CC BY
185
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
Раздел VIII
ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ
УДК: 577.114.083.115(048.85) DOI: 10.12737/artide_5947d50a4ddf68.91843258
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ (обзор литературы)
С .А. КАЛАШНИКОВА, Л.В. ПОЛЯКОВА
Пятигорский медико-фармацевтический институт -филиал ФГБОУ ВО Волгоградского государственного медицинского университета Минздрава России, пр. Калинина 11, г. Пятигорск, Ставропольский край, 357532, Россия
Аннотация. Для моделирования различных патологических процессов в медико-биологических исследованиях широко используется бактериальный липополисахарид Грам отрицательной микрофлоры, который обладает стандартными токсикологическими характеристиками и имеет не только типовую, но и групповую специфичность. Существует множество различных методик с использованием бактериального липосахарида, что во многом осложняет выбор способа моделирования патологического процесса и ставит перед исследователями достаточно трудную задачу с определением кратности введения, дозы и путей введения липополисахарида. В настоящее время основополагающей в моделировании патологических процессов является длительность введения липополисахарида с развитием острой или хронической интоксикации. В моделях с воспроизведением острой эндогенной интоксикации используется однократное ведение липополисахарида или в течение 7 дней, где наиболее часто доза составляет от 0,2 мг/кг до 15 мг/кг массы тела экспериментальных животных. Другим способом моделирования острой эндогенной интоксикации является увеличение концентрации так называемого «физиологического» липополисахарида в системном кровотоке, где необходим постоянный контроль лабораторных показателей, свидетельствующих о развитии эндогенной интоксикации. Скорость развития патологического процесса во многом определяется способом введения липополисахарида, при этом наиболее часто используется внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное, однако, ряд исследователей используют внутрикишечный, интратрахеальный, ингаляционный и внутрикраниальный способы введения.
Ключевые слова: моделирование, эндогенная интоксикация, бактериальный липополисахарид, способы введения липополисахарида.
THE USE OF BACTERIAL LIPOPOLYSACCHARIDE FOR PATHOLOGICAL PROCESSES MODELING ON BIOMEDICAL RESEARCH (literature review)
S.A. KALASHNIKOVA, L.V. POLYAKOVA
Pyatigorsk Medical And Pharmaceutical Institute - The Branch Of The Volgograd State Medical University Of The Ministry Of Health, Russia Kalinin av., 11, Pyatigorsk, Stavropol'sky region, 357532, Russia
Abstract. The bacterial lipopolysaccharide Gram with negative microflora is widely used for modeling various pathological processes in biomedical research. It has the standard toxicological properties and has not only a sample but also a group specificity. There are many different techniques using bacterial lipopolysaccharide, which greatly complicates the choice of the method of the pathological process modeling and puts quite a difficult task for the researchers to introduce the definition of the multiplicity of doses and routes of administration of lipopolysaccharide. At present, the fundamental in the pathological processes
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
simulation is the duration of lipopolysaccharide administration and the development of acute or chronic toxicity. In the models reproducing the endogenous acute toxicity, a single lipopolysaccharide administration is used within 7 days. A most dose is from 0,2 mg / kg to 15 mg / kg body weight of the experimental animals. Another method of the acute intoxication modeling is to increase the endogenous concentration, so called "physiological" lipopolysaccharide in the systemic circulation. This requires constant monitoring of laboratory parameters, indicating the development of endogenous intoxication. The rate of development of the pathological process is largely determined by the mode of lipopolysaccharide administration, the most commonly are intraperitoneal, intravenous and subcutaneous. However, some researchers use an intracolonic, intratracheal, inhalation and intracranial administration.
Key words: modeling, endogenous intoxication, bacterial lipopolysaccharide, LPS injection methods.
Активное развитие современной медицины позволяет изучать течение патологических процессов на различных уровнях организации живой материи с использованием инновационных методов молекулярной биологии [5,11]. Однако, оценить течение патологического процесса, его влияние на макроорганизм и выбрать наиболее оптимальный метод моделирования, по-прежнему, остается актуальной проблемой и в настоящее время. Одним из приоритетных направлений в моделировании патологических процессов является изучение системного воспалительного ответа (SIRS) и синдрома полиорганной недостаточности (СПОН). При изучении системного воспалительного ответа и эндогенной интоксикации (ЭИ), сопровождающей различную соматическую патологию (ожоги, травмы, инфекционные заболевания и т.д.), ведущая роль отводится бактериальному липополисахариду (ЛПС), выделенного из клеточной стенки грамотрица-тельных бактерий (Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas аeruginosa). Учитывая структурные особенности ЛПС, данный эндотоксин обладает типовой и групповой неспецифичностью, являясь универсальным антигеном, определяющим общие биологические свойства микроорганизмов [3]. При моделировании патологических процессов чаще всего используется ЛПС, полученный от Salmonella thyphi и Salmonella thyphimurium 486 («Sigma», USA). Однако ряд исследователей используют ЛПС Shigella Zonnae, Escherichia coli, Yersinia pes-tis 358/12 и т.д. Преимущественно для воспроизведения острой или хронической ЭИ используется ЛПС Salmonella thyphi или патогенных штаммов Escherichia coli различных фирм производителей (Sigma-Aldrich Co; List Biological Laboratories; Campbell) со стандартизированными токсикологическими характеристиками.
Min-Ji Bak et al. (2013) для изучения противовоспалительного действия различных веществ на культуре клеток RAW 264.7 использовали ЛПС Escherichia coli O127:B8. В другой модели Zhong-hua Wang et al. (2013) ЛПС Escherichia coli штамма 055 :B5 вводили внутрибрюшинно мышам 15 мг/кг. При остром повреждении легких путем интратрахеального введения ЛПС с вторичным повреждением почек, Khin Hnin Si М. et al. (2013) использовали Escherichia coli штамм O111:B4.
