CC BY
62
Сельскохозяйственные науки
Драгунова М.М.
аспирант, Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, г. Кемерово
Использование культуры дрожжей Clavispora Lusitaniae У3723 для переработки вторичного коллагенсодержащего сырья
Драгунова М.М.
Вовлечение в производство вторичного сырья мясной промышленности способствует решению экологических задач [1]. Низкосортное коллагенсодержащее сырье содержит в значительных количествах ценный белок.
На мясокомбинатах и убойных пунктах животноводческих ферм в значительных количествах могут накапливаться ресурсы свиных шкур или их отходов. Известно, что свиная шкура составляет 9-13% мяса на костях [2]. Отходы переработки свиных шкур практически не находят применения для пищевых целей [3]. Однако имеются возможности использования этого некондиционного коллагенсодержащего сырья.
Существующие традиционные технологии переработки коллагенсодержащего сырья не являются эффективными и рациональными. При физических и химических способах переработки могут образовываться различные токсические вещества, а так же потеря белка до 75%. В связи с этим необходимы новые пути переработки и рационального использования вторичного сырья.
Один из реальных и эффективных подходов в решении поставленной задачи — это создание технологии переработки вторичного коллагенсодержащего сырья ферментативным способом с применением микроорганизмов.
Метод заключается в культивировании штаммов продуцентом необходимого фермента непосредственно на перерабатываемом сырье. Благодаря такому способу культивирования происходит дальнейшее наиболее эффективное разложение субстрата. При использовании данного метода надо подобрать оптимальный продуцент и условия для его культивирования, для увеличения скорости и эффективности биоконверсии [4].
Учитывая требования к штамму и его функциональной эффективности нами был выбран штамм продуцент колла-геназы С1ау1врога 1шйашае У 3723. Выбор данного штамма обусловлен простотой и низкой стоимостью питательных сред для его культивирования, обладает высокой продуктивностью коллагеназы, короткими сроками культивирования и высоким выходом фермента [5].
Учитывая актуальность проблемы целью настоящей работы явилось определение оптимального состава питательной среды для обеспечения высокого выхода биомассы С1ау1врога 1шкашае У 3723, определение наиболее подходящей температуры культивирования, а также периода, в течение которого происходит накопление биомассы быстрее всего, определение влияния химических добавок на удельную ферментную активность. Для достижения цели поставлены следующие задачи: определить химический состав коллагенсодержащего сырья, установить влияние питательных сред на удельную активность коллагеназы, изучить влияние внешних условий на рост и продуктивность дрожжей-продуцентов и оптимизировать установленные параметры.
В качестве объекта исследования использовали вторичное сырье мясоперерабатывающей промышленности (коллагенсодержащее сырье убоя свиней породы «Ландрас»), полученное при первичной переработке свиной туши в условиях ЗАО «Кемеровский мясокомбинат» (Кемеровская область).
В работе использовались питательные среды: среда Чапека, мясопептонный агар и среда Лурия-Бертани. Для исследования влияния химических компонентов в качестве субстрата на увеличение удельной коллагеназной актив-
ности осуществлено культивирование дрожжей Clavispora lusitaniae Y 3723 на питательном бульоне с добавлением солей: NaCI, КН2РО4, СаСОЗ. Коллагеназную активность определяли модификационным методом, суть которого заключается в определении оптической плотности при 340 нм и определении количества расщепленного белка (мкг/ смЗ) культуральной жидкости за 1 час гидролиза.
Определение коллагена проводили в условиях нагревания пробы при температуре 42-44oC в течение 2 часов с последующей обработкой ацетоновым раствором тетрахлор-парахинона в присутствии 1,4-диоксана и образующийся окрашенный раствор фотометрировали при длине волны 547 нм [6].
Отбор и подготовку проб к анализу проводили по ГОСТ Р 51447-99 и ГОСТ Р 51448-99. Физико-химические показатели определяли по стандартным методикам по ГОСТ Р 51479-99.
Определение общего азота/белка проводили с помощью анализатора белка RAPID N ELEMENTAR.
