CC BY
10
СТАТЬИ НА РУССКОМ ЯЗЫКЕ
ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
DOI - 10.32743/UniTech.2024.122.5.17600
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ПРИ ОБНАРУЖЕНИИ АНТИТЕЛ К ВИРУСНОМУ ГЕПАТИТУ С
Хамидов Шерзод Алишер угли
независимый исследователь, PhD инженер технолог ГП «РАДИОПРЕПАРАТ», Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: [email protected]
Садиков Илхом Исмаилович
д-р техн. наук, академик, директор, Институт Ядерной физике при АН РУз, Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: info@inp. uz
Абдукаюмов Аюбхон Мелисович
д-р техн. наук, директор, ГП «РАДИОПРЕПАРАТ», Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: addukayumovl968@yandex. ru
Рихсиев Аброр Зикирович.
канд. хим. наук, Главный технолог, ГП «РАДИОПРЕПАРАТ», Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: polimer.19 79@yandex. ru
Зайцева Олеана Анатольевна.
инженер технолог, ГП «РАДИОПРЕПАРАТ», Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: info@inp. uz
Хаитбаев Алишер Хамидович
д-р хим. наук, профессор, Национальный университет Узбекистана имени М. Улугбека,
Республика Узбекистан, г. Ташкент E-mail: [email protected]
THE USE OF ENZYME IMMUNOASSAY IN THE DETECTION OF ANTIBODIES TO VIRAL HEPATITIS C
Sherzod Khamidov
Independent researcher, PhD Technologist State Enterprise "RADIOPREPARAT",
Uzbekistan, Tashkent
Библиографическое описание: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ПРИ ОБНАРУЖЕНИИ АНТИТЕЛ К ВИРУСНОМУ ГЕПАТИТУ С // Universum: технические науки : электрон. научн. журн. Хамидов Ш.А. [и др.]. 2024. 5(122). URL: https://7universum. com/ru/tech/archive/item/17600
A UNIVERSUM:
№ 5 (122)_m ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ_май. 2024 г.
Ilkhom Sadikov
Dr. Tech. Sciences, Academician, Director Institute of Nuclear Physics under the Academy of Sciences of the Republic of Uzbekistan,
Uzbekistan, Tashkent
Ayubkhon Abdukayumov
Dr. Tech. Sciences, Director SE "RADIOPREPARAT", Uzbekistan, Tashkent
Abror Rikhsiev
PhD Chem. Sciences, Chief Technologist SE "RADIOPREPARAT", Uzbekistan, Tashkent
Oleana Zaitseva
Technologist SE "RADIOPREPARAT", Uzbekistan, Tashkent
Alisher Khaitbaev
Dr. Chem. Sciences, Professor National University of Uzbekistan named after M. Ulugbek,
Uzbekistan, Tashkent
АННОТАЦИЯ
Хронический гепатит С (ХГС) представляет серьезную угрозу для глобального здоровья, поскольку он является основной причиной развития гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и ведущим показанием для трансплантации печени. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), во всем мире 130-150 миллионов человек страдают ХГС, что приводит к 350-500 тысячам смертей ежегодно. Ранняя диагностика ХГС имеет решающее значение для своевременного лечения и предотвращения неблагоприятных последствий. Иммуноферментный анализ (ИФА) является широко используемым методом для выявления антител к вирусу гепатита С (ВГС) в клинических лабораториях. ИФА обеспечивает высокую чувствительность и специфичность, что позволяет точно диагностировать ХГС. Разработка эффективных методов ИФА для обнаружения антител к ВГС является важной задачей для совершенствования диагностики ХГС. В этой статье обсуждаются современные достижения в разработке методов ИФА. Усовершенствованные методы ИФА позволили улучшить чувствительность и специфичность диагностики ХГС, что привело к более точным результатам тестирования и своевременной постановке диагноза.
ABSTRACT
Chronic hepatitis C (CHC) is a serious global health threat because it is the main cause of hepatocellular carcinoma (HCC) and it is also the main reason for liver transplantation. As stated by the World Health Organization (WHO), 130-150 million people worldwide are living with CHC, which brings 350,000-500,000 deaths every year. The early detection of CHC is of great importance as it helps in the prompt treatment and avoidance of negative consequences. Enzyme immunoassay (EIA) is a method that is extensively used for the detection of antibodies against hepatitis C virus (HCV) in clinical laboratories. EIA enables the identification of CHC with a high degree of sensitivity and specificity, thus, it can be used for the accurate diagnosis of CHC. The creation of the effective EIA methods for HCV antibody detection is a very significant research area which is aimed to increase the CHC diagnostics. This article presents the recent progress in the development of EIA assay, such as the application of synthetic peptides and recombinant antigens, the optimization of EIA conditions, and the automation of the process. The new EIA methods have improved the sensitivity and specificity in CHC diagnostics, thus the test results and the diagnosis are more accurate and the patient is diagnosed in a timely manner. This contributes much to the improvement of treatment results and decreasing the load of CHC-related diseases.
Ключевые слова: иммуноферментный анализ (ИФА), антитела, вирус, гепатит, ВОЗ.