В структуре ЛПС выделяют несколько компонентов: О- или S-полисахаридных цепей, R-центрального олигосахарида, липида А. Токсический эффект ЛПС обусловлен непосредственно О-антигеном и липидом А, который взаимодействует с мембранами клеток вызывая цитотоксическое действие. О-антиген является поверхностной структурой бактериальной мембраны, представленный полимерами из 20-40 моносахаридов, которые повторяются в цепочке. Специфическое строение О-цепей обусловливает гетерогенность данного полисахарида и основные свойства ЛПС. Известно, что липид А также обладает цитотоксичностью, находясь в наружной мембране и представляет собой проксимально расположенную часть ЛПС, основной структурной единицей которого является фосфорилированный Р-1,6,0-глюкозамин с несколькими остатками жирных кислот. Установлено, что максимальной токсичностью для клеток человека обладает липид А (гидрофобная часть ЛПС), который в своем составе имеет 6 остатков жирных кислот и 2 фосфатные группы, а также миристиновые и лауриновые остатки, например, как у ЛПС выделенного из Escherichia coli. Именно липиду А отводят основную роль в развитии токсического эффекта, который при определенных условиях превышает таковую полисахаридной фракции в сотни раз. Белковая часть ЛПС свя-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
занная с липидом А, представленная lipid A associated protein (LAP), повышает иммуноген-ность токсина. Липид А взаимодействует с клетками иммунной системы после высвобождения эндотоксина, что приводит к развитию воспалительного ответа. В зависимости от наличия или отсутствия отдельных компонентов выделяют S-ЛПС (наличие всех трех доменов), R-ЛПС (отсутствует О-антиген), Re-ЛПС (липид А с одним или двумя остатками 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты), Ra-ЛПС, Rd1-ЛПС, Rb1 -ЛПС, Rc-ЛПС (нарушение строения олиго-сахаридов внутренней и внешней ядерной частей). Относительно стабильной частью эндотоксина является ядро, расположенное между О-полисахаридом и липидом А, так называемое ядро (core), построенное из нескольких молекул сложных сахаров и трисахарида 2-кето-З-деоксиоктоновой кислоты, что обусловливает развитие определенных эффектов эндотоксина. Ядро ЛПС представлено внешним и внутренним компонентами состоящими из D-глюкозы, D-галактозы, N-ацетил-В-глюкозамина (внешняя часть ядра) и В-глицеро-О-манно-гептозы, 2-кето-З-дезокси-В-манно-октулозоновой кислоты (внутренняя часть ядра).
В организме человека присутствует постоянный «физиологический» источник ЛПС - сапрофитная, условно-патогенная и патогенная грамотрицательная микрофлора кишечника, хотя определенное значение придается микрофлоре кожных покровов, слизистых оболочек дыхательных путей, полости рта и урогени-тальной системы. Реализация патогенных свойств ЛПС заключается в развитии таких патологических процессов как лихорадка, лейкоцитоз/лейкопения, хемоиндуцированный стресс и аутоагрессия. В зависимости от реактивности организма и индивидуальных конституциональных предрасположенностей к той или иной болезни развивается острая или хроническая полиорганная недостаточность. Кроме этого, известны нетоксические эффекты ЛПС, например, эндотоксин из фототрофных бактерий семейства Rhodobacter, которые способны конкурентно связываться с рецептором на поверхности клетки, проявляя антагонистическую активность в отношении эндотоксинов
[14].
Биологические эффекты ЛПС достаточно разнообразны и зависят от концентрации, дли-
тельности воздействия, реактивности организма, иммунологической толерантности, аффинитета к рецепторам ЛПС и многих других факторов. Из основных биологических свойств ЛПС следует отметить пирогенность, токсичность, активацию выработки белков острой фазы, а также способность вызывать выраженные реологические сдвиги крови за счет воздействия на форменные элементы и эндотелий сосудов вследствие активации циклооксигеназного и липооксигеназного путей метаболизма жирных кислот, цитокинопосредованных патогенных эффектов эндотоксина с развитием ДВС-синдрома, что лежит в основе патогенеза различных заболеваний. Системное влияние ЛПС приводит к нарушению проницаемости гема-тоинтестинального барьера, стимуляции системы фагоцитов и массивному выбросу медиаторов, что в определенной степени блокирует процессы детоксикации печени и приводит к повреждению вторичными продуктами метаболизма внутренних органов и формированию полиорганной недостаточности [4].
Как уже было отмечено выше, основным «физиологическим» резервуаром ЛПС является кишечник, обеспечивающий формирование индивидуальных особенностей активности врожденного иммунитета. Понятие «эндоток-синового иммунитета» и «эндотокисновой агрессии» введено и активно разрабатывалось М.Ю. Яковлевым (2007), а также были запатентованы основные методы лабораторной диагностики эндотоксинемии. Установлено, что дробное поступление из кишечника ЛПС в кровь при физиологических условиях обеспечивает его концентрацию от 0 до 1,0 EU/ml и элиминируется из организма системой макрофагов печени. Наряду с этим, гепатоцитами врабатывается ЛПС-связывающий протеин (LBP) концентрация которого в сыворотке крови при нормальных условиях составляет 10 мкг/мл-1. Данный белок обеспечивает взаимодействие ЛПС с клетками-мишенями, который является одним из звеньев рецепторного пути распознавания ЛПС, наряду с рецепторами CD 14, TLR4/MD-2, который обусловливает мощный клеточный ответ. Трансмембранные белки toll-like receptors (TLR) у млекопитающих насчитывают 13 типов, однако специфичным к ЛПС является TLR4. В то время как гуморальный ответ складывается из таких компонентов как: катионные белки крови, собственные ан-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
титела и липопротеины [14,23].
