CC BY
33
ИЗВЕСТИЯ ОРЕНБУРГСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО АГРАРНОГО УНИВЕРСИТЕТА
2020 ■ № 5 (85)
УДК 637.075
Использование культуры Streptococcus thermophilus для определения остаточных количеств ингибирующих веществ в молоке
Е.В. Попова1, аспирантка; О.К. Давыдова2, канд. биол. наук
1 ФГБОУ ВО Оренбургский ГАУ
2 ФГБОУ ВО Оренбургский ГУ
Применение молока, содержащего в своём составе ингибиторы, из-за подавления роста молочнокислой микрофлоры приводит к сильному размножению грамотрицательных бактерий и в конечном счёте к выработке нестандартных ферментированных молочных продуктов. Из ингибиторов, присутствующих в заготавливаемом молоке, особое значение придают антибиотикам. Наряду с производственными трудностями, связанными с попаданием антибиотиков в молоко, могут возникать также и нежелательные последствия для здоровья потребителей: возможность возникновения аллергии, появление резистентных к антибиотикам условно-патогенных или патогенных микроорганизмов, развитие дисбактериозов. Статья посвящена проблеме определения остаточных количеств ингибирующих веществ в молоке и использования микробиологического метода редуктазной пробы, основанного на обесцвечивании красителя метиленового голубого в присутствии продуктов жизнедеятельности бактерий Streptococcus thermophilus для оценки качества молока различных производителей, приобретённого в торговой сети города Оренбурга. В ходе исследования было выявлено, что из 30 образцов молока 53,3 % не содержали антибиотиков, 33,3 %, вероятно, содержали незначительное количество ингибирующих веществ, 13,3 % содержали ингибирующие вещества. Описанный в статье метод в связи со своей дешевизной и быстротой может быть рекомендован для практического использования на молочных фермах и молокоперерабатывающих предприятиях.
Ключевые слова: молоко, Streptococcus thermophilus, антибактериальные препараты, ингибирующие вещества, микробиологические экспресс-тесты, метод редуктазной пробы, метиленовый голубой.
Молоко и молочные продукты относятся к незаменимым продуктам питания, используемым человеком во все периоды жизни, и отличаются тем, что в их составе представлены все необходимые для организма пищевые и биологически активные вещества в оптимально сбалансированном состоянии [1]. Пищевая ценность молока значительно повышается при употреблении его в виде кисломолочных напитков путём сквашивания чистыми культурами молочнокислых микроорганизмов. Однако в наше время существует проблема загрязнения молока ингибирующими веществами, что нарушает биотехнологические процессы его переработки и наносит значительный ущерб предприятиям, производящим кисломолочные продукты, детское и лечебное питание.
К ингибирующим веществам, обнаруживаемым в молоке, принадлежат: антибиотики; консервирующие, нейтрализующие вещества; моющие и дезинфицирующие средства; нитраты; тяжёлые металлы и др. Основными источниками их появления в молоке являются: лечение коров антибиотиками; внесение в корма животных консервантов, кормовых антибиотиков, а также попадание пестицидов, нитратов, тяжёлых металлов; обработка доильного и другого молочного оборудования для поддержания санитарии и гигиены моюще-дезинфицирующими веществами и нейтрализаторами [2].
Одним из биологически опасных и часто обнаруживаемых видов загрязнения молока являются антибиотики, особенность действия которых заключается в высокой биологической актив-
ности в малых концентрациях (ПДК 0,01 - 0,10 мг/кг) и высокой специфичности по отношению к отдельным функциям жизнедеятельности организмов [3]. Например, может оказываться аллергическое действие, вызываться токсический эффект и появляться резистентные к антибиотикам условно-патогенные или патогенные штаммы микроорганизмов, а также развиваться дисбакте-риозы [4]. Поэтому своевременное обнаружение молочного сырья, загрязнённого ингибирующими веществами, имеет большое значение для моло-коперерабатывающих предприятий.
Существующие способы определения инги-бирующих веществ в молоке включают в себя микробиологические, спектроскопические, хро-матографические и электрохимические методы [5 - 7]. При этом интерес представляют простые, быстрые и дешёвые методы анализа, основанные на обесцвечивании красителей (резазурина, ме-тиленового голубого) в присутствии продуктов жизнедеятельности тест-культур микроорганизмов [8 - 10].
