CC BY
2Л.М. Теплицкая, канд. биол. наук, доц., e-mail: lm_teplitskaya@ukr.net В.С. Ржевская, аспирант, e-mail: viktoriyar45@mail.ru
Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, г. Симферополь
УДК 632.937.1.05
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ЭМБИКО® И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЗЕМЛЯНИКИ
Разработана система последовательных приемов по подбору в короткие сроки эффективных микробиологических средств защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов. Из растений земляники садовой выделены и идентифицированы два штамма микроорганизма - Xanthomonas campestris и Xanthomonas arborikola, обладающие фитопатогенными свойствами. На примере микробиологического препарата Эмбико® показана эффективность предлагаемого подхода к подбору эффективных микробиологических средств защиты растений.
Ключевые слова: фитопатогенные микроорганизмы, культура in vitro, антагонистическая активность, микробиологический препарат Эмбико®.
L.M. Teplitskaya, Cand. Sc. Biology, Prof.
V.S. Rzhevskaya, P.G.
THE USE OF THE MICROBIOLOGICAL PREPARATION EMBIKO® AND PURE CULTURES OF LACTIC ACID BACTERIA TO INHIBIT BACTERIAL DISEASES OF STRAWBERRY
A system of sequential methods to select effective microbial plant protection products from pathogenic microorganisms in a short period of time is worked out. Two strains of microorganism -Xanthomonas campestris and Xanthomonas arborikola, that have phytopathogenic properties were identified and isolated from strawberry. On the example of microbiological preparation Embiko® demonstrated the efficacy of the proposed approach to the selection of effective microbial plant protection products.
Key words: phytopathogenic microorganisms, culture in vitro, antagonistic activity, microbiological preparation Embiko®.
Введение
Применение химических средств защиты растений имеет существенные недостатки, поскольку большинство синтетических препаратов накапливается в растениях, делая их неприемлемыми для использования, и в почве, нарушая стабильность экосистем [1, 8]. Есть также ряд заболеваний, при которых химические препараты малоэффективны [8]. Единственно правильным направлением в борьбе с бактериальными инфекциями является использование биопрепаратов, обеспечивающих обеззараживание почвы, растений и посадочного материала [1, 10, 11]. К тому же биологические средства защиты растений обладают специфичностью действия и не проявляют мутагенную активность, приводящую к появлению резистентных штаммов фитопатогенных микроорганизмов. В целом микробные препараты снижают химическую нагрузку на агроценоз, способствуя восстановлению нормальной структуры микробиоценоза почвы. Микроорганизмы-антагонисты, заселяя ризосферу растений, дают длительный положительный эффект, подавляя развитие фитопатогенов.
Перспективным направлением современной агробиотехнологии является использование биологических средств защиты растений на основе микроорганизмов и их метаболитов, которые проявляют фитозащитные и ростостимулирующие свойства, а также повышают устойчивость растений к вредителям, заболеваниям и стрессовым факторам [2]. В литературе встречаются данные о подавлении фитопатогеннов микромицетами, бациллами различных таксономических групп [3], азотофиксирующими бактериями [2] и микробными препаратами, созданными на их основе.
Выраженные антагонистические свойства молочнокислых бактерий позволяют использовать их для угнетения роста и развития кишечных условно-патогенных микроорганизмов, вследствие чего молочнокислые бактерии являются главной составляющей многих микробных препаратов, используемых для профилактики и борьбы с кишечными инфекциями [4]. Роль молочнокислых бактерий в подавлении микроорганизмов, вызывающих заболевания у растений, недооценена и мало изучена, поэтому исследования, направленные на создание эффективных микробных препаратов на основе молочнокислых бактерий для борьбы с фи-топатогенами, несомненно, актуальны.
Эффективность применяемых биологических средств защиты растений во многом зависит от их активности по отношению к конкретному возбудителю. При диагностике заболеваний сельскохозяйственных культур не всегда можно быстро и точно идентифицировать возбудителя по внешним симптомам, что, в свою очередь, не позволяет правильно подобрать средство защиты растений. В этих случаях выбор эффективного микробиологического препарата для подавления данных возбудителей заболеваний возможен только с помощью ряда последовательных биотехнологических приемов.
