CC BY
35
Использование личинок трематод черноморских двустворчатых моллюсков в биологической индикации эффективности различных концентраций биологически
активных веществ Минина Е. Н. , Белоусова Ю. В.
Минина Елена Николаевна /Minina Elena Nikolaevna - кандидат биологических наук, доцент,
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение Высшего образования Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского, г. Симферополь;
2Белоусова Юлия Витальевна /Belousova Julija Vital'evna - аспирант,
Институт биологии южных морей им. А. О. Ковалевского, г. Севастополь
Аннотация: в работе впервые представлены сведения о влиянии различных концентраций синтетического аналога лей-энкефалина (даларгина), кокарбоксилазы, аденозинтрифосфорной и аскорбиновой кислот на продолжительность жизни личинок трематод черноморских двустворчатых моллюсков.
Abstract: this paper presents the first data on the influence of different concentrations of synthetic analogue leu-enkephalin (dalargina) cocarboxylase, adenosine and ascorbic acid on the survival of the larvae of trematodes of the Black Sea bivalves.
Ключевые слова: церкарии, трематоды, моллюски, Черное море, даларгин, аденозинтрифосфорная и аскорбиновая кислоты, кокарбоксилаза.
Keywords: cercariae trematodes, shellfish, Black Sea, Dalargin, adenosinetriphosphoric and ascorbic acid, kokarboksilaza.
Введение. Современный этап изучения механизма действия различных концентраций биологически активных веществ в первую очередь связан с поиском альтернативных моделей, ограничивающих использование теплокровных животных. Так, несмотря на отсутствие убедительных доказательств существования болевых рецепторов у насекомых, представители этого класса широко используются в качестве модельных тест-объектов для различных исследований в области нейроэндокринологии, биомедицины и биохимии (Грицай и др., 1998). В этой связи актуальны исследования, посвящённые малоизученным морфо-физиологическим особенностям простейших организмов, в частности, гельминтов моллюсков, а именно личинок трематод для выявления возможности их использования в качестве биоиндикаторов.
Так, с момента последних крупных паразитологических исследований черноморских моллюсков прошел довольно длительный срок - с 60-х годов ХХ века. Долгих А. В. (1970) были выполнены исследования влияния освещенности и температуры воды на выход церкарий Cercaria gibbulae Dolgikh, 1964 из моллюска Gibbula magna albida (Gmelin, 1790), церкарии Diphenostomum brusinae (Stossich, 1889) из Nassarius reticulatus (Linnaeus, 1758) и церкарии Bacciger Bacciger (Rudolphi, 1819) (Nicoll, 1914) из моллюсков Chione gallina (Linnaeus, 1758) (Долгих, 1965) и установлено, что экологические факторы внешней среды значительно влияют на их активность (Гаевская, 1972).
Последние данные об использовании как тест объектов моллюсков и трематод для изучения биологической индикации экологического состояния водоема были опубликованы в 2012 году (Юришинец и др., 2012). В работе идет речь об экспериментах, которые позволяют осуществлять биологическую индикацию окружающей среды с использованием систем «моллюски Viviparus viviparus (Linnaeus, 1758) - трематоды». При этом личиночные формы трематод, паразитирующие в черноморских моллюсках, до настоящего времени полностью не исследованы.
Собственными исследованиями была выявлена высокая чувствительность личинок трематод к условиям окружающей среды, обусловленная влиянием сезона года, солености, времени суток, температуры воды, освещенности и влияние этих факторов на продолжительность жизни личиночных стадий трематод (Мачкевский и др., 2012, Белоусова, 2013, Белоусова, 2014).
Возможно предположить, что трематоды и их личинки могут активно и дифференцированно реагировать на различные концентрации биологически активных веществ, частично замещающие потребности паразитов вне тела моллюска-хозяина, тем самым отражая химико-физиологические особенности функционирования микроорганизмов и их незрелых форм.