Целью настоящей работы стало использование культуры Streptococcus thermophilus для определения остаточных количеств ингибирую-щих веществ в молоке.
Материал и методы исследования. В работе была использована сухая бактериальная закваска, содержащая штамм S. thermophilus («Здоровеево»). Для суспендирования лиофильно-высушенной культуры использовали мясо-пептонный бульон (МПБ), из которого затем микроорганизмы высевали на плотную питательную среду - мясо-пептонный агар (МПА).
Для восстановления полной жизнеспособности культуры использовали два пассажа на МПА.
Для окрашивания клеток микроорганизмов и определения антибиотиков в молоке использовались красители: генциановый фиолетовый, раствор Люголя, раствор водного фуксина и метиленовый голубой.
Методами исследования являлись оптическая микроскопия, характеристика культуральных свойств и метод редуктазной пробы.
Исследование проводили на образцах молока различных производителей, приобретённых в торговых сетях г. Оренбурга и представленных в таблице 2, - всего 30 образцов. Для проведения пробы сухой концентрат термофильного стрептококка разводили стерильной дистиллированной водой, нормировали по оптической плотности и в объёме 1 см3 взвеси вносили к 10 мл исследуемого молока. Затем исследуемое молоко с тест-культурой выдерживали в термостате при температуре, благоприятной для интенсивного развития тест-культуры, без потери её чувствительности в течение 1 часа. После инкубации в пробирки с исследуемым молоком и тест-культурой вносили индикатор метиленовый голубой в концентрации 10 - 4 М в объёме 100 мкл и при той же температуре по прошествии 3 час. определяли окраску индикатора, по которой и оценивали результат. При отсутствии в анализируемом молоке инги-бирующих веществ цвет индикатора изменяется от сине-голубого до бледно-голубого или белого. Если цвет индикатора не изменился и остался сине-голубым, проба анализируемого молока содержит ингибирующие вещества.
Результаты исследования. Для изучения морфологических свойств используемой культуры применялась методика окрашивания клеточной стенки по Граму. При микроскопическом исследовании в полученных препаратах S. thermophilus были обнаружены грамположительные клетки округлой формы с диаметром не более 1 мкм, располагающиеся в виде цепочек разной длины, по морфологическим и тинкториальным свойствам соответствующие роду Streptococcus, что подтверждало чистоту и соответствие заявленному используемого препарата.
Культуральные признаки оценивали, руководствуясь наличием роста при разных температурных режимах - 37, 42 и 45 °С, а также по форме колоний на МПА при инкубировании в течение 1 суток в термостате при выбранных температурах. На МПА S. thermophilus образует округлой формы с зернистой структурой поверхностные и глубинные лодкообразные, иногда с выростом, колонии, что также свидетельствует об их принадлежности роду Streptococcus. Полученные результаты (табл. 1) указывают на то, что наиболее благоприятной для роста микроорганизмов S. thermophilus является температура
42 °С, которая и была использована в дальнейшем при исследовании образцов молока.
1. Параметры роста S. thermophilus при разных температурных условиях (X ± Sx)
Температурные условия 37 °С 42 °С 45 °С
КОЕ 46,67 ± 3,76 119 ± 5,78 4,67 ± 0,67
Антибиотикочувствительно сть используе -мой тест-культуры Х йегторЫ1ш определяли методом редуктазной пробы, основанным на обесцвечивании красителя метиленового голубого в присутствии продуктов жизнедеятельности бактерий, культивируемых при 42°С в течение 18 час. в МПБ.
В присутствии выделяемого микроорганизмом фермента редуктазы молоко, окрашенное красителем, обесцвечивается, так как редуктаза восстанавливает метиленовый голубой, переводя её в бесцветную лейкоформу (рис. 1). Если в исследуемом объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культуры и вызывает их гибель. В этих пробирках краситель не обесцвечивается.С увеличением числа микроорганизмов в молоке скорость восстановления метиленового голубого возрастает.