Keywords: enzyme immunoassay (EIA), antibodies, virus, hepatitis, WHO.
Введение
Вирусный гепатит С относится к числу распространенных заболеваний. В структуре инфекционной патологии вирусные гепатиты составляют 16-30%, а по частоте поражения населения уступают лишь гриппу и острым респираторным вирусным инфекциям [1]. По данным ВОЗ, на сегодняшный день более 2 млрд человек в мире инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ), у более 400 млн из них -хронический гепатит В (ХГВ); 130-250 млн человек инфицированы вирусом гепатита С (ВГС), у 175 млн из них - хронический гепатит С (ХГС) [2]. По данным ВОЗ, ежегодно почти 700 000 человек умирают от неблагоприятных исходов ХГС и около 1 млн человек - от исходов ХГВ [3]. По данным ВОЗ, в 2015 году смертность от ХГВ составила 887 000, а в 2017 - 786 000, в целом смертность от ХГВ стоит на 10-м месте среди всех причин смерти (глобальный отчет ВОЗ по вирусным гепатитам, 2017) [3]. Распространенность вирусного гепатита С среди населения Узбекистана составляет 13,3% [4].
В большинстве случаев острый вирусный гепатит С (ОВГС) характеризуется мало симптомным или латентным течением [5]. В связи с этим в последние годы во всем мире методы лабораторной диагностики приобретают решающее значение в постановке диагноза данного заболевания [6-8]. Для лабораторной диагностики ОВГС традиционно используются иммуноферментный анализ (ИФА), который основан на выявлении серологических маркеров инфекции, и полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая идентифицировать РНК вируса гепатита С (ВГС) [9]. Несмотря на то что ПЦР является высокоэффективным методом диагностики ОВГС, ее широкое использование в практическом здравоохранении ограничивается в связи с необходимостью дорогостоящего оборудования [10].
В связи с чем целью настоящей работы является повышение выявляемости вирусного гепатита С у инфицированных ВГС (генотипы 1Ь и 3а), упрощение процесса постановки иммуноферментного анализа и удешевление диагностических наборов для выявления антител к вирусу гепатита С иммуно-ферментным методом имеет важное теоретическое и практическое значение.
Материалы и методология исследования
В лабораторной диагностике и мониторинге HCV инфекции используют два основных подхода:
• серологические методы, основанные на обнаружении специфических антител к HCV (анти-HCV антител);
• молекулярно-биологические методы, основанные на обнаружении РНК вируса.
Методы анализа, основанные на обнаружении анти-HCV антител, используются как для скрининга, так и для диагностики HCV-инфекции. Специфичность современных тест-систем для иммунофермент-ного анализа (ИФА) анти-HCV антител превышает 99%.
Для выявления антител к вирусу гепатита С иммуноферментным методом, включающем иммобилизацию смеси рекомбинантных сердцевинных антигенов и трех неструктурных белков (N83, N84, N85) вируса гепатита С, провели инкубацию контрольных и исследуемых проб с иммобилизованными рекомбинантными антигенами, отмывали несвязанные компоненты, все пробы буферного раствора с антителами, конъюгированными пероксидазой, отмывали, добавляли субстрат с красителем, добавляя раствор серной кислоты анализировали все пробы с помощью фотометрии. При этом для иммобилизации смеси рекомбинантных сердцевинных антигенов и трех неструктурных белков дополнительно использовали антигены N83^ HCV генотипа 3а (а.а. 1189-1465), №4а+Ь (а.а.1689-1735) и N85 НСУ генотипа 1Ь, которые предварительно разводили в 50мМ растворе карбонат-бикарбонатного буфера (рН 9,5-9,7) с 8 М мочевины десятикратно. После иммобилизации вышеуказанных антигенов и неструктурных белков сорбент обрабатывали буферным раствором, содержащим 0,175% сухого обезжиренного молока и 5% сахарозы, при этом в качестве проявляющего буферного раствора использовали однокомпонентный субстратный раствор, содержащий 0,005% тетраметилбензидина и 0,006% Н2О2, с рН 3,3.
Результаты и их обсуждение
Принцип анализа для обнаружения антител к вирусному гепатиту С основан на методе непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. При измерении оптической плотности смеси в лунках при длине волны 450-620 нм определяли критическую оптическую плотность (ОПкр), добавлением к средней оптической плотности отрицательного контрольного образца ОН Кср константной величины 0,15:
ОПкр=ОП К" + 0,15
При этом исследуемые образцы с оптической плотностью выше ОПкр учитывались как положительные. Исследуемые образцы с оптической плотностью ниже ОПкр учитывались как отрицательные. Некоторые полученные данные приведены в 1 -таблице.
Таблица 1.
Сравнительные результаты иммуноферментного анализа на полистироловом сорбенте антигенами ВГС, иммобилизованными при нейтральном трис-буфере рН 7,2( по наиболее близкому аналогу - НБА) и с предварительным 10-кратным разведением в 50мМ карбонат-бикарбонатном буферном растворе с 8 (VI мочевины (по предлагаемому способу).
