CC BY
88
дебных экспертиз. По нашему мнению, наиболее перс- тики специализированных аппаратно-технических пективным направлением исследовательской работы средств, а также количественных критериев субъектив-данного направления является разработка объективных ных экспертных оценок характеристик указанных при-критериев выбора экспертов, оценивающих характерис- боров.
Литература:
1. Васнецова О.А. Медицинский и фармацевтический маркетинг // Тезисы доклада на семинаре «Роль фармацевтического товароведения в подготовке провизоров и перспективы развития этой дисциплины». — Пятигорск, 1990. — С. 5-6.
2. Васнецова О.А. Маркетинг и фармацевтическое товароведение // Тезисы докладов на итоговой научно-практической конференции ММА им. И.М. Сеченова. — Москва, 1991. — С. 256.
3. Васнецова ОА Введение в медицинский и фармацевтический маркетинг // Экономика здравоохранения. —1996. —№3. — С. 23-26.
4. Васнецова О.А. Маркетинг в фармации. — М.: Книжныймир, 1999. — С. 104-107.
5. Васнецова ОА Маркетинговое управление здравоохранением // Управление здравоохранением. — 2000. — №1. — Вып. 1. — С. 68-77.
6. Васнецова О.А Маркетинг в здравоохранении // Управление здравоохранением. — 2001. — №2. — Вып. 1. — С. 81-86.
7. Котлер Ф. Основы маркетинга: Пер. с англ. — М.: Прогресс, 1990. — 736 с.
8. Котлер Ф. Маркетинг менеджмент. — С.-Пб.: ПитерКом, 1998. — 896 с.
9. КотлерФ., Армстронг Г., СондерсД., Вонг В. Основы маркетинга: Пер. с англ. —2-еевроп. изд. — СПб.:Изд. дом «Вильяме», 1998. — 1056с.
10. Краснокутский А.Б., Лагунова А.А. Фармаэкономика. / Системный анализ мирового фармацевтического рынка. —Научн. ред. Падалкин В.П. —М.: Классик-Колсалтинг, 1998. — Т. 1. — 344 с.
11. Ламбен Жан-Жак Стратегический маркетинг. Европейская перспектива. Пер. с франц. — СПб.: Наука, 1996. — 589 с.
12. Хвещук П.Ф., Рудакова А.В. Основы доказательной фармакотерапии. — СПб.: ВМедА, 2000. —169 с.
13. Хвещук П.Ф., Рудакова А.В. Формуляр лекарственных средств: методология разработки. — СПб.: ВМедА, 2002. — 183 с.
14. Chren M.M., Landefeld C.S. Physicians’ behaviour and their interactions with drug companies // JAMA. — 1994. — P. 684-689.
15. Drucker P. Management Tasks,Responsibilities,Practices. —NY: Harper&Row, 1973. —Р. 64-65.
16. Evanson N. Pricing Decision for Products and Services. Effective Pharmacy Management. — NARD Virginia, 1994. — 694 p.
17. Janknegt R., Steenhoek A. The System of Objectified Judgement Analysis (SOJA). A tool in rational drug selection for formulary inclusion // Drugs, 1997; 53(4): 550-562.
18. Smith M. C. Principles of Pharmaceutical Marketing. — Ed. S. Copyringt 1983 by Lea & Febiger. — Philadelphia, 1983. — 529 p.
19. Steenhoek A., Janknegt R., OldenhofH.G.J. SOJAsysteem: hulp bij belangrijke keuzemomenten in defarmacie // Pharm. Weekbi, 1988; 123:75-79.
20. The AUPHA Health Services Management / ed. by Taylor R.T., Tailor S.B. AUPHAAspen Publishers Inc.,Gaithersburg,Maryland,1994. — 652p.