Согласно гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации и странах Таможенного союза, в соответствии с техническими регламентами ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» содержание ингибирую-щих веществ в продукции детского питания на молочной основе для детей раннего возраста (от 0 до 3 лет) значительно меньше, поэтому в нашем исследовании пробы молока «Тёма», «Фруто-няня» и «Наша Маша» использованы как контрольные образцы, в сравнении с которыми оценивались остальные образцы.
При использовании метода редуктазной пробы в ходе исследований молочных продуктов разных производителей с помощью тест-культуры S. ^егторЫ1ш и красителя метиленового синего по истечении 3 час. было выявлено, что из 30 образцов молока, представленных в таблице 2, 53,3 % не содержали антибиотиков, 33,3 %, вероятно, содержали незначительное количество ингибирующих веществ, 13,3 % содержали ингибирующие вещества.
Наличие в молоке антибиотиков недопустимой концентрации либо остатков моюще-дезинфицирующих средств, которые задерживают развитие термофильного стрептококка в молоке, было зафиксировано у производителей под номерами 10, 12, 17 и 23.
2. Характеристики исследуемых проб молока
№ Название Производитель Пастеризация (П) / ультрапастеризация (У) / стерилизация (С) Жирность Ингиби-рующие вещества
1 «Тёма» АО «Данон Россия», г. Москва У 3,2 -
2 «Фруто-няня» АО «ПРОГРЕСС», г. Липецк У 3,2 -
3 «Наша Маша» «Богдановичский городской молочный завод», Россия, Свердловская область У 3,2 -
4 «Ташлинское молоко» ООО МПЗ «Ташлинский», Оренбургская область, Ташлинский район, село Ташла П 3,2 -
5 «Молоко Оренбуржья» ООО «А7 Агро-Оренбургский молочный комбинат», г. Оренбург П 3,2 ±
6 «Летний луг» ООО «А7 Агро-Оренбургский молочный комбинат», г. Оренбург У 3,2 ±
7 «Молочный фермер» ООО «Уфагормолзавод», г Уфа У 3,2 -
8 «Халяль» ООО «Уфагормолзавод», г Уфа У 3,2 -
9 «Молочный фермер» ООО «Уфагормолзавод», г Уфа П 3,2 -
10 «Торговый дом «Сметанин» АО «Группа Компаний «Российское молоко», г Стерлитамак У 3,2 +
11 «Домик в деревне» АО «ВБД» Россия, Омская область, г. Омск У 3,2 ±
12 «Молоко Можайское» ЗАО «Завод стерилизованного молока «Можайский», г Можайск. С 3,2 +
13 «ARO» ОАО «Милком», г. Ижевск У 3,2 ±
14 «Белый город» ООО «Агросила-Молоко», г. Набережные Челны У 3,2 ±
15 «Село Зелёное» ОАО «Милком», Удмуртская Республика, г. Сарапул У 3,2 ±
16 «Белое озеро» ООО «Степь», Россия, Оренбургская область, Саракташский район, с. Кабанкино. П 3,2 -
17 «Красная цена» ОАО «Милком», Удмуртская Республика, г. Сарапул У 3,2 +
18 «Добрая бурёнка» ООО «Саратовский молочный комбинат», Саратов П 3,2 -
19 «Первый вкус» ОАО «Челябинский городской молочный комбинат», г. Челябинск П 3,2 -
20 «Домик в деревне» ОАО «Вимм-Биль-Данн продукты питания», Воронежская обл., п.г.т. Анна У 3,2 -
21 «Простокваши-но» АО «Данон Россия», г. Москва У 3,2 -
22 «Своё наше» ООО «СН-продукт», Республика Башкортостан, Благоварский район, с. Моисеево П 3,2 ±
23 «Бирское молоко» ООО «Бирский комбинат молочных продуктов», Республика Башкортостан, г. Уфа П 3,2 +
24 «Молочная крепость» ООО «Уфагормолзавод», Республика Башкортостан, г. Уфа У 3,4 - 6 -
25 «Сметанин» ОАО «Брянский молочный комбинат», г. Брянск П 3,2 ±
26 «Молочный завод Чишмин-ский» ООО «Чишминский молочный завод», Республика Башкортостан, Чишминский район, п. Чишмы П 3,2 -
27 «Молоко отборное» ООО «СН-продукт», Республика Башкортостан, Благоварский район, с. Моисеево П 3,4 -4,0 ±
28 «Молочная речка» «ФБК Групп», г. Челябинск У 3,2 -
29 «Молоко питьевое» ИП Васильева Н.Ю., Республика Башкортостан, Мелеузовский район, с. Зирган П 3,2 -
30 «Коровье молоко» ООО «Агросила-Молоко», Республика Татарстан, г. Казань У 3,2 ±
Примечание: + подавление роста тест-культуры, наличие ингибирующих веществ; - рост тест-культуры, отсутствие ин-гибирующих веществ; ± ограниченный рост тест-культуры, незначительное содержание ингибирующих веществ.