Для повышения жизнеспособности с целью создания благоприятной среды логично использование эрго -и трофотропные биологически-активные вещества. Так, например, для более подробного изучения морфофизиологических особенностей гельминтов и паразито-хозяинных отношений, можно использовать специализированную питательную среду L-15, способную продлевать жизнь личинкам трематод и способствовать их дальнейшему развитию (Gorbushin, Shaposhnikova, 2002). Также ранее Стадниченко А. П. (1975) было изучено изменение содержания аскорбиновой кислоты в гемолимфе Planorbarius corneus (Linne) при инвазии партенитами Cotylurus cornutus (Rud.), что косвенно может свидетельствовать о значимости этого вещества в отношениях «паразит-хозяин» (Стадниченко, 1979).
Актуальным и имеющим новизну для выявления функциональных особенностей трематод и их личинок также является изучение действия веществ, выполняющих регуляторные функции, не связанные напрямую с
метаболическими процессами. В этой связи анализ литературных данных свидетельствует о том, что объектом пристального внимания исследователей в настоящее время является выявление эффективности действия различных доз нейропептидов, и в том числе синтезированного аналога лей-энкефалина -даларгина (Минькова, 1998, Самсонова, 2000). Как известно, группа опиоидных пептидов является одной из многочисленных, многообразных и полифункциональных среди семейств нейропептидов (Ашмарин, 1996, Гомазков, 1997, Замятнин, 1994, Замятнин, 2004). Большинство известных физиологически активных пептидов наряду с млекопитающими присутствуют также у земноводных, моллюсков, рыб, насекомых и выполняют те же физиологические функции. Так, в работе [14] обсуждался вопрос об исследовании нейропептидных рецепторов или отдельных звеньев пептидэргической системы трематод в качестве биологической мишени при создании антигельминтных препаратов.
Цель исследования - выявление эффективности действия различных концентраций синтетического аналога лей-энкефалина (даларгина), аденозинтрифосфорной и аскорбиновой кислот и кокарбоксилазы на продолжительность жизни трематод и их личинок вне тела хозяина.
Материалы и методы исследования.
Нами обследовано 276 экз. черноморских моллюсков 3-х видов: Abra segmentum (Recluz, 1843), Chamellea gallina (Linnaeus, 1758), и Cerastoderma glaucum (Poiret, 1789). В опытах использованы животные с диаметром раковины от 1 до 3 см. Сбор материала проводился в акватории Севастополя (эстуарий реки Черная и бухта Казачья) в июле и августе 2013 г. Все ткани моллюсков обследовались на наличие паразитов компрессорным методом c помощью бинокуляра МБС-10. Жизнедеятельность церкарий и метацеркарий фиксировалась каждые 6 часов в контроле и при действии различных доз БАВ с помощью микроскопа XY -B2.
Для определения эффективного действия малых доз биологически активных веществ в повышении продолжительности жизни личинок трематод Cercaria plumosa (Sinitzin, 1911) и Parvatrema rebecqui (Bartoli, 1983) была проведена серия экспериментов. В каждую чашку Петри с 50 мл раствором в концентрации 10е-8 моль/л, 10е-9 моль/л одного из БАВ (даларгина, кокарбоксилазы, аденозинтрифосфорной и аскорбиновой кислот в концентрациях), приготовленном на морской воде, помещали по 1 особи зараженного моллюска A.segmentum (всего по 10 особей на каждую концентрацию всех БАВ) с личинками C. plumosa и P. rebecqui. При постановке эксперимента было учтено, что моллюски являются облигатными промежуточными хозяевами трематод, и последние свободно покидают хозяина, находясь в водной среде (рис.1). Инвазированные моллюски содержали спороцисты трематод, включающие от 25 до 40 зрелых церкарий, которые с момента выхода из моллюска становились объектом нашего исследования.
Рис. 1 Личинки трематод у моллюсков Abra segmentum и Cerastoderma glaucum в акватории г. Севастополя:
А - внешний вид церкарии Parvatrema rebecqui Bartoli,1983,
Б - внешний вид церкарии Cercaria plumosa Sinitzin, 1911,
В - внешний вид метацеркарии P. rebecqui;
Масштабная линейка: А,Б - 50, В - 100 pm
Животные и их личинки контрольной группы содержались в морской воде. Все емкости находились в равных внешних и временных условиях. В дальнейшем велся протокол жизненного состояния гельминтов и по окончательному количеству суток, проведённых в поставленных условиях, делалось заключение о биологической активности концентрации биологически активного вещества в повышении продолжительности жизни личинок трематод.
Количественные результаты эксперимента обработаны методами вариационной статистики с использованием программного пакета Statistica 6 для Windows.
Результаты и их обсуждение
На первом этапе исследований ориентированным экспериментом была изучена продолжительность жизни и активности личинок C.plumosa и P. rebecqui (по 10 экз. каждого вида гельминта) в естественных условиях морской воды, которые составили контрольную группу. При этом, если церкарии в ближайшее после выхода из первого промежуточного хозяина время не находят следующего потенциального хозяина для дальнейшей реализации жизненного цикла, особь погибает. Было выявлено, что средняя продолжительность церкарий в этих условиях составляет в среднем 24,0±6,0 часов, что обусловлено лимитом содержания гликогена в организме личинок.
На втором этапе изучались реакции личинок на различные концентрации БАВ. Как известно, простейший организм отвечает на воздействие среды как система, внутри которой происходят непрерывные изменения и переработка получаемых раздражений, что и обусловливает возникновение его не одинаковых реакций. Это различие зависит не только от внешних, но и от внутренних регулирующих факторов, т. е. от физиологических особенностей и функционального состояния микроорганизма. К таким уже изученным факторам системы «моллюск-трематода» можно отнести гликоген и аскорбиновую кислоту. Так, содержание общего сахара в гемолимфе зараженных трематодами моллюсков увеличивается более чем в 2,2 раза, а концентрация в гемолимфе аскорбиновой кислоты в 1,3 раза (Стадниченко, 1979) по сравнению со свободными от инвазии особями (Стадниченко, 1979).
Как показали наши исследования, личинки трематод дифференцированно реагировали на различные концентрации аскорбиновой кислоты, которая может участвовать в дыхательном процессе как непосредственный переносчик водорода и как ко-фактор, стимулирующий процесс. Как видно из рисунка 2 продолжительность жизни личинок в растворе 10е-9 моль/л оказалась больше в три раза (p < 0,01), относительно контрольной группы и на 30,3 % (p < 0,05), относительно группы с использованием концентрации 10е-8 моль/л.
сутки
Рис 2. Влияние различных концентраций БАВ на продолжительность жизни личинок трематод Gymnophallus
rebecqui и C.plumos
Примечание: * - (p < 0,05); ** - (p < 0,01); - достоверность различий между показателями по критерию Стьюдента
В растворе кокарбоксилазы, улучшающей усвоение глюкозы, с концентрацией 10e-8 моль/л, изменений не зафиксировано. При этом с увеличением степени разведения, в растворе с концентрацией 10 e-9 моль/л было зафиксировано продление жизни личинок в три раза (р < 0,05), относительно контрольной группы.
Помимо эрготропных функций, согласно гипотезе о медиаторной роли АТФ, она способна регулировать многие внутриклеточные процессы посредством влияния на специфические — пуриновые (Р) рецепторы [26], а при гипоксии проявляются ее свойства как эндогенного внутриклеточного и межклеточного регулятора функций клетки [25], влияющего на путь передачи рецепторного сигнала. Несмотря на широкие регуляторные возможности вещества, увеличение продолжительности жизни личинок в растворе с концентрацией 10e-9 моль/л не выявлено. В растворе АТФ с концентрацией 10e-8 моль/л был зафиксирован рост продолжительности в 2 раза (р < 0,05).
