CC BY
72
© В. Л. Сидоров, О. Д. Ягмуров, 2010 г. УДК 577.322.4:616-079.6
В. Л. Сидоров, О. Д. Ягмуров
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА В ЭКСПЕРТИЗЕ ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВ
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Бюро судебно-медицинской экспертизы, Санкт-Петербург
После выявления на вещественных доказательств следов биологического происхождения, например, крови, необходимо определить их вид, т. е. установить, принадлежат ли они человеку или животному. Наиболее известным и широко применяемым в судебно-медицинской практике методом является реакция преципитации, предложенная Ф. Я. Чистовичем (1899) [17]. Эта реакция в первые годы двадцатого столетия была применена для определения видовой принадлежности крови в пятнах [42].
При работе с мутными вытяжками, когда центрифугирование и фильтрование не позволяют устранить замутнение, целесообразно реакцию преципитации осуществлять в агаре [30]. В. И. Чарный [15, 16] внес в эту реакцию ряд ценных модификаций, и она до сих пор применяется в судебно-медицинской практике. Эта реакция имеет чувствительность, в 2-10 раз меньшую, чем реакция преципитации в жидкой среде [10].
Наиболее часто и широко применяемой реакцией для установления видовой принадлежности биологических объектов является реакция иммуноэлектрофо-реза. Отечественные исследователи [1, 6] внесли в эту реакцию ряд существенных добавлений для удобства использования ее в практике. Данная реакция позволяет установить видовую принадлежность крови при разведении ее сыворотки 1:100 000.
В. П. Ольховик (1986) [9], а также В. В. Томилин и соавт. (1989) [12] для определения видовой принадлежности биологических объектов предложили метод встречного иммуноэлектрофореза на ацетатцеллюлоз-ной пленке, который в последнее время получил широкое распространение в судебно-медицинской практике. Предлагается также методика установления видовой принадлежности крови методом непрямой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) [8].
На сегодняшний день в отечественной судебно-медицинской практике для определения видовой принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательствах наиболее широко применяется метод кольцепре-ципитации, а также встречного иммуноэлектрофореза в агаре и на ПАЦ [2, 12-14]. Кроме того, в Главном бюро СМЭ РФ в Москве применяется обти-тест, который обладает достаточно высокой чувствительностью
и позволяет одновременно определять как наличие крови, так и принадлежность ее человеку [3].
В зарубежных странах для установления видовой принадлежности крови и других биологических объектов по IgG широко используется метод иммунофер-ментного анализа (ИФА) [5]. Его применяют, в частности, для установления видовой принадлежности крови [43], слюны [22] и костей [21]. В отечественной медицинской практике уровень IgG в сыворотке человека определяют в клинических целях [7].
Методикой, получившей широкое распространение в 80-90-е гг., является метод жидкостной хроматографии и жидкостной хроматографии с обратной фазой [24]. Достаточно большое внимание в зарубежной литературе уделено также установлению видовой принадлежности биологических объектов молекулярно-генетическими методами [44].
Установление наличия спермы на вещественных доказательствах в судебно-медицинской практике является достаточно сложным и трудоемким исследованием. Методы, применяемые с этой целью, можно разделить на две группы: ориентировочные (либо предварительные) и доказательные. Ориентировочные методы позволяют судебно-медицинскому эксперту найти участки и пятна, в которых доказательными методами устанавливают присутствие спермы.
В настоящее время в современных отечественных судебно-медицинских лабораториях для установления наличия спермы на исследуемых объектах применяют в основном морфологические методы [2, 13, 14].
В международной практике для достоверного установления наличия спермы при исследовании вещественных доказательств широкое применение получили иммунологические методы, основанные на обнаружении простатического специфического антигена, в частности, метод иммуноферментного анализа (ИФА) [25] и метод иммунохроматографии [27].
Простатический специфический антиген человека (ПСА) (англ. Prostate Specific Antigen или P30) является белком, который продуцирует только человеческая простата. Это обстоятельство позволяет использовать его для обнаружения спермы и одновременно установления ее видовой принадлежности [26]. Указанный антиген присутствует в семенной жидкости даже в случаях полной азооспермии, что позволяет доказательно устанавливать наличие спермы на вещественных доказательствах в тех случаях, когда морфологическими методами этот факт установить невозможно. В современной судебно-медицинской практике случаи азооспермии и олигозооспермии встречаются чаще, чем 15-20 лет назад. Возможно, это связано с ростом в России наркомании, а также с массовым употреблением недоброкачественных спиртных напитков. Это предположение требует дополнительных детальных исследований.
