CC BY
167. Old anthrax burials - possible sources of infection spread / A. K. Galiullin, S. A. Klimina -Text: direct // Veterinary doctor.-2004.-№3-4.-p. 36-38
8. Characteristics of the epizootic situation for anthrax in the Republic of Tatarstan / A. P. Rodionov, S. V. Ivanova, L. A. Melnikova, Kh. N. Makaev, A. G. Khisamutdinov, A. S. Kozlov - Text: direct // Veterinary science. - 2020. - No. 3. - P. 8-11.
УДК 636:612.017:57.087 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-5-39-46
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗАТОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ЕСТЕСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОБЛУЧЕННЫХ КРЫС
Кобялко В.О. - кандидат биологических наук, Саруханов В.Я. - кандидат биологических наук, Полякова И.В., Губина О.А.
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии» (249032, Калужская область, г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км. e-mail: nar@obninsk.org, sarukhanov.vladimir@yandex.ru)
Определение уровня естественной резистентности человека и животных имеет существенное значение для оценки состояния организма, тяжести развития негативных процессов и прогноза последствий при воздействии техногенных факторов внешней среды. Имеющиеся методы определения гуморальных факторов естественной резистентности трудоёмки, требуют больших объёмов испытуемой сыворотки или плазмы крови, реактивов и тест-культуры. Это затрудняет их применение при большом количестве исследуемых образцов в модельных токсикологических и радиобиологических исследованиях, а так же при массовом обследовании сельскохозяйственных животных на техногенно загрязнённых территориях. Успешному решению этой проблемы может способствовать автоматизация процесса определения с помощью технических решений, используемых для иммуноферментного анализа. Проведённые исследования показали, что значения лизоцимной, в-литической и бактерицидной активности крови облучённых крыс, определённых как с помощью стандартных методов, так и ИФА достоверно не различаются. Динамика исследованных гуморальных факторов естественной резистентности у животных после радиационного воздействия в диапазоне доз от 3 до 12 Гр зависела от дозы облучения, а не от способа определения. Было продемонстрировано, что применение ИФА для определения уровня естественной резистентности животных позволяет: в несколько раз снизить объем изучаемой сыворотки или плазмы крови и тест-культуры; увеличить количество одновременно анализируемых образцов, выполнять измерения в параллельных пробах, что позволяет значительно повысить точность определения изучаемых показателей.
Ключевые слова: естественная резистентность, крысы, кровь, лизоцимная, Р-литичекая, бактерицидная активность, методы определения, иммуноферментный анализатор
Воздействие внешней среды отражается на состоянии естественной резистентности организма человека и животных. К гуморальным факторам естественной резистентности относятся находящиеся во внеклеточных жидких средах организма (плазма крови, лимфа, межклеточная жидкость) вещества, которые способствуют обезвреживанию чужеродных тел, а также влияют на активность иммунных реакций. Эти вещества - бактериолизины действуют, главным образом, на грампозитивную (лизоцим, Р-лизины) и грамнегативную микрофлору (система комплемента) [1]. Концентрация комплемента и лизоцима снижается при нарушении зооги-гиенических условий содержания животных, тогда как снижение Р-литической активности характеризует тяжёлые патологические процессы [2, 3]. Продемонстрировано, что при облучении в сублетальных дозах происходит повышению активности лизоцима и Р-литической активности крови, а в летальных - снижение этих показателей [4, 5]. Оценка гуморальных факторов естественной резистентности имеет первостепенное значение не только для контроля условий содержания и кормления сельскохозяйственных животных, но и для выявления состояния организма, тяжести развития негативных процессов, прогноза и выбраковки. Однако, определение этих показателей при диспансеризации животных может быть затруднительным из за трудоёмкости и продолжительности выполнения существующих методов анализа, которые основаны на последовательной кюветной фотометрии отдельных вариантов образцов смеси плазмы крови и тест-культуры до и после инкубации [6-8]. Успешному внедре-нию методов определения естественной резистентности в практику, как при массовом обследовании животных в условиях хозяйств, так и в рамках модельного
эксперимента со множеством исследуемых факторов будет способствовать автоматизация процесса, например с помощью технологических систем, используемых для иммуноферментного анализа. Современные иммуноферментные анализаторы (ИФА) - это автоматизированные установки, выполняющие функции смешивания реагентов, движения образца, очищения миксеров и дозаторов, инкубирования испытуемых образцов, а также стерилизацию системы, позволяющие выполнять полный цикл анализа. Последовательность выполнения всех стадий анализа контролируется программным обеспечением. В качестве кюветы при использовании ИФА применяются 96 луночные планшеты (объем лунки 300 мкл). Все перечисленные возможности потенциально могут быть использованы для проведения реакций определения уровня естественной резистентности. Поэтому целью настоящей работы стало изучение возможности использования иммуноферментного анализатора Бупа1ек МЯ 5000 для определения гуморальных факторов естественной резистентности крыс (бактерицидной, лизоцимной и Р-литической активности крови) после гамма-облучения в разных дозах.