№ Номер сыворотки Оптическая плотность по НБА Интерпретация результатов Оптическая плотность по предлагаемому Интерпретация результатов
1 217 0,078 отр 0,014 отр
2 196 0,176 ст. полож 0,036 отр
3 257 0,128 отр 0,024 отр
4 304 0,107 отр 0,032 отр
5 367 0,061 отр 0,006 отр
6 370 0,441 полож 0,153 неопр.
7 375 0,245 полож 0,044 отр
8 387 0,041 отр 0,028 отр
9 389 0,067 отр 0,022 отр
10 393 0,003 отр 0,016 отр
11 394 0,003 отр 0,002 отр
12 396 0,006 отр 0,004 отр
13 401 1,074 полож 0,016 отр
14 432 0,015 отр 0,004 отр
15 395 0,238 ел. полож 0,056 отр
16 445 0,039 отр 0,011 отр
17 487 0,066 отр 0,017 отр
18 492 0,370 полож 0,038 отр
19 576 0,014 отр 0,023 отр
20 277 0,020 отр 0,02 отр
Приведенные в таб. 1 результаты иллюстрируют значительное улучшение специфичности при иммобилизации антигенов по предлагаемому способу, что способствует снижению вероятности получения ложноположительных результатов при исследованиях пациентов на наличие в крови антител к ВГС.
По результатам проведенных исследований, качественные характеристики способа (по предлагаемому) составили:
• чувствительность 100%;
• специфичность 100%.
Следует отметить, что такие высокие качественные характеристики обусловлены применением заявленного способа, который является неочевидным оригинальным и работает в совокупности существенных отличий. Он включает в себя выбор иммобилизуемых белков-антигенов определенных генотипов, специфичных для региона Центральной Азии, и в сочетании с последующими операциями позволяет производить конкурентоспособную
тест-систему для диагностики вирусного гепатита С в промышленном масштабе.
Заключение
1. Цена 100 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) составляет 80-200€, а цена 1000 г сухого обезжиренного молока составляет 2,1-2,5€. Из представленных данных можно сделать вывод, что для промышленного производства иммуноферментных тест-систем применение буфера, содержащего 0.175% сухого обезжиренного молока и 5% сахарозы, является оптимальным и более экономичным.
2. Производимая в Государственном предприятии «РАДИОПРЕПАРАТ» диагностическая тест-система отвечает всем требованиям Фармакопейного комитета и Министерства Здравоохранения и является надежной, востребованной, доступной по цене и необходимой в рамках стратегии импорт замещения, проводимой правительством Республики Узбекистан.
Список литературы:
1. Ющук Н.Д., Климова Е.А., Знойко О.О. и др. // Рос. журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии -2010. -№ 6. -С. 4-60.
2. Centers for Disease Control and Prevention. Viral hepatitis surveillance. - United States, 2017. Atlanta: US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. - 2019. - Available at: https://www.cdc.gov/hepatitis/ statistics/2017surveillance/index.htm.
№ 5 (122)
UNIVERSUM:
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
• 7universum.com
май, 2024 г.
3. World Health Organization. World Hepatitis Report. - Geneva, 2017. Available at: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/255016/9789241565455-eng.pdf;jsessionid =10847CB8AB36884692B8BEBBD0D54EB5?seque nce=1,accessedAug17,2020.
4. Ruzibakiev R., Kato H., Ueda R. et al. Risk factors and seroprevalence of hepatitis В virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency vims infection in Uzbekistan. Intervirology. 2001,44 (6): 327-332.
5. Гепатиты: рациональная диагностика и терапия; под ред. М. Фукса; пер. с нем. под ред. А.О. Буеверова. М.: ГЭОТАР-Медиа 2010; 235.
6. Кишкун А.А Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. М.: МИА 2006; 536.
7. Круглов И.В., Огиенко О.Л., Знойко О.О., Финогенова М.П., Янина М.В., Дорошенко Н.В., Шибнев В.А., Семилетов Ю.А. Исследование сероконверсии к pазличным антигенам вируса гепатита С у больных гепатитом С с различными исходами. Вопросы вирусологии. 2003; 2: 36-40.
8. Круглов И.В., Знойко О.О., Климова Е.А., Финогенова М.П., Алексеенкова Т.И., Янина М.В., Воропаева А.В., Воропаев Е.В., Калинин А.Л., Дорошенко Н.В., Шибнев В.А., Семилетов Ю.А. Выявление типоспецифических анти-НСМ84-антител у больных гепатитом С методом иммуноферментного анализа. Вопросы вирусологии 2003; 3: 32-36.
9. О применении некоторых статистических методов в иммунологических исследованиях: инструктивное письмо № 345 Института иммунологии ФМБА от 15.07.2005. М. 2005; 35.
10. ПЦР в реальном времени; под общ. ред. Д.В. Ребрикова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний 2009; 223.
11. Афанасьев А.Ю., Зубов С.В., Жданов Ю.Е., Кривопускова А.В. ИФА-диагностика в разграничении гепатита С острого и хронического течения. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2005; (5) 3; прил. 1: 12.