21. Wazana A. Physicians and the pharmaceutical industry // JAMA, 2000; 283 (3): 373-380.
© В.Л. Сидоров, M.B. Маяцкая, Ю.А. Молин, 2004 УДК 340. 624.412
В.Л. Сидоров, М.В. Маяцкая, Ю.А. Молин О ВОЗМОЖНОСТЯХ УСТАНОВЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ В ПЯТНАХ НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНГНОГО АНАЛИЗА
Бюро судебно-медицинской экспертизы (нач. — проф. Г.И. Заславский) комитета по здравоохранению Ленинградской области
В статье проводится сравнительный анализ отечественных и зарубежных методов, применяемых в судебно-медицинской практике для установления видовой принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательствах. Освещаются возможности применения для этой цели IgG человека и твердофазного имму-ноферментного анализа с использованием девяностошестилуночных полистирольных планшет. По сравнению с рутинными методами, данная методика имеет в 100 раз большую чувствительность, дает объективную регистрацию результатов реакции с последующей компьютерной обработкой, требует значительно меньших материальных затрат на расходные материалы, чем методы кольцепреципитации, а также встречного иммуноэлектрофореза в агаре и на ПАЦ.
Ключевые слова: вещественные доказательства, видовая принадлежность крови, пятна крови, IgG человека, твердофазный ИФА.
ESTIMATION OF BLOOD SPECIFIC CHARACTERISTICS IN STAINS ON THE MATERIAL PROOF BY HARDPHASE IMMUNE-ENZYME ANALYSIS V.L. Sidorov, M. V. Mayatskaya, Ju.A. Mol in
Comparative analysis of domestic and foreign methods, which are used in forensic medicine for estimation of blood specific characteristics in stains on the material proof. For this aim it is possible to use male IgG and hardphase immune-enzyme analysis with 96-button polystyrene plate usage. In comparison with other routine methods this method is more sensitivity, allow to receive objective results with further computer processing, is not so expensive.
Key words: blood specific characteristics, hardphase immune-enzyme analysis.
После выявления на вещественных доказательствах следов биологического происхождения, например крови, необходимо определить их вид, то есть установить, принадлежат ли они человеку или животному. Необходимость проведения такого исследования, с одной стороны, вызвана
тем, что нередко обстоятельства происшествия позволяют предположить принадлежность объектов на вещественных доказательствах не только человеку, но и животному, а с другой — определением групповой принадлежности следов, которое нельзя проводить без предварительного уста-
новления видовой принадлежности. Для определения видовой специфичности белков в судебно-медицинской практике, как правило, применяют иммунологические методы исследования. Наиболее известным и широко применяемым методом является реакция преципитации, предложенная в 1899 г. [13]. Эта реакция в первые годы двадцатого столетия была применена для определения видовой принадлежности крови в пятнах [23].
Наиболее часто применяемой реакцией для установления видовой принадлежности биологических объектов является реакция иммуноэлектрофореза [20], а также встречного иммуноэлектрофореза [ 14,17,21]. Отечественные исследователи [1,6,12] внесли в эту реакцию ряд существенных добавлений для удобства использования в практике. Данная реакция позволяет установить видовую принадлежность крови при разведении ее сыворотки 1:100000. В.П. Ольховик. [7], а также В.В. Томилин и соавт. [9] для определения видовой принадлежности биологических объектов предложили метод встречного иммуноэлектрофореза на ацетат целлюлозной пленке (ПАЦ), который в последнее время получил широкое распространение в судебно-медицинской практике.
В отечественной судебно-медицинской практике для определения видовой принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательствах наиболее широко применяется метод кольцепреципитации, а также встречного иммуноэлектрофореза в агаре и на ПАЦ [2,9,10,11]. Кроме того, в Российском центре судебно-медицинской экспертизы М3 применяется обти-тест, который обладает высокой чувствительностью и позволяет одновременно определять как наличие крови, так и принадлежность ее человеку [3].
В зарубежных странах для установления видовой принадлежности крови и других биологических объектов по IgG широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА). Его применяют, в частности, для установления видовой принадлежности крови [16,22,25] и костей [15]. В отечественной литературе освещается применение ИФА для выявления группоспецифических антигенов системы АВО крови [8] и выделений [4]. Публикаций, в которых бы упоминалось об установлении видовой принадлежности биологических объектов методом ИФА в доступной литературе нами не найдено.