При попадании в системный кровоток ЛПС происходит активация системы фагоцитов (лейкоциты, макрофаги, Купферовские клетки и др.), что приводит к выработке биологически активных веществ липидной и белковой природы таких как простагландины, фактор активирующий тромбоциты (PAF), лейкотриены, интерлейкины, система интерферона, ФНО-а, NO, колониестимулирующие факторы и др. В последующем ЛПС в крови связывается с белком, осуществляющем перенос ЛПС на мембрану клетки-мишени (моноциты, нейтрофи-лы) и передается CD 14, который не имеет эн-доплазматического домена и в связи с этим передает сигнал на комплекс TLR4 и MD-2 с активацией ряда белков, к которым относятся фактор дифференцировки миелоидов MyD88, TIR-содержащий адаптерный белок TIRAP, TIR-содержащая адаптерная молекула TRIF и TRIF-родственная адаптерная молекула TRAM, что в свою очередь приводит к активации ядерного фактора Каппа^ (NFkB) и интерферон-регулирующего фактора 3 (IFR3). Таким образом, механизм распознавания бактериального ЛПС включает следующие компоненты: LBP, CD14, TLR4 и MD-2, которые экспрессируются на моноцитах, макрофагах, лимфоцитах, эндо-телиальных и эпителиальных клетках [7].
В зависимости от концентрации ЛПС в системном кровотоке степень выраженности клеточного ответа значительно варьирует. Известно, что при низкой концентрации ЛПС происходит избирательное повреждение тканей, при средней - развитие системного воспалительного ответа, лихорадки, при высокой концентрации - эндотоксинового шока. Было установлено, что при введении ЛПС в концентрации 0,01 мкг/л клетки-мишени (прежде всего, фагоцитарные клетки) гибнут путем апоптоза, в то время как при увеличении дозы до 1,0 мкг/л гибель клеток сопровождалась выраженными некротическими изменениями.
В настоящее время существует множество экспериментальных моделей для воспроизведения острой и хронической ЭИ. Основной отличительной чертой для моделирования хронического процесса является длительность, кратность и доза введения различных препаратов. Ввиду того, что развитие ЭИ подразумевает возникновение универсальных механизмов развития патологических процессов, основан-
ных на повышении концентрации эндогенных токсических соединений в системном кровотоке, спектр которых достаточно широк и включает в себя среднемолекулярные вещества различной природы, продукты некротизации тканей, бактериальные токсины, продукты сво-боднорадикального окисления, медиаторы токсемии, активированные ферменты, а также продукты обычного метаболизма в высоких концентрациях, проблема моделирования ЭИ остается актуальной и в настоящее время. В связи с этим существует ряд методик для моделирования как острого, так и хронического патологического процесса, где инициальным звеном являются самые различные факторы. В целом следует разделить модели для воспроизведения острой и хронической интоксикации.
Классической моделью острой ЭИ является моделирование ожоговых ран, занимающих по площади не более 5% тела с целью изучения всех фаз течения ЭИ. Наркотизированным животным наносились ожоги на коже (исключая локализацию рефлексогенных зон) не более чем III степени. Для нанесения ожогов в настоящее время большинство исследователей используют раскаленные металлические муфты. В результате этого, основным субстратом эндогенных токсических соединений являются продукты деградации собственных тканей с изменением физико-химических свойств различных биосред, что связано с термическим поражением тканей.
Модель ишемии-реперфузии заключается в перевязке/клеммирования сосудов брыжейки. У крыс клеммирование мезентериальных сосудов не более чем на 15 мин приводило к развитию эдотоксического шока с развитием некроза кишечника, повреждением гематоинтестинального барьера и выходу «физиологического» ЛПС и продуктов метаболизма в системный кровоток, что практически в 100% случаев приводило к летальному исходу. Проблема реперфузионных осложнений с развитием системной эндотокси-немии также активно обсуждается при различных патологических состояниях не связанных с нарушением интестинального барьера. Возникновение такого грозного осложнения как геморрагический шок в хирургической практике приводит к поиску новых путей патогенетической коррекции и определенному вкладу различных органов в развитие эндотоксиновой агрессии. В данном случае тяжелая полиорганная недоста-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
точность обусловлена реперфузией и реоксиге-нацией после ишемии на фоне централизации кровообращения при геморрагической гипотен-зии. Моделирование геморрагической гипотен-зии с развитием системной эндотоксинемии по методике Т.П. Храмых, В.Т. Долгих (патент РФ на полезную модель № 49442 от 27 ноября 2005 г) выявило, что при катетеризации левой общей сонной артерии крыс с кровопусканием и поддержанием артериального давления на уровне 40 мм.рт.ст., на ранних сроках (15 и 30 мин) максимальное количество маркеров ЭИ наблюдалось в гомогенатах тонкой и толстой кишок, в то время как печень и легкие практически не реагировали на развитие ЭИ на данном сроке эксперимента. Однако, через 2 ч моделируемой гипо-тензии концентрация молекул средней молекулярной массы и олигопептидов достигала максимальных значений в печени, селезенке, легких с развитием полиорганной недостаточности, на фоне раннего нарушения интестинального барьера, что приводило к вторичной интоксикации продуктами метаболизма в кишечнике и развитию системной эндотоксемии [12].
Моделирование острого повреждения печени с введением гепатотропных ядов с целью значительного снижения детоксицирующей функции печени, заключающейся в невозможности обезвреживать продукты обычного метаболизма и ЛПС кишечной микрофлоры, постоянно поступающего в кровоток. На данный момент применяется множество гепатотроп-ных ядов: четыреххлористый углерод, фосфор-тетрациклин, метотрексат, 6-меркаптопурин, ацетаминофен и т.д., при этом наиболее часто в научно-исследовательских целях используется тетрахлорметан (ТХМ). Существует методика моделирования острого процесса, где мышам однократно вводится 1-8 мл/кг через канюлю 50% масляный раствор ТХМ с последующим формированием к 7 сут эксперимента жирового гепатоза и развитием печеночной недостаточности [8].
Другим механизмом развития ЭИ является недостаточная элиминация эндогенных токсических соединений из организма, связанная с поражением почек. В данном случае исследователями осуществлялось использование нефро-токсичных антибиотиков (аминогликозиды, це-фалоспорины и т.д.), цитостатиков (метотрек-сат, ципластин и др.), а также солей тяжелый металлов (ртуть, свинец, висмут), пестицидов.
