ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ВЭЖХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ВАЛЕРИАНЫ И СИНЮХИ В СИРОПЕ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Ю. А. Шерякова, О. М. Хишова

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ВЭЖХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ВАЛЕРИАНЫ И СИНЮХИ В СИРОПЕ

Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

Для идентификации и количественного определения суммы сесквитерпеновых кислот и тритерпеновых сапонинов в пересчете на Р-эсцин в сиропе, содержащем экстракты валерианы и синюхи (в соотношении 1:1), а также вспомогательные вещества (калия сорбат, аскорбиновая кислота, масло мяты, сироп сахарный 64%) использована ранее разработанная нами методика для таблеток и капсул на основе тонко измельченных порошков валерианы и синюхи с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Проведена валидация предлагаемой методики по таким характеристикам, как специфичность, линейность и диапазон применения, правильность, сходимость,что позволяет использовать ее для идентификации и количественного определения биологически активных веществ (БАВ) валерианы и синюхи в сиропе.

Ключевые слова: корневища с корнями валерианы, корневища с корнями синюхи, количественное определение, сесквитерпеновые кислоты, тритерпеновые сапонины, Р-эсцин, ВЭЖХ, сироп.

ВВЕДЕНИЕ

Сироп является распространенной лекарственной формой, особенно широко применяется в педиатрической и герон-тологической практике. Сироп на основе синюхи и валерианы является комбинированным седативным лекарственным средством (ЛС) [1, 2].

В последние годы при стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) все чаще используют инструментальные методы анализа. Принципы стандартизации ЛС на основе ЛРС ничем не отличаются от стандартизации ЛС иного происхождения. Одним из наиболее широко используемых в настоящее время является метод ВЭЖХ, который может использоваться как для идентификации, так и для количественного определения активных веществ.

В связи с вышеуказанным при разработке ЛС в форме сиропа, содержащего экстракты валерианы (валереновая и ацетоксивалереновая кислоты) и синюхи (тритерпеновые сапонины в пересчете на Р-эсцин), нами в качестве основного был выбран метод ВЭЖХ, позволяющий определять активные вещества валерианы и синюхи в малых количествах [3, 4].

Целью исследования явилось под-

тверждение возможности использования ранее разработанной методики определения биологически активных веществ валерианы и синюхи в таблетках и капсулах при совместном их присутствии с помощью метода ВЭЖХ в сиропе на основе сухих экстрактов валерианы и синюхи

[3, 4].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для анализа в качестве стандартного образца использовали фармакопейный стандартный образец (ФСО) сухого экстракта валерианы стандартизированного, ФСО Р-эсцина, реактивы - спирт этиловый 96% Р, вода Р, кислота фосфорная Р, плацебо для сиропа (сахарный сироп 64%, аскорбиновая кислота, калия сорбат, масло мяты).

Объектом исследования был сироп, содержащий экстракты валерианы и синюхи (в соотношении 1:1).

Для идентификации и количественного определения БАВ валерианы и синюхи в сиропе использовали ранее разработанную методику ВЭЖХ для лекарственного растительного сырья валерианы и синюхи и их комбинированных таблеток. Исследования проводили на приборе Agilent 1200 с диодно-матричным детектором [3, 4].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методики определения суммы сескви-терпеновых кислот (ацетоксивалереновой и валереновой) в пересчете на валерено-вую кислоту экстракта валерианы и суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на

Р-эсцин экстракта синюхи в сиропе методом ВЭЖХ изложены в таблице 1.

Для доказательства пригодности разработанной методики для подтверждения подлинности и определения количественного содержания БАВ валерианы и синюхи в сиропе была проведена ее валидация по

Таблица 1 - Методики определения БАВ валерианы и синюхи в сиропе

Валериана Синюха

Требования по количественно -му содержанию Не менее 0,1% суммы сесквитерпено-вых кислот (ацетоксивалереновой и валереновой) в пересчете на валере-новую кислоту в 100 г сиропа. Не менее 8,0 % суммы тритер-пеновых сапонинов в пересчете на Р-эсцин в 100 г сиропа.

Приготовление испытуемого раствора: 1,000 г сиропа помещали в мерную колбу вместимостью 50,0 мл, доводили этиловым спиртом 96% до метки и тщательно перемешивали. Необходимое количество полученного раствора фильтровали через мембранный фильтр типа «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм.

