CC BY
124
УДК 543.421/.424
А. П. Баюнов, С. Н. Смарыгин ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАДУИРОВОК В МЕТОДЕ БЛИЖНЕЙ ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Ключевые слова: ближнее ИК, комбикорма, модельные смеси.
Предложен подход для экспрессного количественного определения добавок аминокислот в кормах. Описан успешный модельный эксперимент по построению и оптимизации градуировок для определения аминокислоты в простых смесях. Данный подход в дальнейшем может помочь решить аналогичную задачу применительно к готовым кормам и представляет интерес для дальнейшего исследования. Проведение юстировки прибора по референтной линии привела к минимизации случайной составляющей погрешности.
Keywords: near infrared, mixed fodders, model mixtures.
An approach for expressive quantitative amino acid determination in mixed fodders using model calibration standards has been offered. Calibrations for amino acid determination in simple model mixtures have been successfully built and optimized. Further approach development could extremely help to simplify amino acid determination in finished fodders and is of great interest. Instrument alignment using a known sample spectrum to maintain wavelengths and spectrum intensity improves performance and extremely reduces random error part (almost twice for such a calibration).
Введение
Аминокислоты - важнейшие компоненты сельскохозяйственной продукции растительного и животного происхождения. Они играют ключевую роль в процессах формировании белков и пептидов, обмене веществ в организмах человека и сельскохозяйственных животных, биохимическом синтезе витаминов, гормонов, ферментов.
Большинство аминокислот синтезируется в организмах животных из не содержащих азота продуктов обмена веществ и усвояемого азота. Однако существует ряд незаменимых аминокислот, которые не могут синтезироваться в организме животных, и должны доставляться с пищей. Например, незаменимыми в кормлении птицы являются лизин, цистин и метионин, триптофан, треонин [1]. Для эффективного синтеза белка организм должен иметь все необходимые аминокислоты в нужных соотношениях и количестве. Недостаток хотя бы одной аминокислоты (лимитирующей) приводит к тому, что образования молекулы белка не происходит. Избыточные аминокислоты частично выводятся из организма животного, не принося никакой пользы, а, зачастую, наносят вред здоровью животных.
Рационы сельскохозяйственных животных должны содержать все необходимые организму аминокислоты, особенно незаменимые, т. к. отсутствие их в рационе приводит к нарушению обмена веществ, что в свою очередь, резко снижает продуктивность животных. Возникает необходимость контроля качества сырья для производителей комбикормов и предприятий, использующих продукцию комбикормовой промышленности. Как правило, в комбикормах наблюдается одновременный недостаток одних и избыток других аминокислот. Дефицит аминокислот в комбикорме устраняют добавлением до нормы недостающей аминокислоты путем введения премиксов. Определение содержания премиксов - актуальная задача как для производителей комбикормов, так и для руководителей крупных сельскохозяйственных предприятий по откорму животных и птицы.
В настоящее время для определения содержания аминокислот в комбикормах используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) [2] и капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) [3]. Экспрессное полуколичественное определения содержания аминокислот осуществляют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) [4]. Эти методы требуют многостадийной пробоподготовки, что приводит к увеличению длительности и
стоимости анализа, затратам дополнительных реактивов и ухудшает метрологические характеристики методов.
Фурье спектроскопия в ближнем инфракрасном (БИК) диапазоне в сочетании со статистическими методами обработки результатов - экспрессный метод анализа для широкого спектра объектов [5]. Главные достоинства этого метода - простота, быстрота, минимальная пробоподготовка, возможность проведения недеструктивного анализа, отсутствие потребности в дополнительных реактивах и высокой квалификации оператора. Применение интегрирующей сферы и диффузное отражение позволяют улучшить метрологические характеристики метода. Данный метод находит широкое применение в агропромышленном комплексе, пищевой и нефтяной промышленности, фармацевтике [6]. Известны случаи применения ИК спектроскопии для анализа аминокислот в зерне сельскохозяйственных культур [7] и комбикормах [8]. Однако, для построения градуировок по содержанию аминокислот, как в случае связанных аминокислот, так и в случае кормовых добавок (премиксов), используют референтные данные, получаемые методами ВЭЖХ и КЗЭ, имеющими, как правило, невысокие показатели прецизионности, что приводит, в том числе, и к увеличению общей погрешности конечных градуировок [9]. При этом, как правило, требуется большое количество стандартных образцов. С другой стороны, премиксы -индивидуальные вещества (аминокислоты) искусственным образом добавляемые в продукт. Возникает потенциальная возможность построения градуировок, основанных на искусственных образцах с введением известных количеств аминокислот, упрощения способа получение референтных данных и снижения вклада случайной погрешности метода (влияние оказывает только погрешность взвешивания при составления градуировочных стандартов). Цель данной работы - оценка возможности построения градуировок для определения аминокислот в модельных смесях с носителями, сходных по составу с комбикормами, и оценка их метрологических характеристик.