Ежедневно крысам внутрибрюшинно в течение недели вводился препарат, в 3-4 раза превышающий терапевтическую дозу, что приводило к формированию дисметаболической нефропа-тии и, в конечном итоге, почечной недостаточности. При продолжении введения препаратов в более низких концентрациях у животных экспериментальных групп развивались признаки хронической ЭИ, обусловленные наличием неф-ропатии ввиду длительного токсического воздействия на почечную паренхиму [6].
Особое значение придается выбору дозировки бактериального ЛПС в сопоставлении со способами введения, где концентрация рассчитывается исходя из LD50 в каждой экспериментальной группе. Существуют модели с внутри-брюшинным (интраперитонеальным), подкожным, ингаляционным, внутривенным, внутри-кишечным, интратрахеальным, внутрикрани-альным введением ЛПС, выбор которых непосредственно влияет на скорость развития и выраженность патогенного действия токсина. В различных моделях с воспроизведением системного воспалительного ответа обычно использовалось внутрибрюшинное введение ЛПС, ввиду того, что брюшина обладает высокими резорбтивными свойствами и обеспечивает постепенное поступление в системный кровоток ЛПС, а перитонеальная жидкость не изменяет его основные биологические свойства.
При интраперитонеальном введении концентрация ЛПС значительно варьирует по данным различных исследователей. Так, для моделирования острой ЭИ в одном случае исходят из LD50, равной 2-5 мг/кг массы животного, в другом - 20 мг/кг ЛПС Escherichia coli штамма 026:В6 («Sigma») с выведением животных из эксперимента через 1 и 7 суток. Известно, что применение ЛПС данного штамма E.coli вызывает развитие выраженного воспалительного ответа с резким изменением цитокинового профиля и повышением ФНО-a, у-ИФН, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-12р40 [13]. Другие исследователи, James E. et al. (2009) вводили ЛПС внутрибрю-шинно в дозе 10 мг/кг E. coli, в то время как Zhong-hua Wang et al. (2013) 15 мг/кг.
По данным Афанасьевой Г.А. (2009) для моделирования острой ЭИ используется 18-20 г ЛПС штамма Yersinia pestis 358/12 в дозе эквивалентной LD50 с выведением из эксперимента животных через 1,5-2 и 4 ч. В данном случае при исследовании внутренних органов было выяв-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
лено, что основными мишенями ЛПС являются печень, почки и кишечник с развитием эндоте-лиальной дисфункции и формированием цир-куляторной гипоксии, дистрофическими и некротическими изменениями органов, обеспечивающих инактивацию и элиминацию токсина.
Интересным является тот факт, что определенная концентрация бактериального ЛПС может вызывать остеопатию вплоть до остео-некроза. Так, для моделирования ЛПС-индуцированного остеонекроза использовали внутривенное введение кроликам Vibrio cholera О1: B El Tor, серотип Ogawa в концентрации 10 мг однократно [21].
Следующей экспериментальной моделью с целью изучения патоморфологических изменений бронхо-легочной системы является интрат-рахеальный способ введения бактериального ЛПС. Так, например, при исследовании токсического влияния этанола производили дополнительное введение бактериального ЛПС, обладающего прямым и опосредованным токсическим эффектом. Крысам предварительно вводили 20% раствор этанола из расчета 1,5 или 3,0 г/кг внутрибрюшинно, а затем через 30 мин внутритрахеально 10 мг ЛПС Escherichia coli путем толстоигольной пункции трахеи с последующим ушиванием раны. В данном случае возникает проблема сочетанного влияния экзогенных токсинов (этанол, метанол, фосфаты, соли тяжелых металлов и др.) и развития острой ЛПС-индуцированной интоксикации с повреждением внутренних органов, в связи с чем количество внутрибрюшинно вводимого бактериального ЛПС несколько изменялось по сравнению с моделями изолированного введения ЛПС. Другими исследователями использовалось также интратрахеальное введение бактериального ЛПС, но из расчета 16 мг/кг разведенного в 0,5 мл изотонического солевого раствора в виде аэрозоля [18]. Dong S, et al. (2013) придерживались аналогичной методике, но с использованием бактериального ЛПС в другой концентрации - 120 мл (2 г/л) с целью определения эффективности лекарственных средств при лечении воспаления дыхательных путей.
Более оптимальной моделью для изучения «опосредованного» токсического поражения бронхолегочной системы, на наш взгляд, является ингаляционный неинвазивный способ введения, который дает возможность обеспечить постепенное и равномерное распределе-
ние бактериального ЛПС по бронхо-легочной системе. В данном случае животное помещали в герметичную камеру объемом 100 л, где концентрация бактериального ЛПС Escherichia coli 01 28: Б12 (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), диспергированного в 0,9% NaCl (водная дисперсия) или гидрофобной липидной фазе, составила 200 мкг/кг массы [10].
Установлено, что бактериальный ЛПС благодаря своим биологическим свойствам оказывает системное влияние на внутренние органы, в том числе и на головной мозг. Так, некоторыми авторами была создана модель, позволяющая локально воздействовать на центральную нервную систему, где бактериальный ЛПС оказывал прямое повреждающее действие, а затем вследствие необратимых дистрофических и некротических изменений нервной ткани приводил к вторичному повреждению нервной системы. Учитывая, что поступление бактериального ЛПС приводит к увеличению популяции провоспалительных цитокинов, прежде всего, TNF-a и IL-1ß, которые являются звеном в патогенезе развития нейродегенера-тивных заболеваний, таких как болезнь Альц-геймера, болезнь Паркинсона, а также развития ишемического инфаркта головного мозга, ряд ученых предложили в качестве адекватной модели использовать двустороннее внутрикрани-альное введение малых доз бактериального ЛПС согласно методике Guo et al. (2010). Введение бактериального ЛПС осуществлялось с использованием стереотаксического аппарата. Иглой Гамильтона (№22) производилась пункция боковых желудочков мозга крыс, куда вводили 50 мкг бактериального ЛПС (Escherichia coli) растворенного в 10 мл цереброспинальной жидкости. Оптимальной скоростью введения считали 2 мл/мин в течение 5 мин [19]. Наряду с определением участия бактериального ЛПС в повреждении ткани головного мозга, существует ряд методов направленных на определение протективных свойств различных веществ, влияющих на отдельные клеточные популяции головного мозга. При культивировании микро-глиальных клеток, предварительно помещенных в раствор одного из таких веществ на час, а затем в раствор бактериального ЛПС в концентрации 100 нг/мл на 16 часов оценивали эффективность новых нейропротекторов, что является несомненно значимой моделью в экспериментальной патологии [26].