Цель работы - разработка системы последовательных приемов по подбору эффективных микробиологических препаратов защиты растений.
Объекты и методы исследований
Материалом исследования служили растения земляники (Fragaria ananassa) сорта Клери, пораженные бактериальной инфекцией.
В качестве биологического средства для борьбы с заболеванием использовали микробиологический препарат Эмбико® и отдельные штаммы молочнокислых бактерий, входящих в его состав. Данный препарат представляет собой жидкую культуру, включающую микроорганизмы и их метаболиты. Эмбико® - это консорциум следующих физиологических групп микроорганизмов: фототрофные аноксигенные пурпурные несерные бактерии, молочнокислые гомоферментативные стрептобактерии и стрептококки, дрожжи из рода Saccharomyces. Микроорганизмы, входящие в состав Эмбико®, имеют высокую естественную предрасположенность к росту и размножению в почве, ризосфере, ризоплане и эпифитной сфере растений, стимулируют рост и развитие растений, оказывают антистрессовый эффект [7]. Антагонистическая активность микробиологического препарата обусловлена метаболитами молочнокислых бактерий - антибиотическими веществами, органическими кислотами, спиртами.
Для выделения фитопатогенных микроорганизмов листья клубники очищали от внешних источников инфекции в растворе хозяйственного мыла в течение 2-5 мин, затем тщательно промывали водой, высушивали. Стерильным скальпелем вырезали участок поврежденной ткани и помещали его в каплю физиологического раствора. Листья измельчали с помощью стеклянной палочки и оставляли на 10 мин. Суспензию высевали на твердые неселективные питательные среды NA и Кинг В [5]. Определяли микроорганизмы по стандартным методам, используя определитель бактерий Берги [6].
Выделенные штаммы микроорганизмов исследовали на наличие факторов патогенно-сти: определяли способность мацерировать растительную ткань в культуре in vitro и вызывать ее некроз (реакция гиперчувствительности) [5]. Наличие или отсутствие мацерации определяли визуально и при прикосновении к дискам бактериологической петлей на 3-и сут. Для проведения реакции гиперчувствительности исследуемые бактериальные штаммы вводили с помощью стерильного шприца в поврежденный локально лист растений либо наносили пробы исследуемых фитопатогенов на многочисленные порезы, произведенные стерильным скальпелем. В качестве контроля использовали обработку стерильным физиологическим раствором.
Антагонистическую активность молочнокислых бактерий и микробиологического препарата Эмбико® изучали методом агаровых блоков, глубинным способом. 1 мл каждого штамма молочнокислых бактерий и препарата Эмбико® вносили в стерильную чашку Петри и смешивали с нагретой и вновь охлажденной до 45 °С средой MRS [5], тщательно размеши-
вали и инкубировали при 37 °С 24 ч. Суточные культуры фитопатогенных микроорганизмов вносили в чашки Петри смешивали с нагретой и вновь охлажденной до 45°С питательной средой Кинг В, тщательно размешивали. После застывания среды вырезали 4-6 лунок, в которые вставляли блоки MRS с глубинно выращенными молочнокислыми бактериями и Эм-бико®, вырезанные тем же пробочным сверлом. После внесения блоков в лунки чашки Петри выдерживали 5 ч при 5 °С для диффузии метаболитов микроорганизмов Эмбико® в агаровую пластинку. Затем чашки Петри инкубировали при температуре 22 °С 18-24 ч. На следующие сутки измеряли диаметр зоны задержки роста фитопатогенных микроорганизмов.