Экспериментальная часть
Измерение спектров диффузного отражения в диапазоне 4000-10000 см-1 проводили на ИК Фурье-спектрометре для ближней и средней области Spectrum 400 (Perkin Elmer, США) с интегрирующей сферой (NIRA). Обработку спектров и расчет результатов проводили с помощью программного обеспечения Spectrum и Quant+ (Perkin Elmer). Модельные смеси составляли из DL-метионина квалификации ч.д.а., пшеничной муки и оксида алюминия для хроматографии. Градуировки строили методом дробных наименьших квадратов (PLS1). Использовали 7 стандартных образцов с различным содержанием DL-метионина, измерения проводили в пятикратной повторности. Диапазон содержаний (массовая доля) определяемого вещества варьировал от 0 до 100%. Проверку градуировок проводили по 3-м образцам (5 повторностей для каждого). Оптимизацию входных параметров градуировок проводили вручную до достижения минимального числового значения усредненной разницы между средними полученными и заданными значениями. Для каждого из контрольных образцов рассчитывали дисперсию S2, стандартное отклонение S, относительное стандартное отклонение Sr, отклонение среднего рассчитанного от заданного Д. Далее рассчитывали те же характеристики для градуировок в целом. Однородность дисперсии проверяли с помощью критерия Кокрена. Полученные результаты проверяли на наличие систематических погрешностей с помощью t-критерия.
Обсуждение результатов
На первом этапе работы оценили применимость предлагаемого подхода с использованием простейшей модельной смеси, приготовленной из оксида алюминия и DL-метионина.
Использованный в качестве носителя негигроскопичный однородный оксид алюминия для хроматографии имеет гладкий малоинтенсивный спектр в ближнем инфракрасном диапазоне. Аминокислота DL-метионин дает в ближнем ИК-диапазоне интенсивный спектр (рис.1), пики которого соответствуют, главным образом, колебаниям связей C-H.
10000.0 8000 6000 4000.0
________________________________Волновое число, см1______________________________________
Рис. 1 - БИК-спектр диффузного отражения БЬ-метионина
Построенная для этой модельной смеси градуировка показана на рис. 2. Для оптимизации этой градуировки была осуществлена предобработка спектров путем коррекции по первой производной с шагом 5 точек и числом главных компонент, равным 5.
115.6
0.0 20 40 60 80 100 110.0
Заданное содержание, %
Рис. 2 - Градуировка для определения метионина в смесях с оксидом алюминия
Как видно из рис. 2, получена гладкая градуировка со стандартной ошибкой предсказания 2,65%. Результаты проверки этой градуировки при помощи контрольных образцов приведены в табл.1. В третьей колонке этой таблицы приведены числовые значения доверительного интервала для массовой доли БЬ-метионина в контрольной смеси, определенного при доверительной вероятности 0,95 и числе степеней свободы 4.
Для первого контрольного образца имеет место высокое относительное стандартное отклонение, а для второго контрольного образца - существенная систематическая погрешность.
Высокое относительное стандартное отклонение у образца №1 связано с тем, что при столь низкой концентрации определяемого вещества, оно может быть распределено неравномерно в самой пробе, и имеет место высокая случайная погрешность.
Существенное отклонение рассчитанного значения от заданного у образца №2 связано с формированием хемометрической модели. В процессе оптимизации, как отклонения рассчитанных от средних, так и относительные стандартные отклонения для одних и тех же образцов принимали различные значения в зависимости от входных параметров модели.