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
Кроме этого, существует модель с введением бактериального ЛПС в черную субстанцию головного мозга с целью выявления участия воспалительного процесса в формировании нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы, в частности болезни Пар-кинсона. В данном случае исследователями использовался раствор бактериального ЛПС (2 мл, 2 мг/мл), который вводили в правую часть черной субстанции со скоростью 1 мл/мин, после чего, в течение 5 мин никаких манипуляций не проводили и затем медленно удаляли иглу. Данный эксперимент позволил доказать участие провоспалительных цитокинов в формировании патоморфологических изменений черной субстанции и выявить четкую временную зависимость между концентрацией TNF- а и IL-1 ß и сроками эксперимента [24]. Parajuli B.L. et al. (2012) было показано, что влияние на глиальные клетки головного мозга осуществлялось посредством связывания ЛПС с TLR4 и CD14 через ERK1/2 и p38 резидентных макрофаго-подобных клеток, выработкой ими колниестимулирующе-го фактора макрофагов (GM-CSF) и увеличением продукции глиальными клетками IL-1ß, IL-6, TNF-а и NO.
Кроме этого, основные направления научно-исследовательской работы ряда авторов заключались в изучении роли ЛПС в формировании и течении системного воспалительного ответа и возможной патогенетической коррекции данного патологического состояния. В связи с чем, были использованы различные способы моделирования ЛПС-индуцированного повреждения внутренних органов экспериментальных животных, клеточных культур различных тканей и компонентов фагоцитарной системы (преимущественно макрофагов и лифо-цитов). Исследование токсического воздействия на органы-мишени (сердце, легкие, печень, почки, кишечник, органы эндокринной системы) привело к созданию новых экспериментальных моделей, которые несмотря на универсальность патогенного влияния ЛПС, отличались по способу введения, длительности и концентрации вводимого ЛПС.
Для моделирования ЛПС-индуцированной кардиомиопатии (гипертрофической) использовали бактериальный ЛПС из расчета 60 мг/кг с оценкой полученных результатов через 12 и 24 часа. В данной модели авторами установлено, что через 24 часа после внутрибрюшинного
введения бактериального ЛПС в данной концентрации у мышей формировалась кардиоме-галия [25]. Напротив, для воспроизведения кардиомиопатии в условиях длительной ЭИ с ежедневным внутрибрюшинным введением 4% раствора гентамицина с целью формирования нефропатии и нарушения функции выведения токсических продуктов из организма из расчета 20 мг/кг в сочетании с еженедельным внут-рибрюшинным введением бактериального ЛПС 0,5 мг/кг массы тела, где морфологические изменения в сердце характеризовались атрофией, мелкокапельной жировой дистрофией кар-диомиоцитов, скудной периваскулярной лим-фоцитарной инфильтрацией, мелкоочаговым кардиосклерозом [9].
При формировании пневмопатии и изучении влияния некоторых противовоспалительных препаратов используется интратрахеаль-ный или ингаляционный способ введения ЛПС, где концентрация варьировала от 200 мкг/кг, 16 мг/кг и до 2 г/л, что определяет степень повреждения дыхательных путей и легочной ткани, которая характеризуется при остром повреждении утолщением межальвеолярных перегородок, отеком, лимфоцитарной инфильтрацией, полнокровием сосудов, диапедезными кровоизлияниями, с наличием спавшихся и эмфи-зематозно расширенных альвеол. Со стороны бронхов отмечалась десквамация эпителия и белковый экссудат с примесью эритроцитов и лейкоцитов. Длительное введение ЛПС характеризовалось всеми морфологическими признаками хронического воспаления с преобладанием лимфоцитарной инфильтрации, участками пневмофиброза, чередованием участков ателектаза и эмфизематозно измененной легочной ткани [9].
Моделирование дисметаболической нефро-патии производится путем введения нефроток-сичных антибиотиков в сочетании с введением бактериального ЛПС, где концентрация его составляет от 0,1 до 0,5 мг/кг/сут, что приводит к формированию необратимых морфологических изменений, характеризующихся частью атрофированных и склерозированных клубочков, интер-стициальным отеком и дистрофией нефротелия почечных канальцев различной степени выраженности с очаговой его десквамацией. Острое неспецифическое повреждение почечной паренхимы наблюдалось при введении ЛПС 0,5 мг/кг, развитие системной эндотоксинемии 2,5-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
10,0 мг/кг и эндотокиснового шока 25 и 50 мг/кг, где наблюдалась 100% летальность экспериментальных животных [8].
ЛПС-индуцированное повреждение печени зависит от концентрации вводимого ЛПС, где достоверные признаки структурных изменений наблюдалось при введении 10 мг/кг и характеризовались зональным повреждением печеночного ацинуса с развитием стеатоза, некроза гепатоцитов, отека, полнокровия синусоидов и сосудов микроциркуляторного русла [8]. При длительном введении ЛПС данные явления сменялись преобладанием перипортального гепатофиброза, гипертрофией Купферовских клеток, сочетанием смешанной дистрофии ге-патоцитов и регенерации с нарушением гисто-архитектоники органа. Данные изменения печени развивались независимо от способа введения ЛПС и зависели только от длительности его введения. Следует отметить, что в данной модели первоначально водили ТХМ, обладающий гепатотоксичным действием, что приводило к первичному повреждению печеночной паренхимы с последующим введением (через 7 сут) бактериального ЛПС [9].
Патоморфологические изменения кишечника с нарушением гематоинтестинального барьера развивались в различных моделях ЭИ, где основными факторами формирования полиорганной недостаточности являлись стимуляция выхода так называемого «физиологического» ЛПС из просвета кишки, например, в модели с клеммированием брыжеечных сосудов, внутрикишечным или же длительным интрапе-ритонеальным введением ЛПС не менее 10 мг/кг с развитием системной эндотоксинемии.
