CC BY
90
УДК 579.842.11:612.13:535
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА СПЕКЛ-МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ТОКСИНПРОДУЦИРУЮЩИХ ШТАММОВ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ НА МИКРОЦИРКУЛЯЦИЮ КРОВИ
Д.В. Подшибякин, Е.И. Тихомирова, О.В. Ульянова*,
С.С. Ульянов**, М.А. Шибаева
Саратовский государственный университет, кафедра микробиологии и физиологии растений * Научная бактериологическая лаборатория НИЧ,
** Кафедра оптики и биомедицинской физики E-mail: tichomirova [email protected]
Изучали влияние штаммов энтеропатогенных кишечных палочек, продуцирующих экзо- и эндотоксин, на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии. Отмечено возрастание скорости кровотока в капиллярах в течение небольшого промежутка времени. Установлена более выраженная реакция микрососудов брыжейки при действии микробных клеток, продуцирующих экзотоксин.
Ключевые слова: спекл-микроскопия, Escherichia coli, бактериальные токсины, микроциркуляция крови, брыжейка, белые крысы.
The Speckle-Microscopy Estimation of Toxinproducing Escherichia Coli Strains Effect on Blood Microcirculation
D.V. Podschibyakin, E.I. Tikhomirova, O.V. Ulianova, S.S. Ulyanov, M.A. Shibaeva
The effects of toxin producing entheropathogenic Escherichia coli on blood microcirculation in ventral mesentery of white rats were studied. The increasing of blood flow velocity in capillaries has been observed under the influence of toxins in the course of short intervals.
Key words: speckle-microscop, Escherichia coli, bacterial toxins, blood, microcirculation, ventral mesentery, white rats.
Введение
Одним из перспективных методов биотестирования токсичности в биомедицинских и экологических исследованиях является спекл-микроскопия. Традиционно токсичность инфекционных агентов определяют на лабораторных животных при внутрибрю-шинном и подкожном введении. Препарат считается безвредным при отсутствии у животных в течение 7 дней каких-либо местных и общих реакций. Спекл-микроскопия является информативным, доступным и дешёвым методом, позволяющим проводить исследования микроциркуляции in vivo в режиме реального времени [1-7].
Изменения характеристик и структуры потоков крови несут в себе важную патогенетическую и диагностическую информацию, отражающую характер действия микроорганизма на состояние макроорганизма [8].
Интерес к энтеропатогенным кишечным палочкам (ЭПКП) связан с широким распространением колибактериозов человека и животных [9]. В патогенезе кишечной коли-инфекции важнейшая роль принадлежит системе ферментов и токсинов, которые освобождаются из бактерий при размножении и массовой гибели последних в тонком кишечнике. Токсины нарушают проницаемость слизистой оболочки кишечника, проникают в систему воротной вены, печень и снижают ее дезинтоксикационную функцию. Механизмы патогенного действия токсинов и ферментов ЭПКП были предметом исследования многих авторов, тем не менее до сих пор остаются малоизученными. В связи с этим представляло интерес провести ex tempore in vivo оценку влияния энтеропатогенных кишечных палочек, продуцирующих экзо- и эндотоксины, на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс с использованием метода спекл-микроскопии.
Материалы и методы
В исследованиях использовали культуры энтеропатогенного штамма Escherichia coli A5, синтезирующего экзотоксин, и энтеропатогенного штамма Escherichia coli B6, обладающего способностью к продукции эндотоксина. Образование токсинов у данных штаммов обусловлено наличием вне-
Д.В. Подшибякин, Е.И. Тихомирова, О.В. Ульянова, С.С. Ульянов, М.А. Шибаева, 2008
хромосомных репликонов. Внехромосомные элементы E. coli А5 представлены высокомолекулярной плазмидой размером 180 кЬр и дополнительным внехромосомным реплико-ном размером 6 кЬр. В клетках штамма E. В6 обнаружен плазмидный репликон размером к 0,3 кЬр [10].
Бактерии культивировали в 5 мл мясо-пептонного бульона при 37 С. Суточные культуры центрифугировали при 600 g; полученные супернатанты, содержащие токсические продукты клеток, использовали для проведения исследований.
Объектом исследования были белые крысы двухмесячного возраста массой 180-200 г, без различения пола. Животные содержались на стандартном рационе вивария и были клинически здоровы. Перед проведением экспериментов крыс наркотизировали внутримышечно инъекцией натриевой соли 5-этил-5-(1-метилбутил)-2,4,6-триокси-пиримидина (нембутал) из расчёта 0,5 мг на 1 г массы тела. Затем проводили вскрытие брюшной полости и извлечение брыжейки. Вскрытую крысу помещали на термостабилизирующий столик спекл-микроскопа таким образом, чтобы брыжеечная петля находилась непосредственно под микрообъективом.
Оптическая схема спекл-микроскопа для изучения движущихся биологических сред представлена на рис. 1. Луч Не-№ лазера (А. = = 633 нм) фокусируется в пятно небольшого радиуса (^0 = 1,5 цм) на исследуемом сосуде.
Рис. 1. Оптическая схема спекл-микроскопа: 1 - лазер;
2 - окуляр с 10-кратным увеличением; 3 - разделитель лучей; 4 - микрообъектив с 8-кратным увеличением;
5 - столик; 6 - биологический объект (брыжейка белой крысы); 7 - зеркало; 8 - источник света; 9 - фотодетектор; 10 - видеокамера; 11 - компьютер
Опционально микроскоп может быть снабжён цифровой монохромной камерой типа МШесИ 1280-И8В, позволяющей наблюдать кровоток в сосуде визуально. При прохождении сильно сфокусированного лазерного пучка через поток крови в сосуде происходит его модуляция, что приводит к формированию динамических спеклов в зоне дифракции. Спеклы большого размера формируются при небольшом числе рассеивателей (клеток крови) таким образом, что диаметр фотодетектора оказывается существенно меньше размера спеклов. Временные вариации сигнала оцифровываются, записываются, а затем обрабатываются с помощью компьютерной программы (рис. 2).