Таблица 1 - Результаты проверки градуировки для модельной смеси БЬ-метионин + Д!20э
№ контрольного образца Массовая доля DL-метионина в контрольном образце, % Отклонение среднего расчетного от действительного значения А, % Стандартное отклонение, S Относительное стандартное отклонение, Sr
действительное значение определено
1 1,3 0,9±0,8 0,5 0,54 0,58
2 19,0 22,1±1,3 3,1 0,96 0,04
3 29,0 30,0±2,6 1,0 1,84 0,06
Таблица 2 - Метрологические характеристики градуировки для модельной смеси БЬ-метионин + АІ2О3
Название метрологической характеристики Стандартная ошибка предсказания, SEP,% Относительное стандартное отклонение, Sr,% Отклонение среднего расчетного от действительного значения А, абс.%
Числовое значение 2,65 0,053 1,88
Поскольку метионин и оксид алюминия представляют собой однородные мелкодисперсные порошки с сопоставимыми размерами частиц, неоднородность пробы при среднем диапазоне концентраций не вносит существенного вклада в случайную составляющую погрешности результата (относительное стандартное отклонение составило 5,3%).
В качестве одной из возможных причин систематической погрешности можно рассматривать временной тренд показаний прибора. Для проверки этого предположения изучена зависимость показаний прибора от времени, прошедшего от начала измерений. Спектры для определения массовой доли DL-метионина начали снимать спустя 15 минут с момента включения прибора, который соответствует нулевой точке на оси абсцисс (рис. 3). По оси ординат на рис. 3 отложены результаты, полученные при обработке спектров, снятых при разной длительности работы прибора (действительное содержание DL-метионина составляло 10%). Из рис. 3 видно, что с увеличением времени работы прибора систематическая погрешность линейно увеличивается в соответствии с уравнением у = 9,27 - 0,08х, где у -определенная массовая доля аминокислоты в %; 9,27 - значение массовой доли
аминокислоты, соответствующее ординате точки пересечения прямой, аппроксимирующей зависимость числовых значений массовой доли от времени, прошедшего от начала снятия спектров; -0,08 временной тренд, %/мин; х - время, прошедшее с начала снятия спектров.
Для увеличения стабильности показаний прибора, а также для возможности перенесения результатов с одного прибора на другой можно использовать известные линии поглощения различных веществ в качестве референтных для юстировки прибора по их волновому числу и интенсивности [5]. Прибор Spectrum 400 оснащен ячейкой с метаном, и юстировка проводится по линии поглощения метана, данная функция здесь называется AVI. После юстировки значимый временной тренд не отмечался.
Рис. 3 - Результаты определения временного тренда прибора Spectrum 400
Как видно из рис. 3, у прибора наблюдается временной тренд с коэффициентом -0,08 абс.%/мин.
На следующем этапе работы были построены градуировки для смесей метионина с пшеничной мукой. Число градуировочных смесей и содержание в них аминокислоты те же, что и для стандартных смесей DL-метионин + AI2O3- Массовые доли метионина в контрольных образцах были изменены. Градировки построены как с юстировкой прибора (табл.3), так и без нее (табл.4). Характеристики градуировок представлены в табл.5.
Рис. 4 - Градуировка для определения метионина в смесях с пшеничной мукой (с юстировкой прибора по линии поглощения метана)
Таблица 3 - Результаты градуировки без юстировки прибора
№ контрольного образца Массовая доля DL-метионина в контрольном образце, % Отклонение среднего расчетного от действительного значения А, % Стандартное отклонение, S Относительное стандартное отклонение, Sr
действительное значение определено
1 1,06 1,40± 1,42 0,36 1,02 0,73
2 15,3 14,8±1,9 0,5 1,34 0,09
3 40,6 39,3±2,3 1,3 1,61 0,04
№ контрольного образца Массовая доля БЬ-метионина в контрольном образце, % Отклонение среднего расчетного от действительного значения А, % Стандартное отклонение, в Относительное стандартное отклонение, вг
действительное значение определено
1 1,04 1,06±0,8 0,02 0,56 0,53
2 15,0 16,2±1,1 1,2 0,78 0,05
3 34,4 35,1±1,0 0,7 0,73 0,02
Таблица 5 - Метрологические характеристики градуировок с юстировкой и без нее
Название метрологической характеристики Стандартная ошибка предсказания, БЕР,% Относительное стандартное отклонение, вг,% Отклонение среднего расчетного от действительного значения А, абс.%
Числовое значение « о и в о а к н с 2 с без юстировки « о и в о Л к н с 2 с без юстировки с юстировкой без юстировки
0,01 1,00 0,037 0,07 1,0 1,0
При расчете общей относительной дисперсии и общего относительного стандартного отклонения, данные характеристики в соответствии с тестом Кокрена для образцов с содержанием метионина 1% не были включены в расчет общих характеристик.