Приготовление раствора стандартного образца: 0,1180 г ФСО сухого экстракта валерианы помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, добавляли 50 мл этилового спирта 96%, выдерживали около 20 мин на ультразвуковой бане, охлаждали полученный раствор до комнатной температуры и доводили объем раствора этиловым спиртом 96% до метки и перемешивали. Необходимое количество полученного раствора фильтровали через мембранный фильтр типа «Милли-пор» с диаметром пор 0,45 мкм. 0,0500 г ФСО Р-эсцина помещали в мерную колбу вместимостью 25,0 мл, добавляли 15 мл этилового спирта 96 %, выдерживали около 30 минут на ультразвуковой бане, охлаждали полученный раствор до комнатной температуры, доводили объем раствора этиловым спиртом96 % до метки и перемешивали. Необходимое количество полученного раствора фильтровали через мембранный фильтр типа «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм.

Условия хроматографи -рования По 20 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца попеременно хроматографирова-ли на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором, получая не менее 3 хро-матограмм для каждого из растворов, в следующих условиях: - колонка размером 250*4,6 мм типа Zorbax SB-Cl8, заполненная силикагелем октадецилсилиль-ным для хроматографии Р, с размером частиц 5,0 мкм или аналогичная; - скорость подвижной фазы - 0,63 мл/мин; - детектирование при длине волны 220 нм; - температура хроматографиче-ской колонки - 30°С; - длительность хроматографиро-вания - 22 мин. Состав подвижной фазы меняется во времени: По 10 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца попеременно хроматографирова-ли на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором, получая не менее 3 хро-матограмм для каждого из растворов, в следующих условиях: - колонка размером 250*4,6 мм типа Zorbax SB-Cl8, заполненная силикагелем октадецилсилиль-ным для хроматографии Р, с размером частиц 5,0 мкм или аналогичная; - скорость подвижной фазы - 0,5 мл/мин; - детектирование при длине волны 210 нм; - температура хроматографиче-ской колонки - 30°С; - длительность хроматографиро-вания - 35 минут. Состав подвижной фазы меняется во времени:

Продолжение таблица 1.

Время, мин Буферный раствор рН 3,5 (%) Ацетонитрил Р (%) Время, мин Буферный раствор рН 3,5 (%) Ацетонитрил Р (%)

0-5 53 47 0-30 95 5

5-18 53^32 47^68 30-32 95^40 5^60

18-22 32 68 32-35 40^95 60^5

Формула расчета - С1 где X - содержание суммы сесквитерпеновых кислот (ацетоксивале-реновой и валереновой) в пересчете на валереновую кислоту или содержание суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на Р-эсцин, мг/100 г сиропа; S1 - сумма площадей пиков ацетоксивалереновой и валереновой кислот или тритерпеновых сапонинов в испытуемом растворе; S0 - сумма площадей пиков ацетоксивалереновой и валереновой кислот или тритерпеновых сапонинов в стандартном растворе; С1 - концентрация испытуемого раствора, мг/мл; С0 - концентрация ФСО сухого экстракта валерианы или ФСО Р-эсцина в стандартном растворе, мг/мл; Р - содержание валереновой кислоты или Р-эсцина в стандартном образце, %.

Пригодность хроматографи -ческой системы Хроматографическая система считается пригодной, если на хроматограм-мах раствора стандартного образца: - разрешение между пиками ацеток-сивалереновой и валереновой кислот - не менее 15; - число теоретических тарелок - не менее 4000 для пиков ацетоксивале-реновой кислоты и не менее 15 000 для пиков валереновой кислоты; - фактор асимметрии, рассчитанный по пикам ацетоксивалереновой и ва-лереновой кислот, не менее 0,8 и не более 1,5. Хроматографическая система считается пригодной, если на хроматограммах раствора стандартного образца: - фактор асимметрии, рассчитанный по пикам тритерпено-вых сапонинов, должен быть не менее 0,8 и не более 1,5; - относительное стандартное отклонение площадей пиков, рассчитанное по сумме пиков тритерпеновых сапонинов, должно быть не более 2,0%.

параметрам специфичность, линейность и диапазон применения, правильность.

Валидация методики. Для подтверждения отсутствия влияния плацебо сиропа (вспомогательных веществ) на определение БАВ валерианы и синюхи была подтверждена специфичность методики [5-7]. В 6 повторениях анализировали раствор готового ЛС (испытуемый раствор) и раствор плацебо, содержащий все компоненты ЛС, за исключением сухих экстрактов валерианы и синюхи. Критерий приемлемости: на хроматограмме раствора плацебо не должно быть пиков, совпадающих по временам выхода с пиками валереновой и ацетоксивалереновой кислот и с пиками эсцин 1а и 1Ь, изоэсцин 1а и 1Ь.

