 мл гранатового сока + 0,5 мл сока черешни. Результат выявления данного факта методом ПЦР представлен на рис. 2.
2 % 1 2 --------1 1 2
(а) (б) (В)
Рисунок 2. Результаты ПЦР анализа с использованием пары праймеров: а
— и0Лр-404, б — РгиС2т, в - и0Р96-003; а — 1 — Сок персика 100 % (отрицательный контроль). 2 — Сок персика 95 % + сок абрикоса 5 %, б — 1 — Сок граната 100 0% (отрицательный контроль), 2 — Сок граната 95 % + сок черешни 5 %, в — 1 — Сок граната 100 % (отрицательный контроль),
2 — Сок граната 95 % + сок вишни 5 %
Как видно из представленных снимков, качественная реакция на определение присутствия посторенней примеси сока прошла успешно во всех
случаях, что подтвердило возможность выявления факта добавления постороннего сока в концентрации до 5 %. Выводы
Праймеры PruC2m специфичны только к соку черешни, UDAp-404 специфичны только абрикосовому соку, а UDP96-003 к соку из вишни. Праймеры UDP98-022 проявляют специфичность одновременно к сокам из персика, нектарина, вишни и черешни, UDP98-024 одновременно к сокам из абрикоса и персика, UDP96-001 проявляет специфичность к сокам из персика нектарина и вишни.
Во всех случаях оптимизированная температура отжига праймера превышает на 1—6 °C температуру отжига, приведённую в источниках.
Качественная реакция на выявление примеси постороннего сока в объёме 5 % показала возможность применения ПЦР для выявления фальсификации, связанной с недопустимой модификацией сырьевого состава соков. Праймеры PruC2m и UDP96-003, соответственно, способны идентифицировать примесь сока черешни и вишни в гранатовом соке. Пара праймеров UDAp-404 способна выявлять нарушения, связанные с внесением доли абрикосового сока в сок персика.
Список литературы:
1. ГОСТ Р 53137-2008 «Соки и соковая продукция. Идентификация. Общие положения» // М.: Госстандарт России, 2008.
2. Российский рынок соков 2013 — «Противоречия и прогнозы»: аналит. обзор, май 2013, Euroresearch & Consulting. [Электронный ресурс] — Режим доступа. — URL: http: //er-cons.ru/shop/56/desc/rossijskij-rynok-sokov-protivorechija-i-prognozy (дата обращения 10.09.2013).
3. Самойлов А.В. Выявление фальсификации фруктовых соков молекулярно -генетическимим методами / А.В. Самойлов, Е.Ю. Колпаков, Н.В. Кирбаева // Сборник научных трудов 6-ой конференции молодых учёных отделения
хранения и переработки сельскохозяйственной продукции М.: Издательство РГАУ — МСХА, 2012. — С. 281—286.
4. Федеральный закон от 27 октября 2008 г. № 178-ФЗ «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей».
5. Berindean Ioana Virginia / PCR Protocol Optimization for Genetic Diversity Assessment and Molecular. Characterization of Sour Cherry Cultivars / Ioana Virginia Berindean, Eugen Cardei, Gabriela Roman Monicasturzeanu, Doru Pamful // Bulletin UASVM Horticulture. — 2012. — Vol. 69. — № 1. — P. 1843—5394.
6. Cipriani G. AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach (Prunus persica (L) Batsch): isolation, characterization and cross-species amplification in Prunus. / G. Cipriani G. W.-G. Lot, M. T. Huang, et all. // Theor. Appl. Genet.
— 1999. — № 99. — P. 65—72.
7. Hongxia Wang. Identification of the S-genotypes of several sweet cherry (Prunus avium L.) cultivars by AS-PCR and pollination / Wang Hongxia, Zhang KaiChun, Su Huairui and Naihaoye // African J. of Agricultural Research. 2010.
— Vol. 5. — № 3. — P. 250—256.
8. Messina R. New set of microsatellite loci isolated in apricot / R. Messina, O. Lain, M.T. Marrazzo, et all. // Mol. Ecol. Notes. — 2004. — Vol. 4. — № 3.
— P. 432—434.
9. Prunus. The Plant List. Version 1. 2010. Retrieved 29 November 2012.
10. Suggs S.V. Using purified genes, ICN-UCLA / S.V. Suggs, T. Hirose, D.H. Myake, M.J. Kawashima, et all. // Symp. Mol. Cell. Biol. — 1981. — Vol. 23. — P. 683—693.
11. Testolin R. Microsatellite DNA in peach (Prunus persica L. Batsch) and its use in fingerprinting and testing the genetic origin of cultivar / R. Testolin, T. Marrazzo, G. Cipriani, et all. // Genome — 2000. — Vol. 43. — № 3. — P. 512—520.