В начале 1970-хгг. [5,18,24] поиски простыхчувстви-тельных методов выявления и количественного определения антигенов и антител без применения агглютинации частиц или радиоактивных меток привели к разработке твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (от англ. ezyme-l inked immunosorbent assay) [1824]. Данный метод,так же как и радиоиммунологический анализ (РИА), более точен и воспроизводим, чем методы, основанные на агглютинации и не требует применения радиоактивных реагентов, что делает его более доступным по сравнению с РИА. Принцип метода состоит в использовании антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментами — конъюгатов. Присоединяясь к образовавшимся на твердой фазе иммунным комплексам, конъюгат способствует их выявлению (после отмывания избытка реагентов) в результате реакции фермента с хромогенным субстратом. Результаты анализа учитывают визуально и инструментально по оптической плотности окрашенных продуктов реакции. Такой подход во многом приближается к «идеальной иммунометрии»: он универсален, надежен, методически прост, требует минимального расхода реагентов и благодаря использованию твердой фазы позволяет легко отмывать не связавшиеся компонен-
ты, устраняя их влияние на последующие этапы реакции. Различные методы усиления сигнала в субстрате, такие, как использование люминесценции (для гемотеста используется американский буфер для люминесцентного ИФА) и каскадных ферментативных реакций, могут повысить чувствительность некоторых вариантов ИФА до уровня РИА, применяемого для определения гормонов. В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы. В раннихразработках, как правило, использовали пластмассовые пробирки, на смену которым быстро пришли панели для титрования с лунками, имеющими плоское прозрачное дно, удобные для измерения оптической плотности продуктов реакции на специальных приборах—ИФА-ридерах (от англ. to read — читать).
Нами была проведена серия экспериментов, а также ряд практических экспертиз по установлению видовой принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательствах по IgG методом твердофазного ИФА с использованием 96 луночных полистирольных планшет.
Материалы и методы исследования. Для постановки твердофазного ИФА использовали: 96 луночные планшеты с плоским дном «ГОСНИИМЕДПОЛИМЕР»; шейкер-инку-батор «Bellco Glase inc.»; автоматический вошер «Elx50»; автоматический ридер «Elx800»; антитела против IgG И-45,4 мг/ мл разведение 1:1000; пероксидазный конъюгат против IgG МАТ-И-5 разведение 1:20; буфер адсорбции или присоединения (покрывающий или посадочный буфер) 0,02М; карбо-нат-бикарбонатный буфер (КББ) рН9,5-9,7; фосфатно-солевой буфер — PBS; буферный раствор для разведения перок-сидазных сывороток (к 1 л PBS добавляли 0,5 мл детергента Твин-20); стоп-реагент—раствор серной кислоты в концентрации 0,5 моль/литрв 15 мл дистиллированной воды добавляли 1 мл серной кислоты; субстратный раствор тетраметил-бензидина (ТМБ) ООО «Протеиновый контур».
Метод твердофазного иммуноферментного анализа основан на использовании меченых антител и иммобилизованных антител. К носителю с иммобилизованными антителами (в данном случае против IgG) добавляется раствор, содержащий анализируемый антиген (сыворотка человека или экстракт из пятна навещественном доказательстве в физиологический раствор). Затем планшет отмывается от несвязанных антител. На второй стадии связавшийся в лунках IgG обрабатывается конъюгатом к IgG с пероксидазой (антитела, меченные пероксидазой и иммобилизованные в лунках планшета антитела специфичны к разным участкам молекулы IgG). После вторичной инкубации и отмывания избытка конъюгата образовавшиеся иммунные комплексы выявляют ферментативной реакцией с перекисью водорода в присутствии хромогена (тетраметилбензидина). После остановки пероксидазной реакции стоп-реагентом результаты учитываются фотометрически. Таким образом, на стадии выявления сецифического иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широко распространения в литературе названия «сэндвич» — метод (англ. sandwich). В литературе встречается и другое его названия —двуцентровой метод ИФА (англ. two-site assay) [5]. Последовательность проведения реакции:
— внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл антител против IgG;
— инкубация в течение 1 часанашейкереи в течение 18 часов на столе при температуре +18-20°С;
— промывание 5 раз на вошере Е1х50 и полное удаление жидкости.
внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл контрольных и исследуемых проб; инкубация в течение 2 часов на шейкере при температуре + 18-20°С;
промывание 5 раз на вошере Е1х50 и полное удаление жидкости;
внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл конъюгата;
инкубация на шейкере в течение 1 часа при температуре + 18-20°С;
промывание 5 раз на вошере Е1х50 и полная аспирация жидкости;
внесение в лунки полистирольного планшета по 100 мкл субстратного раствора тетраметилбензидина (ТМБ) инкубация 10-15 минут при температуре +18-20°С;
— внесение в лунки полистирольного планшета по 50 мкл стоп-реагента;
— регистрация результатов реакции фотометрически на ридере Elx800 при длине волны 450 нм;
— распечатка результатов на IBM PC с помощью написанного нами шаблона в приложении «Excel» для Windows. Для исследования методом ИФА использовали человеческую изосыворотку р, в разведениях от 1:100 до 1:20000000. Кроме того, применяли физиологический раствор, антиген птицы, рогатого скота и антиген свиньи в разведениях 1:1000.
Обсуждение результатов
При проведении ИФА положительный результат был получен с человеческой изосывороткой р вразведениях от 1:100 до 1:2000000 (оптическая плотность от 3,774 до 0,371).
Таблица 1.
Зависимость оптической плотности, измеренной посредством ридера Е1х800 в лунках планшета, от разведения изосыворотки в человека
Разведение изосыворотки человека (отрицательный контроль) ИФА (M±m) с сывороткой анти-IgG Встречный иммуноэлектрофорез
100 3,6±0,09 +
1000 2,8±0,18 +
10000 2,6±0,18 +
100000 1,9±0,45 ±
1000000 1,4±0,46 -
2000000 0,9±0,24 -
4000000 0,8±0,25 -
8000000 0,7 ±0,17 -
10000000 0,5±0,1 -
20000000 0,14±0,03 -
Отрицательный контроль 0,14±0,02 -
В разведении 1:20000000, с физиологическим раствором, а также с антигенами птицы, свиньи и рогатого скота выявлен отрицательный результат (оптическая плотность от 0,116 до0,131) реакции. Анализируя данные таблицы 1,можно сделать вывод, что разведение 1:10000000 является порогом чувствительности описанной нами реакции твердофазного ИФА. Из представленных данных также следует, что чувствительность нашей модификации твердофазного ИФА для установления видовой принадлежности крови по челове-
ка значительно (в 100 раз) выше, чему применяемой в судебно-биологических исследованиях реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ). При изучении интенсивности оптической плотности в лунках с различными разведениями изосыворотки человека установлена сильная обратная корреляционная зависимость (г =-0,76).
Кроме того, по сравнению с традиционно применяемыми для судебно-медицинского исследования вещественных доказательств методиками твердофазный иммунофер-ментный анализ обладает целым рядом существенных преимуществ.
Преимущества ИФА:
1. Повышение порога чувствительности и объективизации регистрации результатов реакции. Чувствительность ИФА оказалась на 2 порядка выше реакции встречного иммуноэлектрофореза. Кроме того, последняя не имеет объективной регистрации результатов, а ИФА имеет. Можно распечатки результатов ИФА в виде таблиц с конкретными цифрами прикладывать к заключениям экспертов.
2. Значительная экономия реагентов. Из результатов проделанной работы видно, что 100 мкл первых антител против и 10 мл пероксидазного конъюгата против достаточно для исследования более чем 900 пятен. Это актуально в данный момент, поскольку сейчас в России имеются перебои в выпуске видоспецифических сывороток.