Исходящий
сигнал
-5
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Время, с
Рис. 2. Выходящий сигнал спекл-микроскопа. Лазерный луч сфокусирован на кровеносном сосуде диаметром ~ 15 цм
Небольшое количество супернатанта щий сигнал спекл-микроскопа в течение 10 с.
культуры (~ 1 мл) наносили на петлю бры- Повторные регистрации проводили через 1,
жейки и немедленно регистрировали исходя- 2, 3, 4 и 5 мин для изучения динамики про-
5
0
цесса. В качестве контроля использовали характеристики кровотока до нанесения супернатанта. Выходящий сигнал оцифровывался, записывался в wav-файл и затем обрабатывался при помощи оригинального алгоритма для прикладного пакета программ МаШСАБ 2001.
Полученные данные представлены как изменения ширины полосы спектра (ШПС) флуктуации интенсивности сигнала для каждой секунды регистрации.
Результаты и их обсуждение
Было проведено сравнение влияния эк-зо- и эндотоксина E. coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс. Полученные результаты представлены на рис. 3, 4.
ШПС. Гц
160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
время, с
■контроль -"—2 минута —3 минута —*—4 минута —*—5 минута
Рис. 3. Эффект действия экзотоксина Escherihia coli А5 на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс
ШПС, Гц
время, с
контроль —■— 1 минута —*—2 минута —3 минута —*—4 минута -+—5 минута
Рис. 4. Эффект действия эндотоксина Escherichia coli B6 на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс
Установлено немедленное усиление скорости кровотока после нанесения супернатанта E. coli A5, содержащего экзотоксин, на микроциркуляцию крови в капиллярах. Было отмечено динамическое увеличение ширины полосы спектра флуктуации интенсивности сигнала примерно вдвое, что свидетельствует об ускорении кровотока в капилляре (рис. 3).
При нанесении супернатанта E. coli B6, содержащего эндотоксин, выявлены более низкие изменения скорости кровотока (рис. 4). Максимальное увеличение ширины полосы спектра флуктуации интенсивности сигнала в данном случае составило примерно ~ 20 Гц.
Следовательно, в целом действие экзо- и эндотоксинов кишечной палочки на микроциркуляцию крови в брыжейке кишечника экспериментальных животных однотипно.
Поскольку желудочно-кишечный тракт отличается, наряду с общими миопаралити-ческими эффектами, сложной нейротониче-ской пептидоэргической регуляцией, можно предположить, что повышение скорости микрогемоциркуляции может быть связано с изменениями в системе вегетативной иннервации и продукции гастроинтестинальных гормонов [11, 12].
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант №06-04-39016), National Science Foundation of China (Grant No.30711120171), и US Civil Research and Development Foundation (A WARD REC~006).
Библиографический список
1. Галанжа Е.И. Микролимфодинамика в норме и патологии. Оптические методы исследования: Дис. ... д-ра мед. наук / Сарат. гос. ун-т. Саратов, 2004.
2. Федосов И.В., Ульянов, С.С. Особенности проявления эффекта Допплера при дифракции сфокусированного когерентного излучения в рассеивающем потоке // Оптика и спектроскопия. 2001. Т.91, №2. С.325-329.
3. Aizu Y., Asakura T., Ogino K., Sugita T. Evaluation of flow volume in a capillary using dynamic laser speckles based on the photon correlation // Opt. Commun. 1990. Vol.80(2). Р.1-6.
4. Ulyanov S.S. New type of manifestation of the Doppler effect: an applications to blood and lymph flow measurements // Opt. Eng. 1995. Vol.34(10). Р.2850-2855.
5. Ulyanov S.S., Tuchin V.V., Bednov A.A. et al. The applications of speckle interferometry for the monitoring of blood and lymph flow in microvessels // Lasers in Medical Sciences. 1997. Vol.12. Р.31-41.
6. Ulyanov S.S. High-resolution speckle-microscopy: study of the spatial structure of a bioflow // Physiol Meas. 2001. Vol.22. Р.1-10.
Биология
75
7. Ulyanov S. Principles of high-resolution speckle microscopy: analysis of bioflows // Proc SPIE. 2002. Vol.4607. Р.374-380.
8. Ульянова О.В., Ганилова Ю.А., Ульянов, С.С. Использование спекл-микроскопии при тестировании токсичности бактериальных препаратов // Вестп. Cарат. гос. аграрного ун-та. 2007. №2. C.lS-20.
9. Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник / В.И. Покровский, C.r. Пак, Н.И. Брико, Б.К. Дапилкип. 2-е изд. М.: ЭОТАР-МЕД, 2004. 8l6 с.
10. Волкова М.В. Разработка экспериментальной живой вакцины для профилактики колибактериоза свиней: Авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. Саратов, 2006.
11. Мельников Н.И., Мельников В.Н., Гимранов М.Г. Ферменты патогенности и токсины бактерий. М.: Медицина, 1969. 252 с.
1 2 . Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы общей патологии: Учеб. пособие для студентов медвузов. СПб.: ЭЛБИ, 1999. Ч.1. Основы общей патофизиологии. 624 с.