Эксперименты проводили в 3 биологических повторностях. Достоверность различий между вариантами оценивали по t-критерию Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Многообразие проявления патологических изменений растений, вызванное фитопато-генными микроорганизмами, привело к тому, что для точного определения болезни, кроме внешнего осмотра пораженного растения, необходимы дополнительные лабораторные исследования с целью точной идентификации возбудителя. Ситуация усложняется еще тем, что бактериозы могут быть вызваны не только отдельными инфекционными агентами, но и совместно несколькими возбудителями, поэтому для лабораторной диагностики используют методы культуры in vitro, которые заключаются в выделении возбудителя болезни в чистую культуру, изучении его культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков, проверке на наличие факторов патогенности. Проводимые одновременно биологические исследования включают искусственное заражение растений возбудителем с последующим сравнительным изучением симптомов поражения на растении-хозяине и растении-тесте, изучение факторов, которые способствуют или сдерживают развитие болезни. Повторное заражение растений выделенным возбудителем заболевания позволяет сравнить симптомы и убедиться в правильности выделенного источника заболевания. Идентификация микроорганизма, обладающего патогенными свойствами, позволяет подобрать эффективное средство защиты растений (рис. 1).
В приведенной схеме описана традиционная система последовательных действий, занимающая много времени, что в случае массового инфицирования растений может привести к гибели всей популяции. Предлагаемая система последовательных приемов с использованием данных антагонистической активности микробиологического препарата по отношению к возбудителю заболевания позволяет в короткие сроки и эффективно произвести подбор средства защиты растений (рис. 2).
Согласно предлагаемому подходу после выделения микроорганизмов и определения факторов патогенности одновременно проводят тест на гиперчувствительность и на антагонистическую активность различных микробиологических препаратов. Идентификация фито-патогенных микроорганизмов для подбора микробиологического средства защиты растений не обязательна. Это позволяет сократить сроки исследования, так как подбор средств защиты растений основан не на идентификации микроорганизма, а на определении зон подавления фитопатогена микробиологическими препаратами.
Такой подход позволяет сократить сроки исследований и подобрать микробиологический препарат (а не химическое средство!), эффективность которого по отношению к выделенным фитопатогенным микроорганизмам подтверждена лабораторными исследованиями. Таким образом, перед внесением микробиологического препарата в популяцию пораженных растений уже заранее определена его эффективность.
Эффективность предлагаемого подхода показана на примере микробиологического препарата Эмбико® и земляники садовой. Земляника имела поражения на листьях в виде некрозов, характерных для бактериозов. Выявления симптомов бактериоза путем внешнего осмотра оказалось недостаточно для установления возбудителя заболевания, поэтому была применена дополнительная лабораторная диагностика с использованием методов культуры in vitro.
Рис. 1. Традиционный подход к подбору средств защиты растений
Выделение возбудителя из пораженной ткани
Проверка выделенных
микроорганизмов на наличие факторов патогенности
Повторное заражение растения с целью получения характерных симптомов заболевания
Подбор микробиологических препаратов методом изучения антагонистической активности по отношению к выделенным фитопатогенам
Рис. 2. Разработанный подход к быстрому подбору микробиологических средств защиты растений
В процессе исследований из пораженной ткани было выделено 2 штамма микроорганизмов: Xanthomonas campestris и Xanthomonas агЪопко1а. X. campestris образует круглые гладкие однородные с выпуклым профилем колонии желтого цвета, тягучей консистенции. При микроскопировании были выявлены бактерии шаровидной формы. X. arЪorikola имел круглые гладкие однородные с выпуклым профилем нетягучие колонии грязно-белого цвета. При микроскопировани препаратов обнаружены короткие палочки.
Изучение способности выделенных микроорганизмов мацерировать растительную ткань (проводили на клубнях картофеля) показало, что X. campestris вызывал мацерацию тканей на 2-е сут, а штамм X. arЪorikola - на 3-е сут после нанесения. Диски из листьев, обработанные двумя штаммами выделенных микроорганизмов одновременно, были мацериро-ваны на 2-е сут. Проведение реакции гиперчувствительности показало почернение участка листовой пластинки на месте введения бактериальной суспензии в течение 3 -х сут после инокуляции. При введении фитопатогенов через многочисленные порезы растение погибало на 3-5-е сут.
