CC BY
22
УДК 543.553.3+57.088.6
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕАКЦИИ RHODOCOCCUS OPACUS 1CP
НА Э-ХЛОРБЕНЗОАТ
Е.В. Емельянова, И.П. Соляникова
Была изучена скорость реакции на 3-хлорбензоат иммобилизованных клеток актинобактерии Rhodococcus opacus 1CP, выращенной в различных условиях. Показано, что биосенсорный метод - инструментальный подход, позволяющий быстро и с минимальными затратами получить информацию об активности ферментов культуры-деструктора.
Ключевые слова: Rhodococcus opacus 1CP, иммобилизованные клетки, 3-хлорбензоат, биосенсорныый подход.
Введение
Более 2000 галогензамещённых ароматических соединений поступает в биосферу в процессе жизнедеятельности растений, насекомых, бактерий, грибов и млекопитающих, а также в процессе различных реакций, имеющих место в океанах, атмосфере и почве [1]. Большие количества галогензамещённых ароматических соединений в окружающей среде - отходы химических производств и результат интенсификации сельского хозяйства. Хлорбензоаты широко применяются в сельском хозяйстве как гербициды [2].
Большинство хлорированных ароматических соединений токсично и устойчиво к разложению. Поэтому разрабатываются методы ремедиации почв, в том числе, биологической. Для биоремедиации загрязненных почв используются две стратегии: активация детоксицирующей способности почвенной микрофлоры и интродукция штаммов-деструкторов. Многие виды бактерий рода Pseudomonas и Rhodococcus способны разлагать широкий спектр ксенобиотиков, в том числе хлорбензоаты, хлорфенолы. [3-6]. Актуальным является отбор и внедрение новых перспективных штаммов-деструкторов. При этом важно знать, как ксенобиотик влияет на микроорганизм-деструктор, как изменяется активность ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотика.
Фермент подготовительного метаболизма, который инициирует превращение 3-хлорбензоата (3ХБК) - (хлор)бензоат 1,2-диоксигеназа (хБДО) [7]. Она катализирует реакцию, которая протекает с участием кислорода. В случае стабильных растворимых ферментов несложной структуры их активность можно определить в бесклеточных экстрактах. Бензоат 1,2-диоксигеназа представляет собой двухкомпонентный ферментный комплекс сложной структуры. Его активность не удаётся
определить в бесклеточном экстракте из-за невозможности сохранить фермент в активном состоянии во время разрушения клеток. Поэтому активность БДО и хБДО измеряют в целых клетках по изменению потребления кислорода [8]. Определение проводят в суспензии интактных свежевыращенных клеток.
Удобный способ оценки изменения потребления кислорода под действием субстрата - биосенсорная методика. Эта методика подразумевает исследование реакции на субстрат у иммобилизованных покоящихся клеток. Биосенсорный метод имеет ряд преимуществ. Прежде всего, для биосенсорного анализа требуется небольшое количество биомассы микроорганизмов, а кроме того, характерна быстрота получения ответа.
Цель исследования - изучение скорости реакций на 3ХБК для иммобилизованных клеток актинобактерии Rhodococcus opacus 1CP, выращенной в различных условиях.
Материалы и методы
Микроорганизм и условия культивирования. Объектом исследований была грамположительная неспорообразующая бактерия Rhodococcus opacus штамма 1CP, выделенная из накопительной культуры на 2,4-дихлорфеноле и способная разлагать монохлорфенолы, некоторые дихлорфенолы, бензоат и ряд замещенных бензоатов [9].
Штамм хранили в виде покоящихся клеток при +4 °С в стерильном буфере в течение 5 лет. Проводили активацию клеток: 10 мкл клеточной суспензии высевали на агаризованный мясо-пептонный бульон (МПБ) и отдельные выросшие колонии использовали для инокуляции жидкой среды. Для получения биомассы культуру выращивали на МПБ или на минеральной среде [10] с бензоатом (200 мг/л) в качестве единственного источника углерода и энергии.
Иммобилизация клеток R. opacus 1CP (формирование биорецептора). Клетки, выращенные на МПБ или на среде с бензоатом, отделяли центрифугированием (13000 g, 5 мин, +4 °С) и дважды отмывали Трис-HCl буфером (pH 7,6). Полученную биомассу ресуспендировали в 50 мМ калий-натрий фосфатном буфере (рН 7,4); концентрация клеток в суспензии - 100 мг влажных клеток в мл. Полученную суспензию выдерживали в течение 24 часов при температуре +4 °С, а затем использовали для приготовления биорецептора.