Материал и методы. Объектом исследования служила плазма крови 25 беспородных белых крыс (по 5 животных в группе). Все работы с животными были выполнены в соответствии с общепринятыми этическими нормами, на основе стандартных операционных процедур, принятых во ВНИИРАЭ и правил Европейской Конвенции по защите животных, используемых для научных целей (ETS 123) [9].
Животных облучали в диапазоне доз от 3 до 12 Гр, с шагом 3 Гр на стационарной исследовательской установке ГУР 120 с мощностью дозы 1 Гр/ч (источник 60Со). Одна группа животных служила контролем.
Кровь отбирали одноразовыми стерильными шприцами с раствором цитрата натрия (конечная концентрация - 0,38%) из бифуркации брюшной вены через трое суток после радиационного воздействия. Для получения плазмы кровь центрифугировали при 3000 об/мин, в течение 15 мин.
В реакции определения лизоцимной и ß-литической активности плазмы крови использовали эталонный штамм Bacillus subtilis и ацетоновый порошок Micrococcus lysodecticus. Лизоцимную и ß-литическую активность плазмы крови определяли общепринятыми методами с использованием фотоколориметра КФК ХЛ-42в [6-8].
Параллельно эти показатели определяли с помощью ИФА Dynatech MR 5000. В этом случае пропорционально уменьшали объем плазмы крови и тест-культуры Bacillus subtilis и Micrococcus lysodecticus с последующим тестированием при длине волны 540 нм.
Пропорциональное уменьшение
компонентов реакций с учётом объема лунки планшета (300 мкл) при определении лизоцимной активности составило для образца испытуемой плазмы крови с 200 до 40 мкл., а тест-культуры с 1200 до 240 мкл При определении ß-литической активности объем плазмы уменьшился с 200 до 90 мкл., а тест-культуры 400 до 180 мкл, соответс-твенно. В обоих случаях использовали одинаковые суспензии тест-культур.
Бактерицидную активность крови определяли общепринятым методом с использованием эталонного штамма E. coli и измерения оптической плотности на КФК ХЛ-42в [8].
Параллельно оптическую плотность контрольных и опытных образцов оценивали с помощью планшетного спектрофотометра системы иммуноферментного анализа Dynatek MR 5000. Для этого из экспериментальных пробирок, в которых проходила реакция отбирали по 300 мкл суспензии в лунки
планшета и определяли оптическую плотность при синем светофильтре (длина волны 490 нм).
Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и пакета программ Microsoft Excel 2003. Различия значений считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследований. В настоящем исследовании для определения гуморальных факторов естественной резистентности облучённых крыс, наряду со стандартным подходом, использовали систему иммуноферментного анализа Dynatek MR 5000, которая позволяет проводить необходимые реакции и измерения непосредственно в ячейках 96-ти луночного планшета.
Активность лизоцима крови определяли следующим образом: в два ряда лунок 96-ти луночного планшета (А и В) отбирали по 40 мкл испытуемой плазмы крови. В ряд «А» добавляли по 240 мкл 0,75 М раствора сахарозы, а в ряд «В» аналогичный объем суспензии Micrococcus lysodecticus. Количество образцов и повторностей анализируемых за один раз определяется числом лунок планшета и требованиями эксперимента. Планшет с образцами фотометрировали (зеленый светофильтр, X=540 нм). После этого планшет помещали в термостат системы ИФА и инкубировали образцы в течение 120 мин (время инкубации для крыс) и затем повторно измеряли оптическую плотность содержимого лунок. В зависимости от вида животных время инкубации может возрастать до 180 мин.