Юстировка прибора позволила снизить случайную составляющую погрешности почти в 2 раза (табл. 5), поэтому для решения аналитических задач при работе с ИК-спектрометрами в ближнем диапазоне следует проводить подобную юстировку.
Проверяли также влияние крайних точек (0 и 100% содержания метионина) на характеристики калибровки (табл.6). Исключение нулевой точки (образец без добавки аминокислоты), как и следовало ожидать, привело к дестабилизации модели и вызвало рост систематической погрешности. Исключение верхней точки, которой соответствовал образец, представляющий собой чистую аминокислоту, привело к незначительному улучшению характеристик градуировки. Одновременное устранение крайних точек также повлияло на характеристики незначительно. На этом основании можно сделать вывод, что: во-первых, присутствие в градуировке образца без добавки желательно; во-вторых, присутствие в градуировке образца чистой аминокислоты, по-видимому, из-за различия формы спектра чистой аминокислоты от формы спектра образцов, содержащих пшеничную муку, вносит небольшой вклад в дестабилизацию модели.
Название метрологической характеристики Стандартная ошибка предсказания, SEP,% Относительное стандартное отклонение, Sr,% Отклонение среднего расчетного от действительного значения А, абс.%
Числовое значение исключена точка 0% исключена точка 100% исключена точка 0% исключена точка 100% исключена точка 0% исключена точка 100%
0,12 0,16 4,1 3,9 2,44 0,9
Показатель воспроизводимости составил 3,7%, что существенно лучше, чем для капиллярного электрофореза, предложенного в качестве арбитражного метода (15-20%) [3].
Выводы
1. Установлена перспективность способа модельных смесей для получения градуировок при определения содержания аминокислот в кормах методом ближней инфракрасной спектроскопии.
2. Опробованы различные способы построения градуировок: с включением и
исключением крайних точек.
3. Доказана необходимость юстировки БИК-спектрометра для устранения временного тренда этого прибора при решении аналитических задач.
Литература
1. Зипер А.Ф. Растительные корма: производство и применение. М.:АСТ; Донецк: Сталкер, 2005. 219с.
2. Мельников И.О., Разработка микрометодов анализа аминокислот, коротких пептидов и олигонуклеотидов с использованием ОФ ВЭЖХ и капиллярного электрофореза. Автореф. дисс. канд. хим. наук.- М.: 2006 - 24 с.
3. ГОСТ Р 52347-2005. // Комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания аминокислот (лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана) методом капиллярного электрофореза.
4. Ю. А. Золотов, Е. Н. Дорохова, В. И. Фадеева и др. Под ред. Ю. А. Золотова Основы аналитической химии. Общие вопросы. Методы разделения. М.: Высш. шк. , 2000. 351 с.
5. Крищенко В.П. // Ближняя инфракрасная спектроскопия. М., 1997. С. 13, 237, 564.
6. P.C Williams, in Near infrared technology in the agricultural and food industries, Ed by P.C. Williams and K Norris. AACC, St Paul, MN p.143 (1987)
7. Gill A.A., Starr C and Smith D.B. Lysine and nitrogen measurement by infrared reflectance analysis as an aid to barley breeding // J. Agric. Sci. 1979., Vol. 93., P. 727-733
8. McGuire C.F. Quality evaluation of distiller’s grain by near-infrared analysis // Cereal Chem. 1986., Vol. 63, №2., P. 155-159.
9. Дворкин В.И. Метрология и обеспечение качества количественного химического анализа. М.: Химия, 2001. 263 с.
© А. П. Баюнов - асп. каф. неорганической и аналитической химии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, aleksande-bajunov@rambler.ru; С. Н. Смарыгин - д-р хим. наук, проф., зав. каф. неорганической и аналитической химии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева, smarygin@mail.ru.