Для определения специфичности методики были приготовлены следующие растворы модельных смесей:

- плацебо: калия сорбат, аскорбиновая кислота, масло мяты, сироп сахарный 64%) (рисунки 1, 2);

- раствор ФСО сухого экстракта валерианы стандартизированного (стандартный образец) и раствор ФСО Р-эсцина (стандартный образец) готовили в соответствии с методикой, описанной выше (рисунки 3, 4)

- раствор для проверки специфичности: смешивали 5,00 мл раствора стандартного образца и 5,00 мл раствора плацебо (рисунки 5, 6);

- растворитель (этанол) (рисунок 7).

ми •со ТОО (00400 «ос 1

300 200-(00 V

» * 30

Рисунок 1 - Хроматограмма раствора плацебо для валерианы

1

Рисунок 2 - Хроматограмма раствора плацебо для синюхи

Рисунок 3

- Хроматограмма раствора ФСО сухого экстракта валерианы стандартизированного

Рисунок 4 - Хроматограмма раствора ФСО Р-эсцина

Рисунок 5 - Хроматограмма раствора для проверки специфичности методики

определения БАВ валерианы

Рисунок 6 - Хроматограмма раствора для проверки специфичности методики

определения БАВ синюхи

Рисунок 7 - Хроматограмма растворителя (этанол)

Изучение линейности в диапазоне применения методики осуществляли на шести модельных растворах лекарственной формы, которые готовили с учетом номинальной концентрации ФСО сухого экстракта валерианы стандартизированного и ФСО Р-эсцина (в диапазоне от 80%до 120%). Каждый раствор хроматографи-ровали трижды по методикам, представ-

ленным выше. Критерий приемлемости: коэффициент корреляции должен быть не менее 0,99. Полученные результаты обрабатывали методом наименьших квадратов для прямой у. = Ьх1 +а. Результаты представлены в таблицах 2, 3.

Построение градуировочных графиков проводили в нормализованных координатах (рисунки 8, 9) [1].

Рисунок 8 - График зависимости площади пика от концентрации ФСО сухого экстракта

валерианы стандартизированного

На основании полученных результатов (таблицы 2, 3) можно утверждать о соблюдении линейности в диапазоне применения методики (80-120%).

Определение правильности аналитической методики проводили на растворах пяти модельных смесей на всем диапазоне применения, для каждой из которой далее

готовили по 3 испытуемых раствора. Полученные растворы хроматографировали в соответствии с методикой, описанной в таблице 1. Количественное содержание се-сквитерпеновых кислот и тритерпеновых сапонинов в пересчете на Р-эсцин устанавливали как среднее из результатов анализа пятнадцати определений (п=15) для каж-

дого из соединений. Данные обрабатывали ми по ГФ РБ [5]. Полученные результаты статистически и сравнивали с критерия- представлены в таблицах 4, 5.

Рисунок 9 - График зависимости площади пика от концентрации ФСО Р-эсцина Таблица 2 - Характеристики линейной зависимости у. = Ьх1 +а для валерианы

С xS а ср 6337,55 9249,30 12170,79 15730,82 18965,22

И хС ср а 62453,68

1С 7,01

И ср 43051,75

С2 а 1,105211 1,504321 1,964828 2,486735 3,070044

1С2 а 10,131139

S2 ср 36341070,8 56869190,7 75389936,3 99511502,0 117157770,9

ср 385269470,76

(^Са)2 49,120664

1853453120,66

Таблица 3 - Характеристики линейной зависимости у. = Ьх. +а для синюхи

С xS а ср 6337,55 9249,30 12170,79 15730,82 18965,22

И хС ср а 62453,68

1С 7,01

И ср 43051,75

С2 а 1,105211 1,504321 1,964828 2,486735 3,070044

1С2 а 10,131139

S2 ср 36341070,8 56869190,7 75389936,3 99511502,0 117157770,9

И2 ср 385269470,76

(^С)2 49,120664

1853453120,66

Таблица 4 - Результаты анализа модельных растворов и их статистической обработки для валерианы

№ модельной смеси Исходная концентрация, мг/мл Полученная концентрация (среднее значение 3-х определений), мг/мл Найдено, % Относительная погрешность ег Стандартное отклонение 8 Относительное стандартное отклонение 8г Табличный критерий Стьюдента 1(0,95;2) Расчетный критерий Стьюдента ^(0,95 ;2) Метрологиче ские характеристики

1 0,0081 0,0080 98,9 1,06 0,00007 0,90 4,30 1,69 Соотв. х= 100,12 8 = 1,3554 8х = 0,6061 КЖ)= 1,35% Ах = 1,56 8= 1,6%

2 0,0089 0,0091 101,5 1,49 0,0001 0,68 4,30 3,07 Соотв.