Результаты изучения антагонистической активности молочнокислых бактерий и микробиологического препарата Эмбико® по отношению к выделенным фитопатогенам представлены в таблице. Штамм Ь. сasei образовывал зоны подавления роста X. сampestris и
X. агЬопЫа по отдельности 26,6±1,0 и 26,6±1,1 мм соответственно, при совместном культивировании штаммов зона подавления роста снизилась до 24,6±1,1 мм. Аналогичные результаты наблюдались при исследовании антагонистической активности штаммов L. plantarum и L. lactis, а также микробиологического препарата Эмбико®. Таким образом, антагонистическая активность как отдельных штаммов молочнокислых бактерий, так и микробиологического препарата выше к фитопатогенному микроорганизму в отдельности, а не при совместном действии нескольких штаммов.
При сравнении антагонистической активности штаммов молочнокислых бактерий в виде монокультур и их консорциума в виде микробиологического препарата было выявлено, что зоны подавления монокультур составили 24,6-29,6 мм, а препарата - 32,8-35,3 мм. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий в виде консорциума бактерий превышает таковую у монокультур, так как в препарате молочнокислые бактерии проявляют синергизм. Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что микробиологический препарат Эмбико® обладает высокой антагонистической активностью по отношению к выделенным возбудителям заболевания у земляники.
Таблица
Антагонистическая активность монокультур молочнокислых бактерий и микробиологического препарата Эмбико® по отношению
к Xanthomonas campestris и Xanthomonas arborikola
Штаммы фитопатогенов Штаммы молочнокислых бактерий и микробиологический препарат Диаметр зоны задержки роста, мм
Xanthomonas campestris L. casei 26,6±1,0
L. plantarum 27,3±1,2
L. lactis 28,6±0,9
препарат Эмбико® 34,8±1,2
Xanthomonas arborikola L. casei 26,6±1,1
L. plantarum 26,9±1,3
L. lactis 29,6±1,2
препарат Эмбико® 35,3±1,0
Xanthomonas campestris + Xanthomonas arborikola L. casei 24,6±1,1
L. plantarum 25,3±1,0
L. lactis 27,6±0,9
препарат Эмбико® 32,8±1,2
В настоящее время микробиологические препараты разрабатывают на основе разных групп микроорганизмов и с различным количеством штаммов, входящим в их состав. Наиболее перспективными являются многокомпонентные препараты в сравнении с монокультурными, так как микроорганизмы, входящие в состав препарата, обладают различной антагонистической активностью по отношению к различным фитопатогенам, а также проявляют синергизм. Подбор микробиологических препаратов по предлагаемой схеме позволяет в короткие сроки подобрать эффективное средство для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами, вызвавшими заболевание в каждом конкретном случае.
Выводы
1. Из растений земляники, пораженной бактериозом, выделены и идентифицированы два штамма микроорганизма - Xanthomonas campestris и Xanthomonas arborikola, обладающие фитопатогенными свойствами.
2. Проведено сравнение антагонистической активности отдельных штаммов молочнокислых бактерий и микробиологического препарата Эмбико® по отношению к Xanthomonas campestris и Xanthomonas arborikola.
3. Разработана система последовательных приемов по подбору эффективных микробиологических средств защиты растений, позволяющая в короткие сроки подавлять возбудителя заболевания.
Библиография
1. Чернюк Б.В., Омельчук С.О., Красинько В.О. Антагонютичш властивост Aspergillus sp. 262 по вщношенню до ф^опатогенних грибiв роду Fusarium // Мшробш бютехнологп: актуальшсть i
майбутне. - Radostim-2012: Материалы междунар. науч.-практ. конф. (Кшв, 19-22 листопада 2012 р.). - Кшв, 2012.-С. 345-346.
2. Иутинская Г.А., Титова Л.В., Белявская Л.А. Основные направления создания микробных препаратов для биологического контроля численности фитопатогенов и фитогельминтов // Мшробш бютехнологп: актуальшсть i майбутне. - Radostim-2012 : Материалы междунар. науч.-практ. конф. (Кшв, 19-22 листопада 2012 р.). - Кшв, 2012,- С. 127-128.