Отечественных публикаций, в которых бы упоминалось об установлении видовой принадлежности биологических объектов либо установлении спермы в пятнах
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
на вещественных доказательствах методами ИФА в России или в ближнем зарубежье, нами не было найдено.
Существуют и другие возможности применения ИФА для судебно-медицинского исследования вещественных доказательств.
В отечественной литературе освещается применение ИФА для выявления группоспецифических антигенов системы АВО крови [11] и выделений [4].
В зарубежных лабораториях метод ИФА широко применяется для установления групповой принадлежности по системе АВО пятен крови [32], выделений [23], волос [19]. Кроме того, с помощью данной методики устанавливают наличие спермы на объектах-носителях [27].
Имеются также публикации о выявлении антигенов системы Lewis [20], HLA [18], Rh [29], а также антигена G1m(3), антигенов G3m(16), G3m(21) [22], Gm(11) [37] в пятнах крови и слюны различными модификациями ИФА.
Ряд японских исследователей применяют различные модификации ИФА для определения органоспецифи-ческих антигенов печени [35] мозга [36], а также сердца [45], печени и тонкого кишечника [39, 40] в пятнах на вещественных доказательствах. H. Tsutsumi et al. [41] предлагают использовать твердофазный ИФА для установления наличия мочи в пятнах на вещественных доказательствах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барсегянц, Л. О. Определение видовой принадлежности пота. Сообщение 2 / Л. О. Барсегянц // Судебно-мед. экспертиза. - 1974. - Т. 17. - № 2. - С. 33-35.
2. Барсегянц, Л. О. Судебно-медицинская экспертиза вещественных доказательств / Л. О. Барсегянц // Судебная медицина / под ред. проф. В. В. Томилина. - М., 1997. - С. 241-278.
3. Гуртовая, С. В. Использование обти-теста для установления наличия и видовой принадлежности крови в пятнах / С. В. Гуртовая, Л. Н. Тучик, О. В. Курдзиева // Судебно-мед. экспертиза. - 1999. - Т. 44. - № 5. - С. 23-25.
4. Дерюгина, Е. И. Моноклональные антитела к группоспе-цифическому антигену человека / Е. И. Дерюгина [и др.] // Судебно-мед. экспертиза. - 1989. - Т. 32. - № 4. - С. 36-38.
5. Егоров, А. М. Теория и практика иммуноферментного анализа / А. М. Егоров. - М., 1991. - 288 с.
6. Ильина, Е. А. Одновременное установление наличия и принадлежности крови человеку (приматам), птицам и рыбам методом электрофореза / Е. А. Ильина // Судебно-мед. экспертиза. - 1991. - Т. 34. - № 1. - С. 28-32.
7. Кетлинский, С. А. Иммунология для врача / С. А. Кетлинский, Н. М. Калинина. - СПб., 1998. - 156 с.
8. Кисин, М. В. Смешанная агглютинация при исследовании некоторых объектов судебно-медицинской экспертизы / М. В. Кисин, Т. В. Стегнова // Судебно-мед экспертиза. - 1973. -Т. 16. - № 1. - С. 22-26.
9. Ольховик, В. П. Применение электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы при установлении видовой специфичности белка / В. П. Ольховик // Судебно-мед. экспертиза. - 1986. -Т. 29. - № 3. - С. 32-36.
10. Попов, В. Л. Судебная медицина / В. Л. Попов. - СПб., 1994. - 287 с.
11. Руковишникова, Г. Е. Выявление растворимых антигенов групп крови АВН с помощью иммуноферментного анализа / Г. Е. Руковишникова, М. И. Потапов, Е. Р. Сигал // Журн.
микробиол., эпидимиол. и иммунобиол. - 1985. - № 1. -С. 69-73.
12. Томилин, В. В. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств / В. В. Томилин, Л. О. Барсегянц, А. С. Гладких. - М., 1989. - 303 с.
13. Туманов, А. К. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств / А. К. Туманов. - М., 1961. - 576 с.
14. Туманов, А. К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств / А. К. Туманов. - М., 1975. - 407 с.
15. Чарный, В. И. Методика дифференцирования белков филогенетически близких видов животных при помощи реакции преципитации в агаре / В. И. Чарный // Актуальные вопр. судебной мед. и криминалистики. - Л., 1966. - С. 145-148.
16. Чарныш, В. И. Реакция преципитации в агаре как метод дифференцирования белков филогенетически близких животных. Сообщение 2 / В. И. Чарный // Судебно-мед. экспертиза. -1967. - Т. 10. - № 2. - С. 41-45.