Как видно из рисунка 2, в эксперименте после добавления в морскую воду кристаллизатора даларгина в концентрации 10e-9 моль/л, происходило резкое увеличение продолжительности жизни личинок трематод G. Rebecqui, в 3 раза (р < 0,01) по сравнению с контрольной группой и почти в 1,5 (p < 0,05) - по сравнению с концентрацией 10e-8 моль/л, при которой увеличение продолжительности жизни личинок возросло относительно контроля на 50,0 % (p < 0,05).
Аналогичные данные были получены и при действии даларгина на продолжительность жизни личинок
C.plumosa.
Таким образом, полученные новые сведения о влиянии БАВ на трематодофауну моллюсков Черного моря являются важнейшей предпосылкой к детальному познанию физиологии трематод и их промежуточных хозяев - черноморских моллюсков.
Выводы:
1. Было выявлено, что личинки трематод G. rebecqui и C.plumosa дифференцированно реагировали на различные концентрации аскорбиновой и аденозинтрифосфорной кислот, кокарбоксилазы и даларгина, что даёт основания предполагать о физиологической значимости этих веществ в функционировании микроорганизма.
2. Наиболее выраженный эффект продолжения жизни личинок трематод G. rebecqui в 3 раза (р < 0,01) по сравнению с контрольной группой выявлен в растворе даларгина с концентрацией 10e-9 моль/л.
3. Личинки трематод G. rebecqui и C.plumosa двустворчатых моллюсков Черного моря могут использоваться как тест объекты для изучения эффективности действии различных концентраций БАВ.
Литература
1. Ашмарин И. П., Каразеева Е. П. Нейропептиды. // Нейрохимия (Ашмарин И. П., Стукалов П. В.). М.: Изд. Инст. биомед. химии РАМН. 1996, С. 246-295.
2. Белоусова Ю. В. Сезонная динамика численности и структуры гемипопуляции трематод Cercaria plumosa Sinitzin, 1911 (Fellodistomidae) и Cercaria misenensis Palombi, 1940 (Microphallidae) - паразитов моллюсков акватории Севастополя (Черное море). // Тез. XV конф. укринского науч. общ-ва паразитологов - 2013. (15 - 18 октября 2013 г., г. Черновцы) - Киев, 2013, с. 18.
3. Белоусова Ю. В. Parvatrema rebecqui (Bartoli, 1983) (TREMATODA: GYMNOPHALLIDAE) - паразит моллюсков Abra segmentum Recluz, 1843 и Cerastoderma glaucum Poiret, 1789 в Черном море у берегов Крыма.
4. Гаевская А. В. Влияние освещенности и температуры воды на выход некоторых видов церкарий из черноморских моллюсков. // Гидробиол. журн. - 1972. - Т. 8, N. 5. - С. 104—105.
5. Гомазков О. А. (составитель) Мозг и нейропептиды. Справочно-информационное издание. М.: Христ. изд-во. 1997. С. 35-109.
6. Грицай О. Б., Пилипенко В. Э., Дубинин В. А. Поведение таракана Periplaneta americana при тесте «горячая пластина» на фоне действия анальгетиков различных классов. // Жур. эвол. биохим. и физиол. 1998. Т. 34. № 1. С. 28-36.
7. Долгих А. В. Влияние различных факторов внешней среды на выход церкарий из моллюсков. // Вопросы гидробиологии. - М., 1965. - С. 131-132.
8. Долгих А. В. Зависимость зараженности черноморских моллюсков от наличия окончательных хозяев трематод. // Работы по паразитофауне юго-запада СССР. - Кишинев, 1965. - С. 52-54.
9. Долгих А. В. Личинки трематод - паразиты моллюсков крымского побережья Черного моря. - Автореф. дисс... канд. биол. наук. Севастополь-Львов, 1965. - 24 с.
10. Дьяконова В. Е. Роль опиоидных пептидов в поведении беспозвоночных. // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2001. Т. 37. № 4. С. 253-261.
11. Замятнин А. А. «Великое объединение» природных олигопептидных регуляторов. // Нейрохимия. М. 1997. 3. т. 14. с. 313-315.
12. Замятнин А. А. Биологические проблемы олигопептидной ругуляции. // Биохимия, 2004, Т. 69, вып. И, с. 1565-1573.
13. Мачкевский В. К., Белоусова Ю. В., Пронькина Н. В. Новые данные о распространении Cercaria plumosa Sinitzin, 1911 (TREMATODA: FELLODISTOMIDAE) в моллюсках акватории Севастополя. / Науковi записки Тернотльського нацюнального педагопчного ушверситету iменi Володимира Гнатюка, Сер.Бюл., 2012, № 2 (51), с. 175-178.
14. Милютина Т. А., Теренина Н. Б., Крещенко Н. Д. Нейропертиды у плоских червей (трематоды, цестоды, турбеллярии): локализация, функции, рецепторы. // Учёные записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. - 2013. - Том 15. КН. 3. - С. 129-154.
15. Минькова Н. О. Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на метаболизм белков и нуклеиновых кислот у насекомых. // Дисс. к.б.н. 1999. М. 151 с.
16. Самсонова М. В., Филиппович Ю. Б. Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на активность монофенолмонооксигеназы личинок восковой моли. // Научные труды МПГУ. Серия: естественные науки. М.: Прометей. 2000. С. 247-248.
17. Стадниченко А. П. Изменение содержания аскорбиновой кислоты в гемолимфе Planorbarius corneus при инвазии партенитами Cotylurus cornutus. / А. П. Стадниченко, Н. Н. Березюк, Н. П. Кордонец, О. В. Огородник. // Матер. ВОГ. - М.: Изд-во АН СССР, 1979. - С. 133-137.
18. Усенко А. Б., Емельянова Т. Г., Мясоедов Н. Ф. Дерморфины - природные опиоиды с уникальной первичной структурой, определяющей специфику их биологической активности. // Изв. АН. Сер. биол. 2002. № 2. С. 192-204.
19. Чугунов А. О. Неизвестные пептиды. Наука и жизнь № 10 (2010), 26-31.
20. Юришинец В. И., Ивасюк Ю. С., Красуцька Н. О. Симбиоценоз моллюсков Viviparus viviparus (L.) (Gastropoda, Viviparidae) в водных объектах урбанизированных территорий). // HayraBi записки Тернопшьського нацюнального педагопчного ушверситету iменi Володимира Гнатюка. Серш: Бiологiя. - 2012. - № 2 (51). - С. 311-314.
21. Gorbushin A., Shaposhnikova T. In vitro culture of the avian echinostome Himasthla elongata:from redia to marita. // Department of Cytology and Histology, Biology and Soil Sciences Faculty, St.-Petersburg State University, 2002. P. 234-239.
22. Thorpe A., Duve H. Morphological, biochemical, and physiological studies on insect enkephalins. // Progress in Comparative Endocrinology (Epple A., Scanes C. G., Stetson M. H.). Wiley-Liss. Inc. 1990. P. 293-299.
23. Nichols R. Signaling pathways and physiological functions of Drosophila melanogaster FMRFamide-related peptides. // Review of Entomology, 2002, V. 48, P. 485-503.
24. Стадниченко А. П. Изменение некоторых показателей углеводного обмена в гемолимфе пресноводных моллюсков при инвазии их партенитами и личинками трематод. / А. П. Стадниченко. // Паразитология. -1979. - Т. 12, вып. 6. - С. 472-478.
25. Дарбинян Т. М., Черников В. С., Апасов К. Т. Функции сердца при экзогенном введении аденозинтрифосфорной кислоты. //Анестезиология и реаниматология. — 1992. — № 5-6. — С. 64—69.
26. Burnstock G., Kennedy C. (1985). Is there a basis for distinguishing two types of P2 purinoceptor? // Gen.Pharmacol. — 16: 433-440.