3. Актуганов Г.Э., Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф. Особенности антагонистического взаимодействия различных таксономических групп бацилл с почвенными грибами // Материалы конф. «Микроорганизмы и биосфера», (Москва, 19-20 ноября 2007). - М., 2007. - С. 3-4.
4. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. -
390 с.
5. Желдакова Р.А., Мямин В.Е. Фитопатогенные микроорганизмы: учеб.-метод. комплекс. -Минск: Изд-во БГУ, 2006. - С. 116.
6. Краткий определитель бактерий Берги / под ред. Дж. Хоута. - М.: Мир, 1980. - 496 с.
7. Ржевская В.С. Применение молочнокислых бактерий для стимуляции прорастаний семян огурца // Тез. докл. всерос. науч. конф. с междунар. участием «Инновационные направления современной физиологии растений», Москва, Россия, 2-6 июня 2013 г. - М., 2013. - С. 84.
8. 1)е Weger L.A. Van der Bij A.J., Dekkers L.C. et al. Colonization of the rhizosphere of crop plants by plant-beneficial pseudomonads // FEMS Microbiol. Ecol. - 1995. - N 17. - P. 221-228.
9. Gerhardson B. Biological substitutes for pesticides // Trends Biotechnol. - 2002. - N 20. -P.338-343.
10. Postma J., Montanari M., Van den Boogert P.H. et al. Microbial enrichment to enhance the disease suppressive activity of compost // J. Soil Biol. - 2003. - N 39. - P. 157-163.
11. Welbaum G.A., Sturz V, Dong Z. Fertilizing soil microorganisms to improve productivity of agroecosystems // Crit. Rev. Plant Sci. - 2004. - N 23. - P. 175-193.
Bibliography
1. Chernyuk B.V., Omelchuk E.O., Krasynko V.O. Antagonistic properties of Aspergillus sp. 262 in relation to Fusarium pathogenic fungi // Microbial Biotechnology: current and future. - Radostim-2012: Materials of Int. Scientific Pract. Conf. (Kyiv, November 19-22, 2012). - Kyiv, 2012. - P. 345-346.
2. Iutinskaya G.A., Titova L.V., Belyavskaya L.A. et al. The main directions of the microbial agents development for biological control of phytopathogens and phytohelminths // Microbial Biotechnology: current and future. - Radostim-2012: Materials of Int. Scientific Pract. Conf. (Kyiv, November 19-22, 2012). -Kyiv, 2012.-P. 127-128.
3. Aktuganov G.E., Melentiev A.I., Galimzyanova N.F. Features of the antagonistic interaction between different taxonomic groups of bacilli with soil fungi // Proceedings of the conference «Microorganisms and the Biosphere» (Moscow, November 19-20, 2007). - M., 2007. - P. 3-4.
4. Kvasnikov E.I. Lactic acid bacteria and how their use. - M.: Nauka, 1975. - 390 p.
5. Zheldakova R.A., Myamin V.E. Phytopathogenic microorganisms: training materials. - Minsk: BSU, 2006.-P. 116.
6. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology/ Ed. by J. Holt. - M.: Mir, 1980. - 496 p.
7. Rzhevskaya V.S. The use of lactic acid bacteria to stimulate cucumber seeds germination // Abstracts of the Russian scientific conference with international participation «Innovative directions of modern plant physiology», Moscow, Russia, June 2-6, 2013. - M., 2013. - P. 84.
8. De Weger L.A., Van der Bij A. J., Dekkers L. C. et al. Colonization of the rhizosphere of crop plants by plant-beneficial pseudomonads // FEMS Microbiol. Ecol. - 1995. - N 17. - P. 221-228.
9. Gerhardson B. Biological substitutes for pesticides // Trends Biotechnol. - 2002. - N 20. -P.338-343.
10. Postma J., Montanari M., Van den Boogert P.H. et al. Microbial enrichment to enhance the disease suppressive activity of compost // J. Soil Biol. - 2003. - N 39. - P. 157-163.
11. Welbaum G.A., Sturz V, Dong Z. et al. Fertilizing soil microorganisms to improve productivity of agroecosystems // Crit. Rev. Plant Sci. - 2004. - N 23. - P. 175-193.