Для формирования биорецептора клетки R. opacus 1CP иммобилизовали на мембране (стекловолокнистая бумага Whatman) методом физической сорбции: 10 мкл суспензии клеток наносили на фрагмент бумаги (4 x 4 мм ) в виде капли диаметром 3-4 мм. Полученный биорецептор подсушивали на воздухе в течение 30-40 мин и фиксировали
на измерительной поверхности кислородного электрода Кларка или хранили в холодильнике при температуре +4 °С.
Определение реакции иммобилизованных клеток R. opacus 1CP на 3ХБК (биосенсорная методика). Чтобы определить реакцию иммобилизованных клеток R. opacus 1CP на 3ХБК, рецепторный элемент, представляющий собой иммобилизованные на носителе клетки актинобактерии, закрепляли на измерительной поверхности кислородного электрода Кларка с помощью нейлоновой сетки. Электрод помещали в открытую кювету с рабочим объемом 5 мл, содержащую 50 мМ калий-натрий фосфатный буферный раствор (рН 7,4) и оснащённую магнитной мешалкой. Все измерения проводили при комнатной температуре и при постоянном перемешивании.
После регистрации базового дыхания иммобилизованных клеток в кювету вносили раствор 3ХБК и фиксировали изменение потребления кислорода клетками с помощью кислородного электрода Кларка. Кислородный электрод преобразовывал химический сигнал (концентрация кислорода) в электрический. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (рА/с), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации кислорода, потреблённого иммобилизованными клетками биорецептора в ответ на внесение субстрата. Скорость реакции клеток на 3ХБК выражали в рА/с.
Кислородный электрод Кларка использовали в комплекте с усилительной системой "Ingold 5313/10 O2 amplifier" (Швейцария-США). Регистрацию сигнала осуществляли с помощью 2 -х координатного самописца "XY Recorder-4103" (Чехословакия).
Индукция активности БДО в клетках R. opacus 1CP в неростовых условиях. Клетки R. opacus 1CP, выращенные на МПБ, отделяли от среды центрифугированием и суспендировали в 50 мМ калий -натрий фосфатном буферном растворе (рН 7,4). В суспензию вносили индуктор - раствор бензоата или 3ХБК. Индукцию проводили при постоянном перемешивании суспензии. Для этого колбу с суспензией помещали на круговую качалку. Индукция проходила в течение суток. Затем клетки отделяли центрифугированием, промывали 50 мМ калий-натрий фосфатным буферным раствором (рН 7,4) и суспендировали клетки в том же буфере. Полученную суспензию индуцированных клеток использовали для формирования рецепторного элемента.
Повторность измерений в экспериментах - трёхкратная. Представленные результаты отражают усреднённые величины. Статистический анализ данных проводили с использованием теста Стьюдента, принимая достаточным критерий вероятности Р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Rhodococcus opacus 1СР был способен расти на 3ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии [11]. (Хлор)бензоат 1,2-диоксигеназа, инициирующая метаболизм 3ХБК, является индуцибельным ферментом. Детектируемые количества этого фермента синтезировались в клетках R. opacus 1СР при росте на средах, содержащих субстраты хБДО, 3ХБК в данном случае. О присутствии этого фермента в клетках актинобактерии судили по реакции интактных бактериальных клеток на субстрат диоксигеназы [12].
Для суспензии свежевыращенных клеток Rhodococcus opacus 1СР, которые культивировали в среде с 3-хлорбензоатом, была зафиксирована реакция на 3ХБК. Однако она отсутствовала у клеток, выращенных в отсутствие 3ХБК. У иммобилизованных клеток реакцию на 3ХБК наблюдали независимо от присутствия 3ХБК в среде культивирования или в буфере при индукции ферментного пула культуры.
Известно, что скорость реакции иммобилизованных клеток на субстрат опосредуется двумя процессами: метаболизм субстрата под действием ферментного аппарата клетки и процессы транспорта субстрата в клетку [13]. Очевидно, что при отсутствии фермента, инициирующего деструкцию субстрата, реакция клеток на субстрат определяется процессами транспорта субстрата в клетку.