По химическому составу шкура свиная богата следующими витаминами и минералами: витаминами группы В, Е, Н, РР; микроэлементами (железо, цинк, йод, олово, никель, фтор, хром, медь); макроэлементами (кальций, магний, натрий, калий, фосфор, хлор, сера). Также, в состав свиной шкуры входят белки, жиры, углеводы и вода. Основную массу сухого вещества шкуры составляют белки (коллаген, эластин, ретикулин). Аминокислотный состав шкуры свиной характеризуется высоким содержанием глицина и аланина (соответственно 33-35% и 10-15% от суммы аминокислот). Также было установлено общее содержание белка, массовая доля которого составила 73,00%. Результаты по содержанию белка и общего азота в исследуемом образце представлены в таблице 1.
Результаты исследований, показали, что вторичное коллагенсодержащее сырье является не только биологически ценным продуктом, но и содержит в себе витамины, аминокислоты, макро — и микроэелементы.
Дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния внешних условий на рост и продуктивность дрожжей-продуцентов, а также установлена наиболее рациональная среда и температура для прироста биомассы. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Продуцент С1ау1врога 1шйашае У 3723 выращивали в течение 9 суток на питательных средах с последующим определением белка в биомассе. В ходе исследований проводили подсчет числа выросших в чашках колоний и определяли концентрацию дрожжей в 1 г биомассы. Установлено, что максимальное накопление биомассы С1ау1врога 1шкашае У 3723 происходит на 7 сутки на всех трёх питательных средах, но максимальная динамика накопления биомассы происходит в течение 3 суток, затем скорость роста значительно замедляется. На 9 сутки наблюдается замедление накопления биомассы на всех трёх питательных средах. При этом оптимальная температура культивирования составила 25±1°С при выращивании на каждой из сред. Из таблицы 2 видно, что при повышении температуры продуцент коллагеназы становится малоактивным. Наибольший прирост биомассы происходит при 25°С на мясо-пептонном агаре.
В ходе исследованиий определяли содержание общего белка в течение 9 суток при 25°С. Содержание белка рассчитывали произведением общего азота на пересчетный коэффициент для белков живых организмов, составляющий 6,25. Данные представлены в таблице 3.
На основании проведенных исследований было установлено, что на питательном агаре происходит высокое
Таблица 1. Содержание белка и азота в исследуемом образце
Наименование образца Общее содержание белка, % Содержание коллагена, % Белковые вещества неколлагеновой природы Общее содержание азота, %
Дерма свиная 73,00±2,19 70,40±2,11 2,60±0,78 11,68±0,35
Таблица 2. Накопление биомассы в процессе культивирования Clavispora lusitaniae Y 3723 при различной температуре
Температура, °С Количество микроорганизмов, х10'3 КОЕ/г
сутки
1 3 5 У 9
Среда Лурия-Бертани
20,00 98 105 120 132 136
25,00 196 390 440 574 576
30,00 18 22 80 100 105
МПА
20,00 106 120 144 156 156
25,00 214 590 640 676 678
30,00 20 80 100 105 108
Среда Чапека
20,00 78 100 110 130 140
25,00 101 232 246 265 266
30,00 10 32 38 40 40
Таблица 3. Накопление белка в биомассе в процессе культивирования Clavispora lusitaniae Y 3723 при температуре 25^
Массовая доля белка, % сутки
1 I 3 I 5 I 7 I 9
Среда Лурия Бертани_______________________________________________________________________________________________________________________
2,06±0,08 I 20,00±0,60 I 24,00±0,72 I 30,00±0,90 I 31,00±0,93
Питательный агар__________________________________________________________________________________________________________________________
5,40±0,16 I 56,00±1,68 I 70,00±2,10 I 76,00±0,22 I 76,00±0,23
Среда Чапека______________________________________________________________________________________________________________________________
5,80±1,74 | 22,00±0,66 | 26,00±0,78 | 30,00±0,90 | 31,00±0,93
накопление белка, по сравнению с другими питательными средами. Массовая доля белка на 7 сутки составила около 76%.
После определения оптимальных условий для выращивания Qavispora lusitaniae Y 3723, дополнительно проведены исследования по оптимизации параметров, влияющих на активность коллагеназы.
Существует много факторов, оказывающих влияние на скорость ферментативной реакции. Для того чтобы определить наилучшие условия биотрансформации коллагеносодержащего сырья в аминокислоты, необходимо подобрать такие компоненты для питательной среды, которые увеличивали бы удельную активность коллагеназы.
При проведении исследований было изучено изменение удельной активности коллагеназы в течение семи суток в зависимости от добавления солей. По окончании культивирования культуральную жидкость отделяли от культуры дрожжей центрифугированием (3500-4000 об/ мин). Значения удельной коллагеназной активности измеряли на 1, 3, 5, 7 и 9 сутки. Результаты исследований представлены в таблицы 4.