Для определения ß-литической активности в два ряда лунок планшета (А и В) помещали по 90 мкл испытуемой плазмы крови. В ряд «А» добавляли по 180 мкл 0,75 М раствора сахарозы, а в ряд «В» аналогичный объем суспензии Bacillus subtilis. Затем, планшет с образцами фото-метрировали (зеленый светофильтр, X= 540 нм). После этого его помещали в термостат системы ИФА и инкубировали образцы в течении 120 мин и повторно измеряли оптическую плотность (зеленый свето-фильтр, X = 540 нм). Лизоцимная и ß-литическая активность крови рассчитывалась по формуле:
где:
Б1- оптическая плотность контрольного образца (первый ряд лунок смесь плазмы крови и раствора сахарозы);
Б2 - оптическая плотность опытного образца до инкубации (второй ряд лунок, смесь плазмы крови и тест-культуры);
- оптическая плотность контрольного образца после инкубации; Б21 - оптическая плотность опытного образца после инкубации
ЬЛ или БЬЛ - лизоцимная или Р-литическая активность крови, выраженная в процентах.
Бактерицидную активность оценивали с использованием общепринятого метода. Однако образцы на заключительном этапе фотометрировали на фотоколориметре КФК ХЛ-42в, помещая необходимое количество образца в кювету для измерения и, параллельно, с использованием спектрофото-метрического блока системы ИФА, измеряя оптическую плотность аликвоты образца, отобранного в лунку (синий светофильтр, ^=490 нм).
На рисунках 1-3 представлены данные по динамике лизоцимной, Р-лити-ческой и бактерицидной активности крови
крыс после облучения в диапазоне доз от 3 до 12 Гр, полученные с помощью 2-х вариантов процедуры измерения. Достоверных различий в значениях лизоцимной, Р-литической и бактерицидной активности крови, полученных 2-я способами не обнаружено.
Облучение приводило к снижению лизоцимной активности крови в зависимости от дозы радиационного воздействия (рис. 1). Достоверное снижение этого показателя на 7 и 30% по сравнению с контрольными значениями отмечали при дозах облучения 9 и 12 Гр, соответственно ^ <0,005).
Доза облучения, Гр
Рисунок 1 - Динамика лизоцимной активности крови крыс. 1 - КФК ХЛ-42в; 2 - Dynatech MR 5000
Аналогичные результаты были получены при определении Р-литической активности крови облучённых крыс (рис. 2). При дозах облучения 3 и 6 Гр регистрировали незначительное снижение значения показателя, тогда как при дозах 9 и 12 Гр его снижение достигало 30-40% по сравнению с контролем (Г <0,005).
Изменений бактерицидной активности крови при облучении крыс в дозах 3 и 6 Гр не отмечали (рис. 3). В то же время, после облучения животных в дозах 9 и 12 Гр регистрировалось снижение бактерицидной активности на 25 - 30% по сравнению с контрольными данными (Р <0,005).
Рисунок 2 - Динамика Р-литической активности крови крыс. 1 - КФК ХЛ-42в; 2 - Dynatech MR 5000
Рисунок 3 - Динамика бактерицидной активности крови крыс. 1 - КФК ХЛ-42в; 2 -Dynatech MR 5000
Заключение. Таким образом, проведенные исследования показали, что значения лизоцимной, Р-литической и бактерицидной активности крови облу-чённых крыс, определённые как с помощью фотоколориметра, так и ИФА достоверно не различаются. Динамика исследованных гуморальных факторов естественной резистентности у животных после радиационного
воздействия в диапазоне доз от 3 до 12 Гр зависела от дозы облучения, а не от способа определения. При дозе облучения 3 и 6 Гр изученные показатели имели тенденцию к снижении, а при лучевой болезни тяжелой степени (9 и 12 Гр) уровень лизоцимной, Р-литической и бактерицидной активности облучённых крыс был достоверно ниже по сравнению с контрольными значениями.
Аналогичные результаты были получены при тотальном облучении сельскохозяйственных и других лабораторных животных [4, 5, 10 - 12].
В результате проведённых исследований было продемонстрировано, что применение ИФА для определения уровня естественной резистентности животных позволяет:
1. В несколько раз снизить объем изучаемой сыворотки или плазмы крови и тест-культуры.
2. Увеличить количество одновременно анализируемых образцов.
3. Проводить исследование в параллельных пробах, что позволяет повысить точность определения изучаемых факторов резистентности животных.
Использование ИФА практически полностью автоматизирует процесс определения уровня естественной резистентности организма при воздействии негативных факторов внешней среды, что особенно важно в модельных токсикологических и радиобиологических исследованиях, а так же при массовом обследовании сельско-хозяйственных животных на техногенно загрязнённых территориях.
Литература
1. Скопичев, В.Г. Физиология животных и этология / В.Г. Скопичев. Т.А. Эйсымонт, Н.П. Алексеев, И.О. Боголюбова, А.И. Енукашвили, Л.Ю. Карпенко - М.: Колос, 2013. - 720 с. - Текст: непосредственный.
2. Скопичев, В.Г. Физиология животных и этология В.Г. / Скопичев. Т.А. Эйсымонт, Н.П. Алексеев, И.О. Боголюбова, А.И. Енукашвили, Л.Ю. Карпенко - М.: Колос, 2013.-720 с. - Текст: непосредственный.
3. Бухарин, О.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицин / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев - Томск, 1977. - 187 с. - Текст: непосредственный.
4. Бухарин, О.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев -Томск, 1974. - 209 с. - Текст: непосредственный.
5. Симптоматика лучевой болезни и естественная резистентность телят после тотального облучения / В.Я. Саруханов, В.О. Кобялко - Текст: непосредственный // Ветеринарный врач. - 2019. -№ 4. - С. 36-40.
6. Особенности течения острой лучевой болезни овец на фоне респираторных заболеваний / В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, Л.А. Бастракова, В.О. Кобялко - Текст: непосредственный // Радиация и риск. - 2017. - Т. 26 - № 4. - С. 124-132.
7. Метод определения бета-литической активности крови сельскохозяйственных животных / В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, П.Г. Царин - Текст: непосредственный // Сельскохозяйственная биология. - Т. 42. - № 4 - 2007. - С. 123-125.
8. Метод определения активности лизоцима крови сельскохозяйственных животных /
B.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, И.М. Колганов - Текст: непосредственный // Сельскохозяйственная биология. - 2012. - №2. - С 119-123.
9. Модификация метода определения бактерицидной активности крови сельскохозяйственных животных / В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, Э.Б. Мирзоев, В.О. Кобялко -Текст: непосредственный // Сельскохозяйственная биология - 2007. - №2. - С. 119-122.
10. Оценка последствий внешнего у-облучения и ранний прогноз исхода острой лучевой болезни овец / В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов, В.Г. Епимахов - Текст: непосредственный // Ветеринарный врач. - 2015. - №1. - С. 29-33
11. Бета-литические свойства крови, при действии ионизирующих излучений / В.Я. Саруханов, Н.Н. Исамов - Текст: непосредственный // Сельскохозяйственная биология - 2005 - №2 -
C. 116-118.
12. Влияние бактериальных препаратов на выживаемость облученных животных / В.Н. Мальцев, К.К. Гуценко, Н.В. Емченко, А.Г. Швачко - Текст: непосредственный // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1994. - Т. 34. - Вып. 4-5. - С. 578-581.
13. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purpose. Cet №:123. Date 18.03.1986. Status as of:15.03.2010
USING AN ENZYME IMMUNOASSAY TO DETERMINE HUMORAL FACTORS OF NATURAL
RESISTANCE IN IRRADIATED RATS
Kobyalko V.O. - Candidate of Biology, Sarukhanov V.Ya. - Candidate of Biology, Polyakova I.V., Gubina O.A.
FSBSI "Russian Research Institute of Radiology and Agroecology", (249032, Kaluga region, Obninsk, Kiyevskoye Highway, 109 km, e-mail: nar@obninsk.org, sarukhanov.vladimir@yandex.ru)
Determining the level of natural resistance is essential for assessing the state of the human body and animals, the severity of the development of negative processes and the forecast of consequences when exposed to man-made environmental factors. The available methods for determining humoral factors of natural resistance are labor-intensive and require large amounts of test serum or plasma, reagents, and test culture. This makes it difficult to use them for a large number of samples in model Toxicological and radiobiological studies, as well as for mass inspection of farm animals in technogenically polluted territories. Automation of the detection process with the help of technical solutions used for enzyme immunoassay can help solve this problem successfully. Studies have shown that the values of lysozyme, fi-lytic and bactericidal activity of the blood of irradiated rats, determined using standard methods, and ELISA do not differ significantly. The dynamics of the studied humoral factors of natural resistance in animals after radiation exposure in the dose range from 3 to 12 Gy depended on the radiation dose, and not on the method of determination. It was demonstrated that the use of ELISA to determine the level of natural resistance of animals allows to: decrease the volume of the studied serum or blood plasma test and culture; to increase the number of simultaneously analyzed samples, to measure parallel samples to maximize the accuracy of the studied parameters.
Keywords: natural resistance, laboratory animals, blood, lysozyme, P-lithionic, activity, detection methods, enzyme immunoassay
References
1. Skopichev, V.G. Animal physiology and ethology / V.G. Skopichev. T.A. Eysymont, N.P. Alekseev, I.O. Bogolyubova, A.I. Enukashvili, L.Yu. Karpenko - M.: Ear, 2013. - 720 pages - the Text: direct.
2. Skopichev, V.G. Animal physiology and V.'s ethology of / Skopichev. T.A. Eysymont, N.P. Alekseev, I.O. Bogolyubova, A.I. Enukashvili, L.Yu. Karpenko - M.: An ear, 2013.-720 pages - the Text: direct.
3. Bukharin, O.V. Sistema of a beta lysine and her role in clinical and experimental medicine / O.V. Bukharin, N.V. Vasilyev - Tomsk, 1977. - 187 pages - the Text: direct.
4. Bukharin, O.V. Lizotsim and his role in biology and medicine / O.V. Bukharin, N.V. Vasilyev -Tomsk, 1974. - 209 pages - the Text: direct.
5. Symptomatology of radiation sickness and natural resistance of calfs after total radiation / V.Ya. Sarukhanov, V.O. Kobyalko - the Text: direct//Veterinarian. - 2019. - No. 4. - Page 36-40.
6. Features of a course of sharp radiation sickness of sheep against the background of respiratory diseases / V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov, L.A. Bastrakova, V.O. Kobyalko - the Text: direct//Radiation and risk. - 2017. - T. 26 - No. 4. - Page 124-132.
7. Method of determination of beta and lytic activity of blood of farm animals / V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov, P.G. Tsarin - the Text: direct//Agricultural biology. - T. 42. - No. 4 - 2007. - Page 123-125.
8. Method of determination of activity of lysozyme of blood of farm animals /V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov, I.M. Kolganov - the Text: direct//Agricultural biology. - 2012. - No. 2. - With 119-123.
9. Modification of a method of determination of bactericidal activity of blood of farm animals / V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov, E.B. Mirzoyev, V.O. Kobyalko - the Text: direct//Agricultural biology -2007. - No. 2. - Page 119-122.
10. Assessment of consequences of external y-radiation and the early forecast of an outcome of sharp radiation sickness of sheep / V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov, V.G. Epimakhov - the Text: direct//Veterinarian. - 2015. - No. 1. - Page 29-33
11. Beta and lytic properties of blood, at action of ionizing radiation / V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov - the Text: direct//Agricultural biology - 2005 - No. 2 - Page 116-118.
12. Influence of bacterial medicines on survival of the irradiated animals / V.N. Maltsev, K.K. Gutsenko, N.V. Emchenko, A.G. Shvachko - the Text: direct//Radiation biology. Radio ecology. - 1994. - T. 34. - Issue 4-5. - Page 578-581.
13. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purpose. Cet №:123. Date 18.03.1986. Status as of:15.03.2010
УДК 619:615.9:616-099-02:632.95 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-5-46-53
КЛИНИКО-ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ НА ФОНЕ ОТРАВЛЕНИЯ ЦИАНОПИРЕТРОИДАМИ И ЛЕЧЕНИИ
хМаланьев А.В. - кандидат биологических наук, хХаликова К.Ф. - кандидат ветеринарных наук, хЯмалова Г.Р. , 2Маланьева А.Г. - кандидат биологических наук, хАлеев Д.В. - кандидат биологических наук; хЕгоров В.И. - кандидат биологических наук
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок-2, e-mail: vnivi@mail.ru)
2ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» (420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, e-mail: public.mail@kpfu.ru)
В связи с увеличением ассортимента и масштабов применения пестицидов в сельскохозяйственной практике, а также загрязнением окружающей среды промышленными и бытовыми отходами, актуальность проблемы отравлений пестицидами с каждым годом возрастает. Ввиду широкого использования пестицидов устойчивость к ним вредителей сельскохозяйственных культур постепенно повышается, вследствие этого отмечается тенденция роста использования смешанных пестицидов. Циперметрин, проходя через гематоэнцефалический барьер в центральной нервной системе, вызывает нейротоксичность, и вследствие этого двигательный дефицит. Данный пестицид не только вызывает нейротоксичность в центральной нервной системе, но и влияет на периферическую нервную систему. Одной из самых важных частей в комплексном лечении при отравлении циперметрином является антидотная терапия. Ввиду малого объема информации о лечении при отравлении препаратами циперметрина в средне-смертельной дозе, целью наших исследований являлось изучение воздействия цианопиретроида (fi-циперметрин) на гематологические и биохимические показатели крови животных (белые крысы) на ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИОНАЛОВ ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