а)
б)
< 14 -
ш X
12 -
10 -
4 -
20 40 60
Концентрация 3ХБК, мМ
80
20
ш X со
15
10
1 2 3 4 5
Конентрация 3ХБК, мМ
Рис. 1. Влияние концентрации 3ХБК на скорость реакции на субстрат иммобилизованных клеток Я. враем 1СР, выращенных на МПБ
6 -
8 -
6 -
5
2 -
0
0
0
0
6
7
Клетки R. opacus 1СР были выращены на МПБ (отсутствие 3ХБК) и иммобилизованы на носителе. На рис. 1 приведены примеры кривых зависимости скорости реакции (V) иммобилизованных клеток родококка
на 3ХБК от концентрации (5) последнего. Форма полученных кривых (рис. 1 а и б) характерна для кинетики насыщения. Обращает на себя внимание отсутствие ярко выраженного плато: снижение скорости реакции после достижения максимума. Это характерно для роста микроорганизмов на токсичных источниках питания [7], каковым и является 3-хлорбензоат.
Построение графиков, представленных на рис. 1, в обратных координатах показало наличие двух линейных участков на графике зависимости 1/У-1/8 (рис. 2). Это является доказательством бифазной кинетики насыщения для исследованного нами процесса. Бактериальные клетки были выращены на среде, не содержащей субстратов БДО. Поэтому зафиксированная реакция иммобилизованных клеток на 3ХБК (рис. 1) может быть обусловлена процессами транспорта субстрата (3ХБК) в клетку. Очевидно, в исследованных условиях для транспорта 3ХБК в клетки актинобактерии Я. ораст 1CP был характерна двухфазная кинетика насыщения. По-видимому, имелись две системы транспорта 3ХБК в клетки микроорганизма, которые действовали при определённой концентрации вещества.
а)
б)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 1/Б
1,0 1
0,8 -
0,6 -
0,4 -
0,2 -
0,0
20
40 1/Э
60
80
2,0 -
1,6 -
1,2 -
0,8 -
0,4 -
0,0
0
Рис. 2. Зависимость V от £ в двойных обратных координатах для иммобилизованных клеток Я. враем 1СР, выращенных на МПБ, где £ - концентрация 3ХБК в мМ, V- скорость реакции на 3ХБК в рА/с
В подтверждение бифазной кинетики насыщения с помощью графика в двойных обратных координатах были обнаружены два интервала концентраций 3ХБК, где наблюдали прямо-пропорциональную зависимость 1/У от 1/5. Первый - от 0,01 до 0,26 мМ и второй интервал -при концентрации 3ХБК выше 0,26 мМ. Для каждого из этих интервалов были определены константы 50,5, где 505 - концентрация субстрата, при которой V = 0,5 Утах. При концентрации 3ХБК ниже 0,26 мМ 80,5 составили
0,13 мМ и 0,038 мМ для примера а и примера б (рис. 1), соответственно. Для второго интервала - 0,70 мМ и 1,04 мМ, соответственно. При концентрации 3ХБК менее 0,26 мМ действовала система с большим сродством к субстрату - 3-хлорбензоату. Таким образом, примеры а и б, приведённые на рис. 1, различались по степени сродства систем транспорта к субстрату. В примере а были использованы свежеприготовленные иммобилизованные бактериальные клетки, а в примере б - после хранения в течение месяца. Снижение сродства к 3ХБК при хранении клеток, возможно, было связано с частичной инактивацией компонентов транспортных систем.
Двухфазная кинетика насыщения была обнаружена для процесса поступления бензоата в интактные клетки Alcaligenes denitrificans BRI 6011 [14]. Km для систем с высоким и низким сродством с субстрату (бензоату) составляли 0,72 цМ и 5,3 цМ, соответственно. Их значение было на порядок ниже констант, полученных нами (см. выше) для систем транспорта 3ХБК в иммобилизованные клетки R. opacus 1СР. Однако, в [14] скорость транспорта оценивали по убыли радиоактивно меченного субстрата. В настоящем исследовании о скорости транспорта судили опосредованно по изменению скорости дыхания иммобилизованных клеток в присутствии субстрата - 3ХБК (скорость реакции клеток на 3ХБК). Не следует забывать, что интенсивность (скорость) дыхания - это реакция, которая является комплексным ответом всей клетки, а не только одного конкретного ферментного комплекса. Это, по-нашему мнению, одна из причин отличия констант, полученных нами, от данных литературного источника.
