CC BY
0Использование ГКР-активных мембран для single-cell анализа антибиотикорезистентности
В.А.Мушенков,1 В.И.Кукушкин,2 А.Н.Нечаев,3 Е.Г.Завьялова1
1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, строение 3, ГСП-1
2ИФТТРАН им. Ю.А. Осипьяна, 142432, Московская обл., Черноголовка, ул. Академика
Осипьяна, д.2
3Объединенный институт ядерных исследований, 141980, г. Дубна, ул. Жолио-Кюри, д. 6
*e-mail: vladimir. mushenkov@mail. ru
В настоящее время одной из наиболее важных проблем современной медицины является антибиотикорезистентность, возникающая, когда бактерии путем генетических мутаций или горизонтального переноса генов приобретают устойчивость к антибактериальным препаратам. Интенсивное использование антибиотиков во многих сферах человеческой деятельности приводит к возрастающим темпам распространения антибиотикорезистентности и снижению эффективности антибактериальной терапии. Сложность излечения устойчивых инфекций обуславливается ещё и тем, что используемые методы определения чувствительности патогена к выбранной схеме лечения весьма долгие (типичное время анализа - несколько суток), поэтому антибактериальный препарат часто выбирается эмпирически.
Нами был разработан быстрый (время анализа 1-2 часа) метод определения антибиотикорезистентности, основанный на спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) формазана. Формазан выделяется при обработке бактерий тетразолиевым красителем МТТ, причем его концентрация коррелирует с жизнеспособностью бактерий, таким образом, устойчивые штаммы будут иметь гораздо более выраженный спектр формазана после обработки антибиотиком, чем чувствительные.
Чувствительность метода (1*107 клеток / мл) достаточна для исследования выделенных чистых культур, однако слишком низкая для исследования клинических образцов напрямую. В данной работе мы предложили способ повышения чувствительности с использованием гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). В качестве субстрата для ГКР были предложены наночастицы серебра и хрома, иммобилизованные на поверхности пористой полимерной мембраны. Наноразмерные поры мембраны пропускают воду и мелкие частицы, задерживая бактерии и кристаллы формазана. Нами были рассмотрены различные вариации мембран и наночастиц, а также различные длины волн лазера КР -спектрометра. За счет эффекта ГКР чувствительность удалось повысить до 1*103 клеток в миллилитре, что достаточно для большинства клинических образцов. Также, усиление ГКР достаточно для получения спектра единичной клетки с использованием рамановского микроскопа. Измеряя количество формазана в отдельной клетке, можно сделать вывод о её устойчивости к антибиотику, причем усредненные результаты измерений нескольких клеток совпадают с полученными без использования микроскопа и ГКР активной мембраны. Таким образом, при помощи рамановского микроскопа возможно проводить исследования образцов вплоть до сверхнизких концентраций в несколько клеток на образец.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-6500015, https://rscf.ru/project/24-65-00015/