Наибольшая удельная коллагеназная активность была достигнута на седьмые сутки при добавлении соли КН2РО4 в питательную среду и составляла 14,6 ед/мг.
При определении удельной активности коллагеназы определяли титруемую кислотность культуральных жидкостей. Полученные результаты представлены на рисунке 2.
культивирования. От сюда следует, что концентрация кол-лагеназы возрастала в связи высокой динамикой накопления биомассы в течение трех суток.
На основании проведенных исследований доказано, что оптимальным временем культивирования Qavispora lusitaniae Y 3723 составляет семь суток, выращивание необходимо осуществлять при 25°С на МПБ с добавлением соли КН2РО4. Добавляя соль, повышается коллагеназная активность, а оптимальность выращивания дрожжей в течение 7 суток обусловлена тем, что за это время накопление биомассы Qavispora lusitaniae Y 3723 происходит быстрее всего. Кроме того, за это время в культуральной жидкости коллагеназа достигает активности, достаточной для эффективной биоконверсии коллагенсодержащего сырья.
Подбор оптимальных параметров культивирования позволит эффективно использовать штамм Qavispora lusitaniae Y 3723, что увеличит выход заменимых и незаменимых аминокислот при переработке коллагенсодержащего сырья как источника коллагена. Применение данного способа переработки коллагенсодержащего сырья частично позволит избавиться от отходов на мясоперерабатывающих предприятиях.
Рисунок 2. Изменение тируемой кислотности в процессе культивирования Clavispora lusitaniae Y 3723 на МПБ при 25°С
Результаты проведенных исследований показали, что в течении 7 суток титруемая кислотность снизилась с 18 до 16°Т, что свидетельствует о снижении количества кислот в культуральной жидкости к концу инкубации. В то же самое время удельная коллагеназная активность сильно увеличилась за трое суток и незначительно увеличивалась до конца
Таблица 4. Изменение удельной активности коллагеназы в процессе культивирования Clavispora lusitaniae Y 3723
Удельная активность коллагеназы, ед/мг белка сутки
1 I 3 I 5 I 7 I 9
Ыа01_______________________________________________________________________________________________________________________________________
3,20±0,09 I 10,80±0,32 I 12,6±0,37 I 13,10±0,39 I 13,20±0,40
КН.РО,_____________________________________________________________________________________________________________________________________
2,50±0,08 I 11,00±0,33 I 13,10±0,39 I 14,60±0,44 I 14,60±0,44
СаСО3______________________________________________________________________________________________________________________________________
2,40±0,07 | 11,70±0,35 | 12,80±0,38 | 13,20±0,40 I 13,50±0,41
Список использованных источников
1. Вторичные сырьевые ресурсы пищевой и перерабатывающей промышленности АПК России и охрана окружающей среды. Справочник/Под общ. ред. акад. РАСХН Е.И.Сизенко.
- М.: Пищепромиздат, 1999.
2. Антипова Л. В., Мишин С. Е. Совершенствование технологии производства белкового стабилизатора//Мясная индустрия. 2001. №12.
3. Патшина М. В. Разработка технологии вареных мясных продуктов с использованием коллагенового полуфабриката из свиной шкурки: Автореф. дис... канд. техн. наук. — Кемерово: КемТИПП, 2003.
4. Еремеев, Н.Л. Ферментативный гидролиз кератинсодержащего сырья для получения белковых гидролизатов / Н.Л. Еремеев, И.В. Николаев, И.Д. Керученько и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. №6. С. 717-724.
5. Lachance M.A. The D1/D2 domain of the large-subunit rDNA of the yeast species Clavispora lusitaniae is unusually polymorphic / M.A. Lachance, H.M. Daniel, W. Meyer, G.S. Prasad, S.P. Gautam, K. Boundy-Mills // FEMS Yeast Res. - 2003. - V. 4. P. 253-258.
6. Шорманов, В.К. Фотометрическое определение коллагена / В.К. Шорманов, Г.Г Булатников // Журнал аналит. химии.
- 2006. - Т. 61, № 4. - С. 351-355. Антипова, Л.В. Методы исследования мяса и мясных продуктов / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов. - М.:Колос, 2001. - 376 с.