Рис. 1 - Реакция обесцвечения метиленового голубого, переход в лейкоформу
Выводы. Микроскопическое исследование препарата, приготовленного из бактериальной закваски, подтвердило наличие чистой культуры грамположительных клеток круглой формы диаметром не более 1 мкм, которые располагались в виде цепочек разной длины и соответствовали роду Streptococcus. Подбор условий культивирования показал, что наиболее благоприятной для роста микроорганизмов оказалась температура 42 °С.
При визуальном наблюдении обесцвечивания метиленового голубого в молоке разных производителей в присутствии S. thermophilus из 30 образцов 53,3 % не содержали антибиотиков. Наличие высокого содержания ингибиторов было зафиксировано у производителей «Торговый дом «Сметанин», «Молоко Можайское», «Красная цена» и «Бирское молоко», что составило 13,3 % от исследуемых образцов. Так как проблема содержания остаточных количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения г. Оренбурга уже привлекала внимание к вопросу гарантии безопасности продукции для здоровья человека [11], редуктазный метод определения присутствия антибиотиков в молоке с помощью S. thermophilus, сочетая в себе относительную простоту, приемлемое время анализа и невысокую себестоимость, может быть рекомендован для практического использования на молочных фермах и молокоперерабатывающих предприятиях.
Литература
1. Дмитриченко М.И., Пилипенко Т.В. Товароведение и экспертиза пищевых жиров, молока и молочных продуктов. СПб.: Издательский дом «Питер», 2004. 352 с.
2. Методы определения остаточных количеств антибиотиков и ингибирующих веществ в молоке / А.П. Олиферчик, Н.М. Аль-Хаммаш, А. С. Кучминская [и др.] // Труды БГТУ. 2012. № 4. С. 176 - 179.
3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. 3-е изд., пер. и доп. М.: Высш. школа, 1979. 455 с.
4. Salminen S. Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects2 / S. Salminen. Ed. New York: Marcel Dekker Inc, 1998. P. 14 - 22.
5. Крусь Г.Н., Шалыгина А.М., Волокина З.В. Методы исследования молока и молочных продуктов. М.: Колос, 2000. 368 с.
6. Современные методы определения антибиотиков в биологических и лекарственных средах (обзор) / Е.Г. Кулапина, О.В. Баринова, О.И. Кулапина [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. 2009. № 54. C. 9 - 10.
7. Фаращук Н.Ф., Цюман Ю.П. Современные, наиболее употребляемые лабораторные методы исследования антибиотиков // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. 2012. № 4. С. 58 - 63.
8. Зайнуллина А.Р., Петухова Е.В., Яковлева Г.Ю. Создание микробиологического экспресс-метода определения антибиотиков в молоке // Вестник технологического университета. 2017. № 21. С. 119 - 122.
9. Молоко. Методы определения ингибирующих веществ: ГОСТ 23454 - 2016. Введ. 01.09.2017. М.: Стандтартинформ, 2016. 15 с.
10. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа: ГОСТ 9225 - 84. Введ. 01.01.86. М.: Стандартинформ, 2009. 16 с.
11. Мережко О.Е., Станишевская Н.Б. Формирование устойчивости микроорганизмов при внесении антибиотиков в корма // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2005. № 2 (52). С. 174 - 176.