Ряд работ посвящены изучению влияния ЭИ на щитовидную железу с развитием синдрома нетиреоидных заболеваний. Для моделирования острого повреждения щитовидной железы вводили 10 мг/кг ЛПС Б.еоН, что приводило к изменению размеров фолликулов в периферической и центральной зонах, изменением высоты фолликулярного эпителия и частичной десквамацией, отеком стромы, запустева-нием или кровенаполнением сосудов микро-циркуляторного русла (в зависимости от срока эксперимента) с развитием гормонального дисбаланса связанного со снижением функциональной активности щитовидной железы независимо от гипоталамо-гипофизарной системы [1].
Отдельные работы были посвящены изучению болевого синдрома и механизмов ноци-цепции с использованием однократного внут-рибрюшинного введения ЛПС из расчета 30 мкг/кг и изолированного внутрикраниаль-ного введения ЛПС крысам в различные структуры мозга с помощью иглы Гамильтона по методике описанной выше [1].
Для моделирования хронического повреждения используют внутрибрюшинное введение ЛПС Salmonella thyphi и Salmonella thyphimurium из расчета 0,2 мкг/кг втечение 30, 60 и 90 сут. Предварительно частично выключают органы детоксикации, такие как печень и/или почки путем введения нефротоксичных антибиотиков, превышающих терапевтические концентрации в несколько раз (например, 0,5% р-р гентамици-на из расчета 20 мг/ кг массы тела, внутрибрю-шинно) или гепатотоксичного яда - тетрахлор-метана из расчета 0,5 мл/кг 30% р-ра перораль-но. В данной модели используют введение гепа-то- и нефротоксичных ядов втечение 6 дней при сочетанном однократном внутрибрюшинном введении бактериального ЛПС [17,18].
Таким образом, множество моделей и большой разброс в кратности и дозировке бактериального ЛПС диктует необходимость выявления наиболее оптимальной модели для воспроизведения различных патологических процессов. При анализе современной литературы нами было выявлено, что преимущественно исследователи используют штаммы Salmonella thyphi, Salmonella thyphimurium и Escherichia coli, где концентрация вводимого ЛПС варьирует от 0,2 до 20 мг/кг массы тела экспериментальных животных. Нам кажется наиболее целесообразным введение 0,2 мг/кг, т.к. в других случаях острое прямое повреждение внутренних органов нередко превышает LD50. Оптимальная длительность введения при моделировании острого патологического процесса составляет 7 дней, где на различных этапах эксперимента можно проследить последовательность развития патологических изменений, в то время как однократное введение в высоких концентрациях ЛПС приводит к прямому повреждению внутренних органов и развитию неспецифических изменений.
Особое внимание на себя обращает тот факт, что по моделированию хронической ЭИ встречаются единичные работы, где введение ЛПС сочетается с частичным выключением ос-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
новных органов детоксикации и элиминации токсических соединений с развитием синдрома ЭИ, что является достаточно новым направле-
Литература
1. Абрамова А.Ю., Перцов С.С., Козлов А.Ю. Содержание цитокинов в крови и структурах головного мозга у крыс при введении липополисахари-да // Бюлл. экспер. биол. мед. 2013. Т. 155, № 4. С. 405-409.
2. Афанасьева Г.А., Чеснокова Н.П. О патогенетической взаимосвязи патоморфологических нарушений и активации процессов липопероксидации при эндотоксикозе // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2009. № 1. С. 2528.
3. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г. Роль эндотоксина кишечной микрофлоры в физиологиии и патологии человека // Бюлл. Оренбургского научного центра УрО РАН. 2012. №3. С. 1-6.
4. Глумов В.Я., Кирьянов Н.А., Баженов Е.Л., Иванов Г.С. Перитонеальный эндотоксикоз, морфология и морфогенез поражений биосистем экспериментальных животных // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1994. № 12. С. 636-639.
5. Дудин Н.С., Русак С.Н., Хадарцев А.А., Хадар-цева К.А. Новые подходы в теории устойчивости биосистем - альтернатива теории А.М. Ляпунова // Вестник новых медицинских технологий. 2011. Т. 18, № 3. С. 336.
6. Калашникова С.А., Ковнацкая Г.А., Щего-лев А.И. Морфофункциональная характеристика почек при хроническом эндотоксикозе на фоне гипертиреоза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 151, N 6. С. 709712.
7. Маркина А.А. Липополисахаридная кандидат-вакцина для профилактики эндотоксинового и септического шока: автореф. дисс.... канд.мед.наук. Москва, 2013. 129 с.
8. Мишнев О.Д., Щеголев А.И., Лысова Н.Л. Печень и почки при эндотоксинемии. М.: РГМУ, 2003. 212 с.
9. Писарев В.Б., Новочадов В.В., Зарипова И.В. Ультраструктура кардиомиоцитов при патологии сердца, вызванной хронической эндогенной интоксикацией и цитостатиками // Вестник ВолгГ-МУ. 2007. Т.4, № 24. С. 35-38.
нием в моделировании патологических процессов.
References
Abramova AYu, Pertsov SS, Kozlov AYu. Soderzhanie tsitokinov v krovi i strukturakh golovnogo mozga u krys pri vvedenii lipopolisakharida [The content of cytokines in blood and brain structures in rats upon administration of lipo-polysaccharide]. Byull. eksper. biol. med. 2013;155(4):405-9. Russian. Afanas'eva GA, Chesnokova NP. O patogeneticheskoy vzaimosvyazi patomorfologicheskikh narusheniy i aktivatsii protsessov lipoperoksidatsii pri endotoksi-koze [On the pathogenetic relationship of pathomor-phological disorders and activation of lipid peroxidation processes in endotoxicosis]. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimental'naya terapiya. 2009;1:25-8. Russian.