17. Чистович, Ф. Я. Изменения свойств крови при впрыскивании инородной сыворотки крови в связи с теорией иммунитета Эрлиха / Ф. Я. Чистович // Рус. арх. патол., клин. медиков и бактериол. - 1899. - июль. - С. 21-37.
18. Bishara, A. A sensitive and specific ELISA using monoclonal capture antibodies for the detection of HLA antigens in blood stains / A. Bishara, C. Brautbar // J. Immunol. Methods. - 1989. -Vol. 120. - № 1. - P. 99-103.
19. Biwasaka, H. Detection of ABH blood group antigens from minute human hairs using polivinylidene difluoride membrane with elution-ELISA method / H. Biwasaka, N. Nakayashiki, Y. Aoki // Nippon Hoigaku Zasshi. - 1998. - Vol. 52. - № 1. - P. 37-41.
20. Busuttil, A. Assessment of Lewis blood group antigens and secretor ststus in autopsy speciment / A. Busuttil [et al] // Forensic Sci. Int. - 1993. -Vol. 61. - № 2-3. - P. 133-140.
21. Cattaneo, C. Reliable identification of human albumin in ancient bone using ELISA and monoclonal antibodies / C. Cattaneo [et al] // Am. J. Phys. Anthropol. - 1992. - Vol. 87. - № 3. - P. 365-372.
22. Fletcher, S. M. Bloodstain allotyping : an ELISA method for G1m(3) / S. M. Fletcher, M. J. Dorrill, P. Dolton // Dev. Biol. Stand. - 1984. - Vol. 57. - P. 381-384.
23. Hamada, K. A simple dot enzyme-linked immunosorbent assay for ABO blood typing of biological fluid and stains : effects of heating samples / K. Hamada [et al] // Leg. Med. (Tokyo). - 2002. -Vol. 4. - № 4. - P. 217-222.
24. Inoue, H. Sensitive detection of human globin chains by microbore high-performance liquid chromatography and its forensic application / H. Inoue [et al] // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. -1997. - Vol. 24. - № 2. - P. 221-227.
25. Johnson, E. D. Detection of prostate specific antigen by ELISA / E. D. Johnson [et al] // J. Forensic Sci. - 1993. - Vol. 38. -№ 2. - P. 250-258.
26. Kamenev, L. An enzyme immunoassay for prostate-specific p30 antigen detection in postcoital vaginal tract / L. Kamenev [et al] // J. Forensic Sci. Soc. - 1989. - Vol. 29. - № 4. - P. 233-241.
27. Mather, J. Evaluation of the BioSign membrane tests for the identification of semen stains in forensic casework / J. Mather [et al] // N. Z. Med. J. - 2002. - Vol. 8. - № 1147. - P. 48-49.
28. Matsubara, K. A novel assay for typing Rh antigens in blood-stains using a lectin specific to the bisecting N-acetyl-D-glucosamine side chain of glycoprotein / K. Matsubara [et al] // Immunol. Methods. - 1994. - Vol. 1. - № 2. - P. 175-180.
29. Matsubara, K. A unique and sensitive ELISA technique for typing ABH antigens in bloodstains using UEA-I lectin - the removal of detergent with a Sephadex G-25 mini-column improves sensitivity / K. Matsubara [et al] // J. Forensic Sci. - 1996. - Vol. 41. - № 1. -P. 35-39.
30. Ouchterlony, O. Antigen antibody reaction in gels / O. Ouchterlony // Acta path. microbiol. scand. - 1953. - Vol. 32. -P. 231-233.
31. Pflug, W. ABO and Lewis typing of stains on nitrocellulose membranes using a new dot-blot ELISA technique / W. Pflug,
G. Bassler, B. Eberspacher // Forensic Sci. Int. - 1989. - Vol. 43. -№ 2. - P. 171-182.
32. Rieben, R. Specificity of monoclonal antibodies against ABH and related stractures tested by ELISA with synthetic glycocon-jugates / R. Rieben [et al] // Transfus. Clin. Biol. - 1997. - Vol. 4. -№ 1. - P. 47-54.
33. Schroeder, W. A. High performance liquid chromatographic separation of globin chains of nonhuman hemoglobins / W. A. Schroeder [et al] // Hemoglobin. - 1985. - Vol. 9. - № 5. - P. 461-482.
34. Seo, Y. A sandwich enzyme immunoassay for liver-specific antigen and its forensic evaluation / Y. Seo, K. Takahama // Nippon Hoigaki Zassi. - 1992. - Vol. 46. - № 3. - P. 169-176.
35. Seo, Y. A highly sensitive sandwich enzyme immunoassay for human liver-specific antigen (LSA) and its forensic application / Y. Seo, K. Takahama // Nippon Hoigaki Zassi. - 1994. - Vol. 48. -№ 3. - P. 150-155.