3. Повышение производительности труда. Методом встречного иммуноэлектрофореза можно установить видовую принадлежность 10-30 пятен за рабочий день, так как в отделе по исследованию вещественных доказательств имеется только 1 аппарат для электрофореза. Методом ИФА, также на одном приборе, можно определить, как было указано выше, видовую принадлежность в 200-400 пятнах.
Выводы
Метод твердофазного ИФА, используемый нами для установления видовой принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательствах, является специфичным и высокочувствительным методом с объективной регистрацией и компьютерной обработкой результатов. Чувствительность его в 100 раз выше, чем у используемого для аналогичных целей метода встречного иммуноэлектрофореза. Специфичность метода является доказанной, так как со всеми отрицательными контролями, введенными в реакцию (физиологический раствор, антигены птицы, рогатого скота и свиньи), не было получено положительного результата. Кроме того, он отличается высокой производительностью и экономичностью. Вышеизложенное позволяет рекомендовать метод для использования в экспертной практике.
Литература:
1. Барсегянц Л.О. Определение видовой принадлежности пота // Суд. -мед. эксперт. — 1974. — №2. — Т. 17. — С. 33-35.
2. Барсегянц Л. О. Судебно-медицинская экспертиза вещественных доказательств // Судебная медицина. —М., 1997. — С. 241-278.
3. Гуртовая С.В., ТучикЛ.Н., Курдзиева О.В. Применение обти-теста для установления наличия и вида крови в пятнах// Суд.-мед. эксперт. — 1999. — №5. — Т. 44. — С. 23-25.
4. Дерюгина Е.И., Савельев Ю.И., Носырев А.Е., Лапенков М.И., Николаева Т.И. Применение иммуноферментного анализа для определения АВН-антигенов в следах слюны и спермы // Суд.-мед. эксперт. — 1992. — №2. — Т. 35. — С. 23-26.
5. Егоров А.М., Осипов А.П., Джантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. — М., 1991. —288 с.
6. Ильина Е.А. Одновременное установление наличия и принадлежности крови человеку (приматам), птицам и рыбам методом электрофореза // Суд.-мед. эксперт. — 1991. — Т. 34. — №1. — С. 28-32.
7. Ольховик В.П. Применение электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы при установлении видовой специфичности белка // Суд.-мед. эксперт. — 1986. — Т. 31. — №3. — С. 31-32.
8. Руковишникова Г.Е., Потапов М.И., Сигал Е.Р. // Выявление растворимых антигенов групп крови АВН с помощью иммуноферментного анализа //Журнал микробиологии эпидимиологии и иммунобиологии. — 1985. — №1. — С. 69-73.
9. Томилин В.В., Барсегянц Л.О., Гладких А.С. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. — М: Медицина. — 1989. — 303 с.
10. Туманов А.К. Судебно-медицинское исследование вещественных доказательств. — М.: Госюриздат. — 1961. — 576 с.
11. Туманов А.К. Основы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств. — М.: Медицина. — 1975. — 407 с.
12. Чарный В.И. Установление видовой специфичности белков крови. — М.: Медицина. — 1976. — 127 с.
13. Чистович Ф.Я. Изменения свойств крови при впрыскивании инородной сыворотки крови в связи с теорией иммунитета Эрлиха //Русский архив патологов, клинических медиков и бактериологов. — 1899. —Июль. — С. 21-37.
14. Bussard A. Description d’une technigue combinant simultanement ¡’electrophorese et la preci pitatio№immunologique dans un gel: lelectrosymmse // Biochim. biophys. Acta. — 1959. — Vol. 34. P. 258-262.
15. Cattaneo C., Gelsthorpe K., Phillips P., Sokol R.J. Reliable identification of human albumin in ancient bone usingELISA and monoclonal antibodies //Am J Phys Anthropol. — 1992. — Vol. 87. — №3. — P. 365-372.
16. Cattaneo C., Gelsthorpe K., Phillips P., Sokol R.J. Detection of human proteins in buried blood usingELISA and monoclonal antibodies: towards the reliable species indentification of blood stains on buried material // Forensic Sci Int. — 1992a. — Vol. 57,№2. — P. 139-146.