Bondarenko VM, Likhoded VG. Rol' endotoksina ki-shechnoy mikroflory v fiziologiii i patologii cheloveka [The role of endotoxin in the intestinal microflora in human physiology and pathology]. Byull. Oren-burgskogo nauchnogo tsentra UrO RAN. 2012;3:1-6. Russian.
Glumov VYa, Kir'yanov NA, Bazhenov EL, Ivanov GS. Peritoneal'nyy endotoksikoz, morfologiya i morfoge-nez porazheniy biosistem eksperimental'nykh zhivot-nykh [Peritoneal endotoxicosis, morphology and morphogenesis of lesions of biosystems of experimental animals]. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 1994;12:636-9. Russian. Dudin NS, Rusak SN, Khadartsev AA, Khadartseva KA. Novye podkhody v teorii ustoychivosti biosistem -al'ternativa teorii A.M. Lyapunova [New approaches in the theory of biosystems stability - alternative to a.m. lyapunov's theory]. Vestnik novykh meditsins-kikh tekhnologiy. 2011;18(3):336. Russian. Kalashnikova SA, Kovnatskaya GA, Shchegolev AI. Morfofunktsional'naya kharakteristika pochek pri khronicheskom endotoksikoze na fone gipertireoza [Morphofunctional characteristics of the kidneys in chronic endotoxicosis against a background of hyper-thyroidism]. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2011;151(6):709-12. Russian. Markina AA. Lipopolisakharidnaya kandidat-vaktsina dlya profilaktiki endotoksinovogo i septicheskogo shoka [Lipopolysaccharide candidate vaccine for the prevention of endotoxin and septic shock] [dissertation]. Moscow (Moscow region); 2013. Russian. Mishnev OD, Shchegolev AI, Lysova NL. Pechen' i pochki pri endotoksinemii [Liver and kidneys with endotoxinemia]. Moscow: RGMU; 2003. Russian. Pisarev VB, Novochadov VV, Zaripova IV. Ul'trastruk-tura kardiomiotsitov pri patologii serdtsa, vyzvannoy khronicheskoy endogennoy intoksikatsiey i tsitostati-kami [Ultrastructure of cardiomyocytes in the pathology of the heart caused by chronic endogenous intox-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
10. Фролов Д.М., Алексеенко А.Ю., Новочадов В.В. Структурные изменения в легких при аэрозольном поступлении в организм липополисахарида, диспергированного в гидрофобной и водной фазе // Фундаментальные исследования. 2012. №10. С. 345-348.
11. Хадарцев А.А., Еськов В.М., Козырев К.М., Гон-тарев С.Н. Медико-биологическая теория и практика: Монография / Под ред. В.Г. Тыминского. Тула: Изд-во ТулГУ - Белгород: ЗАО «Белгородская областная типография», 2011. 231 с
12. Храмых Т.П. Пат. 49442 Российская Федерация, МПК7А 61 В 17/12 Устройство для моделирования геморрагической гипотензии у мелких лабораторных животных (полезная модель) /Долгих В.Т., Коршунов А.П., Золотев А.Н., Коняева Т.П., Евпак Е.А.; заявитель и патентообладатель Омская государственная медицинская академия. -№2005114898/22; заявл. 16.05.05; опубл. 27.11.05, Бюл. № 33. _ С.З.
13. Яглова Н.В. Синдром нетиреоидных заболеваний. М.: изд-во 4Мпресс, 2013. 168 с.
14. Яковлев М.Ю. Кишечный липополисахарид: системная эндотоксинемия — эндотоксиновая агрессия — SIR-синдром и полиорганная недостаточность как звенья одной цепи // Бюлл. ВНЦ РАМН. 2005. №6. С. 91-96.
15. Dong S., Zhong Y., Yang K. Intervention effect and dose-dependent response of tanreqing injection on airway inflammation in lipopolysaccharide-induced rats // J. Tradit. Chin. Med. 2013. Vol.33, №4. P. 505-512.
16. Guo J., Li F., Wu Q. Protective effects of icariin on brain dysfunction induced by lipopolysaccharide in rats // Phytomedicine. 2010. Vol.17. P. 950-955.
17. Kalashnikova S.A., Kovnatckaya G.A., Shchogo-lev A.I. Morfofunctional characteristics of the kidneys in chronic endotoxemia against the background of hyperthyroidism // Bulletin of experimental biology and medicine. 2011. Vol.151, N6. P.761-763.
18. Khin Hnin Si M., Mitaka C., Tulafu M. Inhibition of poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase attenuates lung-kidney crosstalk induced by intratra-cheal lipopolysaccharide instillation in rats // Respir. Res. 2013. Vol.14, №1. P.126.
19. Lee B., Sur B., Park J. Ginsenoside rg3 alleviates lipopolysaccharide-induced learning and memory impairments by anti-inflammatory activity in rats // Biomol. Ther. (Seoul). 2013. Vol. 21, №5. P. 381-390.
20. Min-Ji Bak., Van Long Truong, Hey-Sook Kang, Mira Jun,Woo-Sik Jeong. Anti-Inflammatory effect of
ication and cytostatics]. Vestnik VolgGMU. 2007;4(24):35-8. Russian.
Frolov DM, Alekseenko AYu, Novochadov VV. Struk-turnye izmeneniya v legkikh pri aerozol'nom postup-lenii v organizm lipopolisakharida, dispergirovanno-go v gidrofobnoy i vodnoy faze [Structural changes in the lungs when aerosolized into the body of lipopolysaccharide dispersed in the hydrophobic and aqueous phase]. Fundamental'nye issledovaniya. 2012;10:345-8. Russian.
Khadartsev AA, Es'kov VM, Kozyrev KM, Gonta-rev SN. Mediko-biologicheskaya teoriya i praktika [Medico-biological theory and practice]: Monografiya / Pod red. V.G. Tyminskogo. Tula: Izd-vo TulGU -Belgorod: ZAO «Belgorodskaya oblastnaya tipogra-fiya»; 2011. Russian.