36. Seo, Y. A Sandvich enzyme immunoassay for brain S-100 protein and its forensic application / Y. Seo, E. Kakizaki, K. Takahama // Forensic Sci. Int. - 1997. - Vol. 6. - № 2. -P. 145-154.
37. Tahir, M. A. Gm(11) grouping of dried bloodstains / M. A. Tahir // J. Forensic Sci. - 1984. Vol. 29. - № 4. - P. 1178-1182.
38. Tajima, M. Comparative studies between counterimmuno-electrophoresis and microprecipitation method of identification of human minute bloodstains / M. Tajima, K. Tokiwa, S. Katsura // Z . Rechtsmed. - 1988. - Vol. 99. - № 4. - P. 227-233.
39. Takahama, K. Medico-legal studies on detection of organ-specific antigens. Article in Japanese / K. Takahama // Nippon Hoigaku Zasshi. - 1993. - Vol. 47. - № 6. - P. 445-455.
40. Takahama, K. Forensic application of organ-specific antigens / K. Takahama // Forensic Sci. Int. - 1996. - Vol. 22. - № 1-2. -P. 63-69.
41. Tsutsumi, H. Identification of human urinary stains by enzyme-linked immunosorbent assay for human uromucoid /
H. Tsutsumi [et al] // J. Forensic Sci. - 1988. - Vol. 33. - № 1. -P. 237-243.
42. Ulenhuth, P. Eine Methode zur Unterscheidung der vershei-denen Blutareten / P. Ulenhuth // Dtsh. Med. Wschr. - 1901. -Bd. 67. - S. 82-83.
43. Yamamoto, Y. Species identification of blood and bloodstains by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-human immunoglobulin kappa light chain monoclonal antibody / Y. Yamamoto, A. Tsutsumi, H. Ishizu // Forensic Sci Int. - 1989. -Vol. 40. - № 1. - P. 85-95.
43. Zhang, W. J. Allele frequencies and species specificity of six short tandem repeat loci in Chinese population. Article in Chinese / W. J. Zhang [et al]. - 2004. - P. 587-590.
44. Zhou, W. Usage of double immuno-enzyme labeled staining method for forensic pathology / W. Zhou [et al] // Fa. I. Hsueh Tsa Chin. - 1997. - Vol. 13. - № 1. - P. 18-19.
РЕЗЮМЕ
В. Л. Сидоров, О. Д. Ягмуров
Использование метода иммуноферментного анализа в экспертизе вещественных доказательств
Представлен обзор литературы, как отечественных, так и зарубежных авторов, по применению иммуноферментного анализа при исследовании вещественных доказательств. Вышеуказанный метод сравнивается с другими современными методиками, применяемыми в России. Раскрываются большие возможности и преимущества иммуноферментного анализа при использовании его в судебно-медицинской практике.
Ключевые слова: иммуноферментный анализ, вещественные доказательства.
SUMMARY
V. L. Sidorov, O. D. Yagmurov
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in examination of material evidences
The paper presents a review of domestic and foreign literature on application of ELISA in examination of material evidences. The assay is compared with other modern techniques applied in Russia. The authors display wide possibilities and advantages of the ELISA method in medicolegal practice.
Key words: ELISA, material evidences.
© Коллектив авторов, 2010 г. УДК 616.379-008.64:575
А. А. Быстрова, А. Н. Войтович, Е. И. Красильникова, О. А. Беркович, Е. И. Баранова, В. И. Ларионова, Е. В. Шляхто
Б19Ш ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА АПОЛИПОПРОТЕИНА А5 У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА
Кафедра факультетской терапии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова; Лаборатория молекулярной диагностики Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии
Ведущей причиной ранней инвалидизации и смертности больных сахарным диабетом (СД) 2 типа являются сердечно-сосудистые заболевания, связанные с атеросклеро-тическим поражением коронарных артерий, сосудов головного мозга, нижних конечностей [6, 10, 13, 17, 20]. Установлено, что более половины больных на момент постановки диагноза сахарного диабета имеют признаки коронарного атеросклероза, а 75 % госпитализаций пациентов связаны с сердечно-сосудистыми заболеваниями [8].
Основным фактором, определяющим высокий риск макрососудистых осложнений у больных СД 2 типа, является имеющаяся у большинства пациентов атероген-ная дислипидемия [7]. В настоящее время не вызывает сомнения, что в основе нарушений липидного метаболизма в большинстве случаев лежат изменения структуры и функции аполипопротеинов [5, 9]. Известно, что липидные составляющие липопротеиновых частиц главным образом определяются воздействием факторов внеш-