3 0,0101 0,0102 100,2 0,24 0,0000 0,20 4,30 1,72 Соотв.

4 0,0114 0,0112 98,6 1,37 0,0001 0,67 4,30 2,94 Соотв.

5 0,0122 0,0123 101,4 1,43 0,0001 0,90 4,30 2,20 Соотв.

Таблица 5 - Результаты анализа модельных раство

зов и их статистической обработки для синюхи

№ модельной смеси Исходная концентрация, мг/мл Полученная концентрация (среднее значение 3-х определений), мг/мл Найдено, % Относительная погрешность ег Стандартное отклонение 8 Относительное стандартное отклонение 8г Табличный критерий Стьюдента 1(0,95;2) Расчетный критерий Стьюдента! ^(0,95 ;2) Метрологические характеристики

1 1,1377 1,0935 96,1 3,88 0,02516 2,30 4,30 2,48 Соотв. х = 97,68 8 = 2,1626 8х = 0,9671 КЖ)= 2,21% Ах = 2,48 8 = 2,5%

2 1,3273 1,3463 101,4 1,43 0,0119 0,88 4,30 2,25 Соотв.

3 1,5170 1,4807 97,6 2,39 0,0133 0,90 4,30 3,86 Соотв.

4 1,7066 1,6560 97,0 2,96 0,0282 1,70 4,30 2,54 Соотв.

5 1,8962 1,8266 96,3 3,67 0,0251 1,38 4,30 3,91 Соотв.

Идентификация БАВ валерианы и синюхи. Идентификация сухих экстрактов валерианы и синюхи осуществлялась при количественном определении БАВ по временам удерживания. Времена удерживания пиков валереновой и ацетоксивале-реновой кислот на хроматограммах испытуемого раствора соответствуют временам удерживания пиков валереновой и ацеток-сивалереновой кислот на хроматограммах раствора сравнения (рисунок 10) [8]. Времена выхода эсцина 1а и 1Ь, изоэсцина 1а и 1Ь соответствуют литературным данным

(рисунок 11) [9].

Для подтверждения сходимости методики испытания было последовательно проанализировано одним химиком в один и тот же день на одном и том же оборудовании пять образцов одной серии ЛС.

Метрологические результаты количественного определения сесквитерпено-вых кислот экстракта валерианы и три-терпеновых сапонинов в пересчете на Р-эсцин экстракта синюхи в сиропе с помощью описанной методики представлены в таблице 6.

Рисунок 11 - Хроматограмма испытуемого раствора для синюхи

Рисунок 10 - Хроматограмма испытуемого раствора для валерианы

Таблица 6 - Метрологические результаты количественного определения сесквитерпеновых кислот экстракта валерианы и тритерпеновых сапонинов в пересчете _на в-эсцин экстракта синюхи в сиропе_

БАВ в ЛРС Найдено в ЛФ, мг/100 г сиропа Метрологические характеристики

Сесквитерпеновые кислоты валерианы 0,111 0,112 0,111 0,110 0,110 x = 0,111 S = 0,000837 Sx = 0,000374 RSD= 0,76% АХ = 0,001 s = 0,90%

Тритерпеновые сапонины синюхи 8,36 8,44 8,42 8,30 8,35 Х = 8,37 S = 0,295 Sx = 0,132 RSD= 3,5% Ax = 0,34 s = 4,05%

ВЫВОДЫ

1. Подтверждена возможность использования ранее разработанной методики определения БАВ валерианы и синюхи в таблетках и капсулах для идентификации и количественного их определения в сиропе в присутствии вспомогательных веществ (калия сор-бат, аскорбиновая кислота, масло мяты, сироп сахарный 64%) с помощью метода ВЭЖХ. Проведена валидация методики.

2. Доказана специфичность методики по отношению к сиропу.

3. Данная методика использована для составления спецификации по контролю качества сиропа на основе экстрактов валерианы и синюхи (RSD<1,1%^ RSD<3,5% соответственно).

SUMMARY

Y. A. Sheryakova, O. M. Khishova HPLC IDENTIFICATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES

OF POLEMONIUM CAERULEUM AND

VALERIANA OFFICINALIS IN SYRUP The object of the study was sugar syrup 64%, containing dry extracts of Polemonium caeruleum and Valeriana officinalis in 1:1 ratio, and excipients (potassium sorbate, ascorbic acid, peppermint oil).

For identification and quantitative determination of sesquiterpene acids and triterpene saponins in terms of P-escin the previously developed HPLC technique for tablets and capsules has been used.