Попова Евгения Викторовна, аспирантка
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет» Россия, 460014, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18 E-mail: popova_zhenechka@mail.ru
Давыдова Ольга Константиновна, кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет» Россия, 460018, г. Оренбург, просп. Победы, 13 E-mail: okdavydova@yahoo.com
Using the Streptococcus thermophilus culture to determine the residual content of inhibitory substances in milk
Popova Evgeniya Viktorovna, postgraduate Orenburg State Agrarian University 18 Chelyuskintsev St., Orenburg, 460014, Russia E-mail: popova_zhenechka@mail.ru
Davydova Olga Konstantinovna, Candidate of Biology, Associate Professor
Orenburg state University
13, Victory Ave, Orenburg, 460018, Russia
E-mail: okdavydova@yahoo.com
The use of milk containing inhibitors in its composition, due to the suppression of the growth of lactic acid microflora, leads to a strong proliferation of gram-negative bacteria and, ultimately, the development of nonstandard fermented dairy products. Of the inhibitors present in the harvested milk, special importance is attached to antibiotics. Along with the noted production difficulties associated with the ingestion of antibiotics in milk, there may also be undesirable consequences for the health of consumers: the possibility of allergies, the appearance of antibiotic-resistant opportunistic or pathogenic microorganisms, the development of dysbacteriosis. This article is devoted to the problem of determining the residual amounts of inhibitory substances in milk and using the microbiological method of reductase testing based on the discoloration of the methylene blue dye in the presence of Streptococcus thermophilus bacterial products to assess the quality of milk from various producers purchased in the retail network of the city of Orenburg. The study revealed that out of 30 milk samples, 53.3 % did not contain antibiotics, 33.3 % probably contained small amounts of inhibitory substances in the milk, and 13.3 % contained inhibitory substances. This method, due to its cheapness and speed, can be recommended for practical use on dairy farms and dairy processing plants.
Key words: milk, Streptococcus thermophilus, antibacterial drugs, inhibiting substances, microbiological rapid
tests, reductase test method, methylene blue.
-♦-
УДК 578.834.11:636.09
Выявление пуллороза эмбрионов птиц путём биологического контроля инкубационного яйца
Е.Р. Нуралиев, канд. биол. наук
НПУЦ ИТУ, Республика Казахстан
В статье представлены результаты производственных опытов по выявлению пуллороза-сальмонеллёза эмбрионов кур. При патологоанатомическом вскрытии невыведенных инкубационных яиц кур выявили, что у 15 - 18 % погибших эмбрионов содержимое желточного мешка имело плотную консистенцию, травянисто-зелёный цвет и инъецированную сеть кровеносных сосудов. Желчный пузырь у больных эмбрионов был увеличен в несколько раз и заполнен густой тягучей тёмно-зелёного цвета желчью. На теле эмбрионов и оболочках аллантоиса зафиксировано отложение мочекислых солей. У погибших эмбрионов наблюдалось ампулообразное расширение прямой кишки заполненной газами и мочекислыми солями. Показано, что борьба с сальмонеллёзом птиц включает проведение организационных, санитарно-гигиенических и терапевтических мероприятий, серологическое выявление подозреваемых в заражении или бактерионосительстве птиц. В этих случаях единственным выходом является рациональное использование надёжных и безопасных противобактериальных средств и в первую очередь антибиотиков.
Ключевые слова: пуллороз, эмбрионы кур, биологический контроль, инкубационные яйца.
Сальмонеллёзная инфекция, которая загрязняет скорлупу, имеет большую значимость и в то же время наносит значительный ущерб птицеводческой отрасли [1].
Молодняк всех птиц (цыплята, индюшата, фазанята, цесарята и т.д.) особенно восприимчив к сальмонеллёзу в начальные дни жизни. Главным началом возбудителя заболевания является, как всегда, нездоровая птица, которая с помётом выделяет огромное количество возбудителя [1,
2]. Анализ исследовательских работ по данной инфекции показал, что возбудителя инфекции сальмонеллёза выявляют не только во внутренних органах птиц, а также в мышцах, яйце и, конечно, в желтке [3, 4].
По данным статистических исследований, домашние птицы, собственно куры, нередко болеют сальмонеллёзом. В большинстве случаев птицы были инфицированы Enteritidis, и потому клинические признаки болезни и падежа у них