Khramykh TP. Pat. 49442 Rossiyskaya Federatsiya, MPK7A 61 V 17/12 Ustroystvo dlya modelirovaniya gemorragicheskoy gipotenzii u melkikh laborator-nykh zhivotnykh (poleznaya model') /Dolgikh V.T., Korshunov A.P., Zolotev A.N., Konyaeva T.P., Evpak E.A.; zayavitel' i patentoobladatel' Omskaya gosu-darstvennaya meditsinskaya akademiya. -№2005114898/22; zayavl. 16.05.05; opubl. 27.11.05, Byul. № 33. _ S.Z. Russian.
Yaglova NV. Sindrom netireoidnykh zabolevaniy [Syndrome of non-thyroid diseases]. Moscow: izd-vo 4Mpress; 2013. Russian.
Yakovlev MYu. Kishechnyy lipopolisakharid: sistem-naya endotoksinemiya — endotoksinovaya agressiya — SIR-sindrom i poliorgannaya nedostatochnost' kak zven'ya odnoy tsepi [Intestinal lipopolysaccharide: systemic endotoxinemia - endotoxin aggression -SIR-syndrome and multi-organ failure as links in one chain]. Byull. VNTs RAMN. 2005;6:91-6. Russian. Dong S, Zhong Y, Yang K.Intervention effect and dose-dependent response of tanreqing injection on airway inflammation in lipopolysaccharide-induced rats. J. Tradit. Chin. Med. 2013;33(4):505-12.
Guo J, Li F, Wu O. Protective effects of icariin on brain dysfunction induced by lipopolysaccharide in rats. Phytomedicine. 2010;17:950-5. Kalashnikova SA, Kovnatckaya GA, Shchogolev AI. Morfofunctional characteristics of the kidneys in chronic endotoxemia against the background of hyperthyroidism. Bulletin of experimental biology and medicine. 2011;151(6):761-3. Khin Hnin Si M, Mitaka C, Tulafu M. Inhibition of poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase attenuates lung-kidney crosstalk induced by intratra-cheal lipopolysaccharide instillation in rats. Respir. Res. 2013;14(1):126.
Lee B, Sur B, Park J. Ginsenoside rg3 alleviates lipo-polysaccharide-induced learning and memory impairments by anti-inflammatory activity in rats. Biomol. Ther. (Seoul). 2013;21(5):381-90. Min-Ji Bak, Van Long Truong, Hey-Sook Kang, Mira Jun,Woo-Sik Jeong. Anti-Inflammatory effect of pro-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 2 - P. 209-219
procyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-Induced RAW 264.7 Cells // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2013. Vol. 2013 (2013), Article ID 409321, 11 pa-
geshttp://dx.doi.org/10.1155/2013/409321
21. Miriam Noa, Rosa Más, Maikel Valle, Sarahí Mendoza, and Nilda Mendoza // Iran J. Pharm. Res. 2012. Vol.11, №4. P. 1201-1208.
22. Parajuli B.L., Sonobe Y., Kawanokuchi J. GM-CSF increases LPS-induced production of proinflammato-ry mediators via upregulation of TLR4 and CD14 in murine microglia // J. Neuroinflammation. 2012. Vol.13, №9. P. 268.
23. Park B.S.L., Lee J.O. Recognition of lipopolysac-charide pattern by TLR4 complexes // Exp. Mol. Med. 2013. Vol. 6. P. 45.
24. Rui Zhang, Ming Zhao, Hai-jie Ji. Study on the dynamic changes in synaptic vesicle-associated protein and axonal transport protein combined with LPS neuroinflammation model // Published online 2013 September 24. DOI: 10.1155/2013/496079 ISRN -Neurol. 2013; 2013: 496079.
25. Rupak Chowdhury, Ramadevi Nimmanapalli, Thomas Graham, et al. Curcumin Attenuation of Li-popolysaccharide Induced Cardiac Hypertrophy in Rodents Inflamm. 2013. Published online Oct 21, 2013. doi: 10.1155/2013/539305Yeon-Hui Jeong, Jin-Won Hyun L. Tien Kim Van Le et al. // Biomol. Ther. 2013. Vol. 21, №5. P. 332-337.
26. Zhong-hua Wang L., Yan-bing Liang, Hao Tang. Dexamethasone down-regulates the expression of microRNA-155 in the livers of septic mice // Published online 2013 November 11. doi: 10.1371/journal.pone.0080547 PLoS One. 2013; 8(11): e80547.
cyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-Induced RAW 264.7 Cells // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2013. Vol. 2013 (2013), Article ID 409321, 11 pa-geshttp://dx.doi.org/10.1155/2013/409321 Miriam Noa, Rosa Más, Maikel Valle, Sarahí Mendoza, and Nilda Mendoza. Iran J. Pharm. Res. 2012;11(4):1201-8.
Parajuli BL, Sonobe Y, Kawanokuchi J. GM-CSF increases LPS-induced production of proinflammatory mediators via upregulation of TLR4 and CD14 in murine microglia. J. Neuroinflammation. 2012;13(9):268.
Park BSL, Lee J.O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Exp. Mol. Med. 2013;6:45.
Rui Zhang, Ming Zhao, Hai-jie Ji. Study on the dynamic changes in synaptic vesicle-associated protein and axonal transport protein combined with LPS neuroinflammation model. Published online 2013 September 24. DOI: 10.1155/2013/496079 ISRN - Neurol. 2013; 2013: 496079.
Rupak Chowdhury, Ramadevi Nimmanapalli, Thomas Graham, et al. Curcumin Attenuation of Lipopolysac-charide Induced Cardiac Hypertrophy in Rodents Inflamm. 2013. Published online Oct 21, 2013. doi: 10.1155/2013/539305Yeon-Hui Jeong, Jin-Won Hyun L. Tien Kim Van Le et al. Biomol. Ther. 2013;21(5):332-7.
Zhong-hua Wang L, Yan-bing Liang, Hao Tang. Dex-amethasone down-regulates the expression of micro-RNA-155 in the livers of septic mice. Published online 2013 November 11. DOI:
10.1371/journal.pone.0080547 PLoS One. 2013; 8(11): e80547.