This method was validated for the parameters like specificity, linearity and range of application, accuracy, convergence, which

allows to use it for identification and quantitative determination of biologically active substances of Polemonium caeruleum and Valeriana officinalis in syrup.

Keywords: rhizomata cum radicibus Valeriana officinalis, rhizomata cum radicibus Polemonium caeruleum, quantitative determination, sesquiterpene acids, triterpenoid saponins, P-estsin, HPLC, syrup.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шерякова, Ю. А. Сиропы как лекарственная форма на фармацевтическом рынке Республики Беларусь / Ю. А. Шерякова, О. М. Хишова // Вестник фармации.

- 2014. - №1 (63). - С. 44-50.

2. Шерякова, Ю. А. Идентификация и количественное определение суммы сескви-терпеновых кислот корневищ с корнями валерианы в лекарственных средствах методом ВЭЖХ / Ю. А. Шерякова, О. М. Хишова // Рецепт. - 2015. - №1 (99). - С. 94-103.

3. Шерякова, Ю. А. Идентификация и количественное определение тритерпено-вых сапонинов синюхи методом ВЭЖХ / Ю. А. Шерякова, О. М. Хишова // Вестник фармации. - 2015. - №1 (67). - С. 69-77.

4. Государственная фармакопея Республики Беларусь: в 3-х т. / под общ. ред. А. А. Шерякова. - Молодечно: Победа. - 2012. -Т. 1 (II): Общие методы контроля качества лекарственных средств. - С. 895-908.

5. Производство лекарственных средств. Валидация методик испытаний: ТКП 432-2012 (02041) - Введ. 01.03.2013.

- Минск: Департамент фармацевтической промышленности Министерства здравоохранения Республики Беларусь, 2012. - 18 с.

6. Производство лекарственных средств. Применение статистических методов валидации: ТКП 438 - 2012 (02041) - Введ. 01.03.2013. - Минск: Департамент фармацевтической промышленности Министерства здравоохранения Республики Беларусь, 2012. - 27 с.

7. Государственная фармакопея Республики Беларусь: в 3-х т. / под общ. ред. А. А. Шерякова. - Молодечно: Победа. -2008. - Т. 3: Контроль качества фармацевтических субстанций. - С. 699 - 701.

Адрес для корреспонденции:

210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра промышленной технологии с курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8 (0212) 37-00-13, ysheryakova@mail.ru, Хишова О. М.

Поступила 31.07.2015 г.

С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач, В. И. Фадеев КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОВИАРГОЛА В СУППОЗИТОРИЯХ Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

В статье представлены результаты разработки и валидации методики рода-нометрического определения повиаргола в суппозиториях.

Выбрана среда растворения и способ интенсификации процесса, установлен срок годности титранта и рабочего раствора.

Разработанная методика валидирована по показателям: избирательность, линейность (коэффициент корреляции в уравнении линейной регрессии составляет 0,9998, отклонения найденных концентраций от теоретически рассчитанного содержания не превышают 0,67%), повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (относительное стандартное отклонение для одного аналитика составляет 0,895%, для второго — 0,901%, а для двух испытаний, проведенных в разные дни — 0,908%), правильность (правильность определения повиаргола в суппозиториях находилась в диапазоне 99,37—101,30%; среднее значение составило 100,21%). Установлен диапазон применения методики, который составляет 70—130% от номинального содержания повиаргола в суппозитории.

Ключевые слова: суппозитории, наночастицы серебра, повиаргол, титрование, валидация.

ВВЕДЕНИЕ

Перспективным направлением в медицине является разработка новых лекарственных средств антибактериального действия [1]. Потребность в них постоянно увеличивается в связи с повышением бактериальной резистентности к существующим лекарственным средствам [2].

Витебским государственным медицинским университетом, совместно с ООО "Рубикон", разрабатывается новое лекарственное средство, представляющее собой суппозитории с повиарголом, обладающим антимикробной и ранозаживляющей активностью. В качестве фармацевтической субстанции в суппозиториях используется

металл-полимерная композиция, содержащая высокодисперсное металлическое серебро.

Одним из этапов создания нового лекарственного средства является разработка методики анализа действующих веществ, входящих в его состав. Теме анализа на-ночастиц посвящена большая доля современных публикаций по нанотехнологии [3]. Для определения количественного содержания серебра предлагаются электрохимический [3, 4], рентгенофлюоресцент-ный [5], потенциометрический [6] и даже спектрофотометрический методы анализа [7]. Однако для определения серебра в лекарственном средстве в наибольшей степени подходит простой и надежный метод