Ранее для интактных клеток R. opacus 1СР нами было показано наличие конкуренции за БДО между бензоатом и моно-хлорбензоатами [10, 12]. Для 3-хлорбензоата тип ингибирования был определён как двухпараметрически согласованное, рассчитаны константы ингибирования. Ks бензоата (21,2 мкМ) для клеток, выращенных на бензоате, была на порядок меньше константы ингибирования БДО 3-хлорбензоатом (565 мкМ). Таким образом, в присутствии бензоата в клетках R. opacus 1СР синтезируется БДО, специфичная и к 3ХБК. Была проведена индукция БДО бензоатом и хБДО 3-хлорбензоатом в неростовых условиях в клетках актинобактерии, выращенных на МПБ (отсутствие бензоата и 3ХБК). У интактных клеток, выращенных в отсутствие бензоата или 3ХБК, отсутствовала реакция на 3-хлорбензоат. А после индукции указанными выше субстратами у интактных клеток была зафиксирована реакция на 3ХБК. То есть происходила индукция БДО, специфичной не только к бензоату, но и 3ХБК. Поэтому для клеток R. opacus 1СР, индуцированных бензоатом или 3-хлорбензоатом в неростовых условиях и иммобилизованных после индукции, была
измерена скорость реакции на 3ХБК. Результаты измерений представлены на рис. 3.
X со
а)
20 40 60
Концентрация 3ХБК, мМ
80
б)
в)
г)
ш
X
2 4 6 8 10
Концентрация 3ХБК, мМ
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
20
40 1/Э
60
80
16 -
12 -
8 -
4 -
0
0
0
0
Рис. 3. Зависимость скорости реакции на 3ХБК от концентрации
субстрата для клеток Я. враем 1СР, иммобилизованных после индукции бензоатом (а,б) или 3-хлорбензоатом (в,г), в координатах V-S (а, в) и в двойных обратных координатах (б,г), где £ - концентрация 3ХБК в мМ, V- скорость реакции на 3ХБК в рА/с
Поскольку после индукции в клетках присутствовала диоксигеназа в детектируемых количествах, то в этом случае реакция иммобилизованных клеток на 3ХБК была обусловлена не только процессами транспорта субстрата (3ХБК) в клетку, но процессом превращения субстрата под действием фермента. Однако процесс и в этом
случае был двухфазным. При концентрации 3ХБК менее 0,26 мМ константы равнялись 0,062 мМ (при индукции бензоатом) и 0,047 мМ (при индукции 3-хлорбензоатом). А при концентрациях субстрата выше 0,26 мМ они составили 0,51 мМ и 0,52 мМ, соответственно. Были получены практически одинаковые константы независимо от того, какой индуктор был использован: бензоат или 3ХБК. По величине константы были выше, чем рассчитанные для неиндуцированных клеток (рис. 1). Однако, по -нашему мнению, отмеченный факт не связан однозначно со снижением специфичности к субстрату ферментных систем индуцированных клеток. В случае индуцированных клеток S05 - это комплексная величина, характеризующая прочность связывания 3ХБК как с ферментом подготовительного метаболизма, так и с транспортным посредником. Схема формирования константы, обобщающей два процесса, пока не понятна. Как меняется комплексная величина при изменении специфичности констант для каждого процесса, ещё не ясно.
Для сравнения была измерена скорость реакции на 3ХБК иммобилизованных после длительного хранения (около года) клеток R. opacus 1СР, выращенных на среде с бензоатом (200 мг/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. Полученные результаты представлены на рис. 4.
а)
б)
ш X со
20 40 60 80 100 120
Концентрация 3ХБК, мМ
1,0 п
0,6 -
0,4 -
0,0
1/Э
20
0,8 -
15
^ 10
5
0,2 -
0
0
0
2
4
6
8
Рис. 4. Зависимость скорости реакции на 3ХБК от концентрации субстрата для иммобилизованных клеток Я. враем 1СР, выращенных в присутствии бензоата, в координатах V-S (а) и в двойных обратных координатах (б), где £ - концентрация 3ХБК в мМ, V- скорость
реакции на 3ХБК в рА/с
Двухфазная кинетика была зафиксирована и в этом случае. Однако область перехода от системы с высоким сродством к области с низким сродством к субстрату смещалась в область более высоких концентраций
3ХБК. Кроме того, длительное хранение клеток приводило к снижению прочности связывания субстрата с ферментными системами клеток: рассчитанные S0.5 были 0,30 мМ и 5,66 мМ.