17. Divall G.B. The application of electrophoretic techniques infield of criminology // Electrophoresis. — 1985. — Vol. 6. — P. 249-250.
18. Engvall E., Perlman P. Enzyme-liked immunosorbent assay (elisa). Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. — 1971. — Vol. 8, №9. —P. 871-874.
19. Engvall E., Jonsson K., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay. 11. Quantitative assay of protein antigen,immunoglobulin G,by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes //Biochim. Biophys. Acta. — 1971. — Vol. 28;251, №3. —P. 427-434.
20. Grabar P.,Williams C. Methodepermetant l’Mude conjugae des propr^^s electroforetiques d’un m^ange de proMnes. Applicatione an srnum sanguine // Biochem. biophys acta. — 1953. — Vol. 10. —P. 193-197.
21. Okajima H., Katsumata Y. Quantitative analysis of species identification tests of bloodstains using anti-human serum //Nagoya J. Med. Sci. — 1993. Vol. 55, №1-4. —P. 57-63.
22. Tsutsumi H., Htay H.H., Sato K., Katsumata Y. Antigenic properties of human and animal bloodstains studied by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using various antisera against specific plasma proteins // Z Rechtsmed. — 1987. — Vol. 99, №3. —P. 191-196.
23. Ulenhuth P. Eine Methode zur Unterscheidung der versheidenen Blutareten // Dtsh. med. Wschr. — 1901. —Bd. 67, —S. 82-83.
24. Van WeemenB.K., Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates//FEBS Lett. —1971. — Vol. 15, №3. —P. 232-236.
25. Yamamoto Y., Tsutsumi A.,Ishizu H. Species identification of blood and bloodstains by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-human immunoglobulin kappa light chain monoclonal antibody // Forensic Sci Int. — 1989. — Vol. 40,№1. — P. 85-95.
© А.Г. Пашинян, 2004 УДК 340.6:616.5+616.97
А.Г. Пашинян
ОБ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКЕ ДЕФЕКТОВ ОКАЗАНИЯ ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ
Кафедра кожных и венерических болезней лечебного факультета (зав. — академик РАМН, проф. Ю.К. Скрипкин) Российского государственного медицинского университета
В статье проведён анализ 50 комиссионных судебно-медицинских экспертиз ряда регионов РФ по гражданским искам пациентов к дерматовенерологическим учреждениям. Рассмотрены вопросы о необходимости изучения при производстве судебно-медицинской экспертизы нормативно-правовых предписаний и отражение в заключении комиссии о соответствии или несоответствии) действий дерматовенерологов к этим предписаниям, о требованиях к участию в работе комиссии в качестве экспертов специалистов дерматовенерологов, о целесообразности обследования пациентов в крупных специализированных учреждениях здравоохранения.
Ключевые слова: дефекты оказания дерматовенерологической помощи, комиссионныеэкспертизы, алгоритм действия эксперта-специалиста.
ABOUT EXPERT EXAMINATION OF SKIN AND VENEREAL DISEASES RENDERING HELP DEFECTS
A.G. Pashinyan
The expert estimation of the defect of dermato-venerological treatment. A detailed analysis of the patients from different regions of the Russian Federation to dermato-venerological clinics is given in the article. The necessity of examination of judicial instruction and acts concerning the correspondence of the treatment to the instruction during the medical expertise.
The necessity of the inclusion to the medical expert commission of dermatologists as expert. The necessity of the patient’s examination in large special ized cl inics.
Key words: dermatological treatment defects, commission expertise, the pattern of the expert action.
Наблюдаемое за последнее десятилетие в Российской логической в частности, обусловлено, прежде всего измене-
Федерации резкое увеличение жалоб пациентов на каче- ниями в законодательстве в сторону закрепления приори-
ство оказания медицинской помощи вообще, и дермато- тета прав и свобод гражданина в области охраны здоровья.