Таким образом, биосенсорная методика может быть использована для оценки активности ферментного аппарата, определяющего интенсивность метаболизма культуры-деструктора. Она существенно облегчает и ускоряет проведение исследований.
Список литературы
1. Роль микроорганизмов в трансформации устойчивых органических полютантов: Учебное пособие / Л.А. Головлёва [и др.]. Тула: Изд-во ТулГу, 2008. 100 с.
2. Hartmann J., Reineke W., Knackmuss H.-J. Metabolism of 3-chloro-, 4-chloro-, and 3,5-dichlorobenzoate by a pseudomonad // Appl. Environm. Microbiol. 1979. V. 37. No. 3. P. 421-428.
3. Isolation and characterization of a 3-chlorobenzoate degrading pseudomonad / E. Dorn, M. Hellwig, W. Reineke [et al.] // Arch. Microbiol. 1974. V. 99. P. 61-70.
4. Plasmid specifying total degradation of 3-chlorobenzoate by a modified ortho pathway / Deb K. Chatterjee, S.T. Kellogg, S. Hamada [et al.] // J. Bacteriol. 1981. V. 146. No. 2. P. 639-648.
5. Особенности разложения 4-хлорбифенила и 4-хлорбензойной кислоты штаммом Rhodococcus ruber P25 / Е. Г. Плотникова [и др.] // Микробиология. 2012. Т. 81. № 2. С. 159-170.
6. Влияние состояния покоя на штамм Pseudomonas fluorescens 26К - деструктор ксенобиотиков / И.П. Соляникова [и др.] // Микробиология. 2013. Т. 82 № 5. С. 552-562.
7. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М: Наука, 1982. 144 с.
8. Farr D.R., Cain R.B. Catechol oxygenase induction in Pseudomonas aeruginosa // Biochem. J. 1968. V. 106. P. 879-885.
9. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis / С.Н. Горлатов [и др.] // Микробиология. 1989. V. 58. C. 802-806.
10. Benzoate degradation by Rhodococcus opacus 1CP after a dormancy: characterization of dioxygenases involved in the process / I.P. Solyanikova, E.V. Emelyanova, O.V. Borzova [et al.] // J. Environm. Sci. Health. 2016. Part B. V. 51. No. 3. P. 182-191.
11. Деградация 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата Rhodococcus opacus 1CP / О.В. Моисеева [и др.] // Микробиология. 1999. Т. 68. №. 4. С. 461466.
12. Solyanikova I.P., Borzova O.V., Emelyanova E.V. Kinetics of interaction between substrates/substrate analogs and benzoate 1,2-dioxygenase from benzoate-degrading Rhodococcus opacus 1CP // Folia Microbiol. 2017. V. 62. No. 4. P. 355-362.
13. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. Биосенсоры: основы и приложения. М: Мир, 1992. 614 с.
14. Uptake of benzoic acid and chloro-substituted benzoic acids by Alcaligenes denitrificans BRI 3010 and BRI 6011 / C.B. Miguez, C.W. Greer, J.M. Ingram [et al.] // Appl. Environm. Microbiol. 1995. V. 61. No. 12. P. 41524159.
Емельянова Елена Викторовна, канд. техн. наук, научный сотрудник, elenvemaihpm.pushchino.ru, Россия, Пущино Московской области, ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Соляникова Инна Петровна, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, innasaihpm.pushchino. ru, Россия, Пущино Московской области, ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
AN APPLICATION OF IMMOBILIZED RHODOCOCCUS OPACUS 1CP CELLS TO STUDY THE CULTURE RESPONSE TO 3-CHLOROBENZOATE
E. V. Emlyanova, I.P. Solyanikova
The rate of the response of immohilized cells of actinohacterium Rhodococcus opacus 1CP, grown under different conditions, to 3-chlorohenzoate was studied. It has heen shown that a hiosensor method is a tool that enahles one to ohtain information ahout the activity of enzymes of the culture-destructor rapidly and with minimum difficulty.
Key words: Rhodococcus opacus 1CP, immohilized cells, 3-chlorobenzoate, biosensor approach.
Emelyanova Elena Victorovna, candidate of technical science, researcher, elenvem@,ihpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, FSBIS G.K. Skryahin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Solyanikova Inna Petrovna, doctor of hiological sciences, innas@,ihpm.pushchino. ru, leading researcher, Russia, Pushchino, Moscow Region, FSBIS G.K. Skryahin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences
