CC BY
10059. Todorov S.D., Dicks L.M. Characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from spoiled black olives. J. Basic Microbiol. 2005, 45 (4): 312-322.
60. Troost F.J., van Baarlen P., Lindsey P. et al. Identification of the transcriptional response of human intestinal mucosa to Lactobacillus plantarum WCFS-1 in vivo. BMC Genomics. 2008, 9: 374.
61. Tsapieva A., Duplik N., Suvorov A. Structure of plantaricin locus of Lactobacillus 8P-A3. Beneficial Microbes. 2011, 2 (4): 255-261.
62. Walter J. Ecological role of lactobacilli in the gastrointestinal tract: implication for fundamental and biomedical research. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74 (16): 4985-4996.
63. Willey J.M., van der Donk WA. Lantibiotics: peptides of diverse structure and function. Ann. Rev.Microbiol. 2007, 61: 477-501.
64. Zamfir M., Grosa-Tudor S. Impact of stress condition on the growth of Lactobacillus acidophilus IBB-801 and production of acidophilin 801. J.Gen.Microbiol. 2009, 55 (4): 277282.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Рыбальченко Оксана Владимировна, д.б.н., проф., 199106, С.-Петербург, Университетская набережная, 7/9, р.т. (812)230-79-62
© А.В.НАУМИК, 2013 А.В.Наумик
СПЕКТРОСКОПИЯ КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ: ДОСТИЖЕНИЯ, ПРЕИМУЩЕСТВА, ПЕРСПЕКТИВЫ
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург
При всем многообразии существующих методов выявления микроорганизмов остается нерешенным вопрос об ускоренной диагностике возбудителей тяжелых заболеваний, внутрибольничных инфекций и других микробных агентов, имеющих эпидемиологическое значение. В тех случаях, когда необходимо иметь результат исследования в течение кратчайшего срока, необходимы методы, не требующие специальной длительной подготовки исследуемого материала и выделения чистой культуры микроорганизмов. К ним относятся оптико-спектральные методы, среди которых наибольшего внимания заслуживает спектроскопия комбинационного рассеяния света, или рамановская спектроскопия, применению которой посвящен данный обзор. Возможность получения в течение нескольких минут информации о входящих в состав изучаемой пробы компонентах позволяет использовать рамановскую спектроскопию во многих отраслях биологии и медицины. Высокая специфичность метода основана на абсолютной уникальности спектров различных веществ и на практике составляет 96 — 97%, чувствительность — 95%. Полная автоматизация процесса, использование новейшего математического аппарата для считывания и предоставления результатов исследования позволяют избежать влияния человеческого фактора и повышают объективность полученных данных. Аналитическая надежность, своевременность получения результата и экономическая эффективность дают право рассматривать спектрометрию комбинационного рассеяния света в качестве перспективного универсального экспрессного метода в микробиологической диагностике.
Журн. микробиол., 2013, № 4, С. 100—110
Ключевые слова: микробиологическая диагностика, поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия (ПУРС), конфокальная микроскопия
A.V.Naumik
RAMAN SPECTROSCOPY IN MICROBIOLOGICAL DIAGNOSTICS: ACHIEVEMENTS, ADVANTAGES, PERSPECTIVES
Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St. Petersburg, Russia
Despite all the diversity of existing methods of detection of microorganisms the question of accelerated diagnostics of causative agents of severe diseases, nosocomial infections and other microbial agents that have epidemiologic significance remains unsolved. In the cases when the result of the study must be available as soon as possible, methods that do not require special prolonged preparation of the studied material and isolation of pure culture of microorganisms are necessary. These include optical-spectral methods, among those combinative light scattering spectroscopy or Raman spectroscopy deserves the most attention, the review being dedicated to its application. The ability to obtain information on components comprising the studied sample within several minute allows to use Raman spectroscopy in many fields of biology and medicine. High specificity of the method is based on absolute uniqueness of specters of various substances and in practice is 96 — 97%, sensitivity — 95%. Full automation of the process, use of the newest mathematical apparatus for readout and provision of the results of the study allow to avoid the effect of human factor and increase the objectivity of the data obtained. Analytical reliability, timely reception of the result and economical effectiveness entitle to consider Raman spectrom-etry as a perspective universal express method in microbiological diagnostics.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 4, P. 100—110
Key words: microbiological diagnostics, surface enhanced Raman spectroscopy (SERS), confocal microscopy
Основной задачей лабораторной диагностики является получение объективных данных о составе (химическом и клеточном) биоматериалов и изменениях, доказательно связанных причинно-следственными взаимоотношениями с определенными патологическими процессами и состояниями в организме человека [7]. Эта информация необходима для решения очень важных медицинских задач, начиная с обнаружения признаков болезней (диагностика и дифференциальная диагностика) и определения активности патологического процесса, заканчивая определением эффективности проводимого лечения и прогноза заболевания. При этом достоверность получаемых сведений об изучаемом объекте зависит, в первую очередь, от используемых для этого технологий. До 70% принимаемых решений в большинстве клинических дисциплин основываются на данных лабораторных исследований, количество которых ежегодно растет. Согласно статистическим данным Минздрава Российской Федерации, лаборатории учреждений здравоохранения (без учета ведомственных и частных структур) в течение года выполняют свыше 3 млрд анализов. В 2008 году на одного больного в стационаре в среднем приходилось 38,9 анализов, на 100 амбулаторных посещений — 122 анализа. Лабораторные исследования составляют 89,3% от общего количества объективных диагностических исследований. В ведомственных учреждениях здравоохранения обеспечение анализами пациентов заметно выше, чем в среднем по стране [5]. Анализ отчетов по регионам однозначно свидетельствует о росте количества исследований как специализированных, так и массовых рутинных и увеличении среди них доли высокотехнологичных исследований.
В настоящее время остается актуальным вопрос о биологической опасности. Она объясняется существованием в природе очагов особо опасных инфекций,
наличием больных и бактерионосителей опасных возбудителей, обусловливающих высокие показатели уровня заболеваемости в развивающихся странах с высоким уровнем миграции и перемещения населения до 75%, в странах с высоким уровнем развития — до 45% [3]. Эволюция микроорганизмов, являющаяся одной из причин изменения вирулентности микроорганизмов и приобретения ими новых патогенных свойств среди ранее непатогенных видов, может стать проблемой наряду с биотерроризмом, при котором используются микроорганизмы с измененными биологическими свойствами.
Применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы определения микроэкологического статуса, а также диагностики инфекций имеют определенные ограничения и недостатки. Классические методы диагностики, используемые в микробиологии, обладают максимальной достоверностью, однако они дороги, весьма трудоемки и длительны по времени, что затрудняет своевременную индикацию и идентификацию возбудителя. Как известно, при первичном посеве биологического материала на питательные среды срок появления видимых колоний составляет от одних до нескольких суток. Столько же по времени занимает этап получения чистой культуры, без которого нельзя определить этиологическую значимость микроорганизма. Идентификация патогена с использованием биохимических тестов также занимает период времени от нескольких часов до нескольких суток. Альтернативным методом для пробирочной дифференциации бактерий может служить использование планшетных тест-систем. С их помощью на одном планшете можно проводить биохимическую идентификацию нескольких штаммов микроорганизмов. Использование тест-систем для ускоренной дифференциации микроорганизмов позволило сократить время этого этапа до 4 — 6 часов.
Существенным недостатком классического бактериологического исследования является, кроме того, невозможность оценки роли некультивируемых микроорганизмов в инфекционно-воспалительном процессе, прежде всего — анаэробов.
В последние годы значительное место в индикации микроорганизмов стали занимать иммунологические методы, в основе которых лежат реакции взаимодействия между антигеном и антителом. В настоящее время разработано большое количество методов для выявления возбудителей и соответствующих им антител. Наиболее распространенным методом является иммуноферментный анализ. Тем не менее, даже в этом случае длительность реакции и время получения результата составляет 3 — 4 часа.
Более быстрым методом выявления микроорганизмов или иммунных комплексов является флуоресцентный анализ, который занимает по времени 1,0 — 1,5 часа. Использование моноклональных антител и высокоочищенных фракций микроорганизмов позволило повысить чувствительность флуоресцентных методов до 95 — 98% [24]. Иммунологические методы используются в качестве дополнительных к классическим методам диагностики и являются непрямыми, поскольку выявляют не возбудителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации [8].
Современный шаг в индикации микроорганизмов и оценке их генетически обусловленных свойств внесли молекулярные методы диагностики — исследование ДНК возбудителей. В настоящее время эти методы являются наиболее чувствительными при изучении геномного аппарата в животном мире. Тем не менее,
время постановки реакций определяется задачами исследования и используемым оборудованием и может занимать от 2 — 3 часов до нескольких дней. Более того, молекулярные методы позволяют выявить лишь ДНК микроорганизма, но не дают ответа на вопрос о наличии жизнеспособных микроорганизмов [33].
В целом, известные молекулярно-биологические методы при таких несомненных преимуществах, как высокие специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций, имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки [17].
Так или иначе, все имеющиеся недостатки в известной степени увеличивают неопределенность в сведениях о состоянии внутренней среды пациента, процессов жизнедеятельности отдельных органов и тканей, а также организма пациента в целом. Таким образом, снижается ценность получаемой информации, для обеспечения которой необходимо разрабатывать методы исследования биоматериалов, применение которых позволит обнаруживать искомый компонент биоматериала и при необходимости измерять его содержание, а также условия для выполнения исследований биоматериалов и интерпретации их результатов, обеспечивающих получение достоверной и своевременной лабораторной информации. Ведь реальную клиническую ценность она имеет только при условии предоставления ее в сроки, позволяющие принять необходимые лечебные меры.
Из всего выше сказанного следует, что наиболее востребованными являются такие методы диагностики, которые позволяют быстро и с высокой степенью достоверности выявлять в биологическом материале искомый компонент, наличие и количество которого напрямую связано с теми или иными патологическими состояниями организма.
Наиболее актуальны эти методы в микробиологической диагностике, так как микроорганизмы являются возбудителями в случае инфекционного заболевания, а также могут включаться на любом этапе в патогенетический механизм развития соматического заболевания. Некоторые из них требовательны к условиям транспортировки и культивирования, что затрудняет и удлиняет их лабораторную диагностику.
В ряде публикаций подчеркивается, что в настоящее время резко возрос интерес к новым методам диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний, при которых используются оптико-электронные приборы, позволяющие проводить качественный и количественный анализ биологических жидкостей и тканей в максимально короткие сроки. Кроме того, существует возможность получения информации о видовой характеристике микроорганизмов без их длительного выращивания на основе физико-химических свойств значимых компонентов бактериальной клетки и характерных продуктов ее метаболизма [12, 19, 23, 29, 44, 45].
Исходя из этого, представляется возможным на основе физико-химических свойств молекул и данных аналитических методов разрабатывать и использовать современные экспресс-методы микробиологической диагностики с высокой степенью достоверности, которые позволят сократить время лабораторной диагностики и расширить ее применение, в том числе в экстренных случаях, особенно, когда мы имеем дело с высоковирулентными бактериями или их метаболитами, например, токсинами. Известно, что если ведущую роль в развитии
заболевания играет токсин, то первоочередной задачей становится его обнаружение в максимально короткие сроки. Непрекращающаяся циркуляция многих возбудителей инфекционных заболеваний среди населения, а также возможность всплесков эпидемий заставляют держать на контроле диагностику этих инфекций и совершенствовать методы индикации токсинов и других метаболитов, являющихся факторами патогенности микроорганизма.
В связи с этим, такие экспресс-методы должны, как минимум, отвечать некоторым требованиям стандартных химико-токсикологических анализов. Как известно, задача любого химико-токсикологического анализа состоит в том, чтобы установить природу и концентрацию разнообразных токсичных веществ с устойчивыми свойствами или активно метаболизирующихся в организме и дать заключение об их токсичности [2]. Объектами такого анализа могут быть любые биологические жидкости и ткани.
Именно поэтому круг методов токсикологических анализов включает широкий спектр, содержащий большое количество методов аналитической химии, применяемых как по отдельности, так и в комбинации друг с другом: химические, иммунологические, различные виды хроматографии, спектральные [11]. Важным является тот факт, что используемые методы должны обладать весьма низкими пределами обнаружения, а также обеспечивать получение достоверных аналитических сигналов от минимального количества вещества.
Такими преимуществами обладают спектральные и оптико-спектральные методы анализа. Согласно данным по сравнению наиболее часто используемых методов в токсикологическом анализе именно спектральные методы оказываются лучше других по таким показателям, как специфичность, чувствительность, структурный качественный анализ, количественный анализ [6].
В спектральных методах используются свойства молекул или атомов вещества специфически поглощать, испускать, отражать электромагнитное излучение. Спектральные характеристики индивидуальной молекулы зависят от строения, особенностей межатомных сил, распределения заряда и ряда других особенностей. Характеристические полосы или комбинация полос спектра анализируемого вещества могут стать свидетельством того или иного качества, также как и основой для определения отдельных его компонентов. Интенсивность спектральных полос в определенном интервале длины волны пропорциональна концентрации анализируемого вещества в растворе, что создает возможность идентифицировать вещество и оценить его количественное содержание. Поэтому спектральные характеристики отличаются высоким уровнем индивидуальности, что и определяет их ценность при идентификации и изучении строения соединений (особенно органических) [1].
Другим ценным преимуществом спектральных способов является тот факт, что многие из них действуют недеструкционно, то есть без разрушения образца, что позволяет многократно и по-разному исследовать одну и ту же пробу, которая после проведенного анализа может быть пригодна для дальнейшего изучения. Особенно важным представляется то обстоятельство, что многие спектроскопические способы могут быть реализованы непосредственно на месте нахождения подлежащего исследованию образца, а результат анализа выдается в реальном времени [10].
Благодаря многообразию возможностей применения, высокой точности ре-
зультатов, максимальной чувствительности обнаружения и существенному сокращению времени на проведение анализов спектроскопические методы являются в высшей степени экономически эффективными.
В настоящее время интерес многих исследователей в области диагностики и аналитики все чаще останавливается на так называемых спектрах комбинационного рассеяния, которые можно наблюдать при облучении образца светом определенной длины волны. При этом начинается процесс неупругого рассеяния оптического излучения на молекулах вещества (твердого, жидкого или газообразного), сопровождающегося заметным изменением частоты излучения. Наблюдаемое явление называют эффектом комбинационного рассеяния или эффектом Рамана (назван в честь ученого-физика В. Рамана, открывшего его). Возникающее при этом рассеянное излучение регистрируется в виде так называемого спектра комбинационного рассеяния. При этом в спектре рассеянного излучения появляются спектральные линии, которых нет в спектре первичного (возбуждающего) света. При анализе такого спектра наблюдаемые линии могут быть однозначно отнесены к колебаниям молекул исследуемого вещества и определению частот их вращения, и в зависимости от значения частоты, интенсивности, формы, числа и расположения линий позволяют сделать вывод о структуре и идентичности пробы. Не существует двух молекул, которые имеют одинаковые рамановские спектры, при этом интенсивность рассеянного света связана с количеством вещества. Эффект Рамана своим способом поглощения квантов энергии и возбуждения вращений и колебаний значительно отличается от всех прочих молекулярных спектров [1]. Поэтому такие спектры представляют особый интерес для исследователей.
До недавнего времени применение спектроскопии комбинационного рассеяния из-за склонности к флуоресцентным помехам, вызываемым либо самим образцом, либо незначительными примесями, ограничивалось специальными химико-аналитическими целями. Причина появления указанного нежелательного побочного эффекта была связана с использованием видимого и ультрафиолетовой полосы света. С внедрением лазеров, дающих в диапазоне спектра от видимой до ближней инфракрасной областей интенсивный свет высокой монохроматичности, Раман спектроскопия получила сильный импульс к своему дальнейшему развитию [15, 21, 46].
Такой недостаток методики комбинационного рассеяния, как дополнительная мешающая флуоресценция, удалось устранить именно благодаря использованию лазерной техники, работающей в ближней инфракрасной области, причем, такие лазеры оказались идеальными источниками излучения. Они практически исключают появление флуоресценции и одновременно гарантируют щадящую обработку пробы без возможной опасности ее разложения под действием фотолиза или тепловой нагрузки, что является неоспоримым преимуществом данного метода.
Кроме того, стремительное усовершенствование как спектрометрической техники, так и детекторных систем также способствовало развитию и расширению областей применения спектроскопии комбинационного рассеяния. Сегодня сбор, обработка и оценка полученных данных осуществляются с помощью высокопроизводительных компьютеров, что гарантирует надежную и объективную расшифровку спектров.
Важен и тот факт, что в области спектроскопии комбинационного рассеяния
света этап пробоподготовки практически отсутствует, в то время как он является необходимым для некоторых иных спектроскопических методов. Измерения рамановских спектров можно проводить прямо в стеклянных сосудах либо в водном растворе.
При анализе спектров комбинационного рассеяния основная трудность состоит в идентификации линий, т. е. установлении их принадлежности к определенным функциональным группам или целым молекулам. Если смесь веществ содержит много компонентов, то спектр иногда оказывается многолинейчатым и отдельные линии разных компонентов могут перекрываться. Поэтому приходится предварительно разделять сложную смесь на более простые смеси, например дробной перегонкой или хроматографическими методами, а затем каждую смесь анализировать раздельно.
Спектры комбинационного рассеяния идеально подходят для поиска по базам данных благодаря большой спектральной информации, наличию области «отпечатков пальцев» для каждого компонента и простоте алгоритмов поиска.
Все эти преимущества позволяют получать как количественную, так и качественную информацию об образце, дают возможность интерпретировать спектр, пользоваться «библиотекой» спектров, обрабатывать данные с применением компьютерных методов количественного анализа.
Благодаря использованию открытого в 1970-х годах эффекта поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (ПУРС), или эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) (Surface enhanced Ramans scattering, SERS) появилась возможность получать усиленный спектральный сигнал от исследуемых молекул, находящихся вблизи наноразмерных поверхностей благородных металлов (например, золота, серебра или меди). При этом сигнал может быть усилен на 10 — 14 порядков по сравнению с использованием обычной рамановской спектроскопии [31]. Благодаря такому резкому усилению удается решить типичные проблемы слабого сигнала, связанные с минимальными концентрациями анализируемого вещества и ведущие к длительному времени регистрации спектра.
В настоящее время накоплен обширный экспериментальный и теоретический материал по ПУРС молекул, расположенных вблизи поверхности металла [4, 9, 13, 18, 23, 26, 28, 32, 34, 40]. Развитие спектроскопии комбинационного рассеяния света и, в частности, ПУРС можно считать значительным шагом вперед, особенно в анализе биологических образцов. Именно поэтому в последнее время в медицине, биологии, биофизике, стремительно растет число исследований в области применения спектров комбинационного рассеяния света. Спектроскопия комбинационного рассеяния света все чаще получает признание в качестве мощного альтернативного метода в клинической диагностике. Широкое применение принципов комбинационного рассеяния света находит при диагностике онкологических заболеваний, эффективность лечения которых во многом зависит от своевременного и точного диагноза. Проведены исследования по применению спектроскопии комбинационного рассеяния света в комбинации с микроскопическими методами для обнаружения раковых клеток молочной железы [16, 20, 30]. Рядом исследователей показана возможность с помощью спектрометрии комбинационного рассеяния дифференцировать нормальные, доброкачественные и злокачественные опухоли на основе спектральных комбинаций компонентов клеток, характерных для химических и морфологических изменений на той или
иной стадии патологии с чувствительностью 94% и специфичностью 96%. При непрямом изучении образцов, то есть образцов сыворотки, а не ткани, чувствительность и специфичность составляла 97% и 78% соответственно [37]. Выполнены успешные эксперименты in vivo по количественному определению глюкозы в организме крыс. При этом с помощью ПУРС удалось получить спектры именно глюкозы, исключая при этом спектральные характеристики других компонентов межклеточной жидкости, таких как белки плазмы [36].
Спектроскопия КР находит все более широкое применение в протеомике и геномике. Исследования по изучению структурных особенностей некоторых белковых и пептидных молекул (в частности, токсинов различных живых организмов), нуклеиновых кислот демонстрируют уникальность их спектральных характеристик, что позволяет делать выводы о природе их происхождения [13, 14, 25, 27, 35, 42 - 44].
ПУРС нашла также свое применение в иммунохимии, что связано с уникальной информативностью спектров комбинационного рассеяния, характер которых зависит от специфических взаимодействий конкретных молекул, а это, как известно, является ключевым фактором при связывании антиген-антитело [42]. При этом усиливающие сигнал наночастицы металлов сорбируются на клеточной поверхности или связываются с антителами, что позволяет в 50 раз улучшить качество спектра комплекса антиген-антитело.
Аналогичный подход перспективен и в случае обнаружения бактериальных токсинов, что показано в экспериментах по анализу на холеру, в которых золотые наночастицы связывали с антителами против в-субъединицы холерного токсина. Сигнал ГКР от комплекса нанозолото-антитело-токсин позволял получать быстрый положительный результат, учитывая, что регистрация спектра обычно занимает не более 2 — 3 минут. Предел обнаружения в-субъединицы холерного токсина составил 1100 нг [38]. Благодаря этому принципу появилась возможность для обнаружения белка, ДНК, специфических биомаркеров низкого уровня вирусов и бактерий и строгой дифференциации между различными видами и штаммами возбудителей.
Отдельного внимания заслуживает использование спектроскопии комбинационного рассеяния в микробиологической диагностике, когда объектами экспериментов служили живые микробные клетки. Интересны исследования, согласно результатам которых существуют различия между спектрами КР разных видов бактерий, а также различия спектров в пределах одного вида в зависимости от фаз роста или физиологических состояний [42]. Использование спектроскопии КР позволяет выявлять биологические молекулы, такие как ДНК, липиды и белки, непосредственно влияющие на формирование биопленок и прикрепление бактерий к различным поверхностям [23].
Развитие техники сегодня позволяет применять новые методики, используя совместно оптические приборы и спектральную аппаратуру, что дает существенное преимущество, когда появляется возможность получать спектральные характеристики исследуемого объекта с параллельной его видеорегистрацией. Это является одним из возможных путей повышения эффективности обнаружения исследуемых объектов. Наиболее часто в качестве оптической составляющей в этом случае используется конфокальный микроскоп.
Конфокальный микроскоп представляет собой оптический прибор, обладаю-
щий значительным контрастом по сравнению с классическим микроскопом, что достигается использованием диафрагмы с минимальным отверстием, размещенной в конфокальной плоскости, куда проецируется рассматриваемый исследователем объект. Такая диафрагма ограничивает поток фонового рассеянного света, который собирался фронтальной линзой объектива. Таким образом, при использовании конфокального микроскопа появляется возможность в каждый момент времени регистрировать изображение одной точки наблюдаемого объекта, а полноценное изображение строить путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы) Исследования с применением спектроскопии комбинационного рассеяния в сочетании с конфокальной микроскопией позволили получить информацию об отдельных клетках и их компонентах на примере родов Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Escherichia. Подтверждают высокую степень специфичности метода спектроскопии КР эксперименты с большим числом объектов исследования, демонстрирующие уникальность спектральных комбинаций среди 10 различных видов бактерий [22].
В экспериментах, посвященных идентификации бациллы сибирской язвы,были получены спектры эндоспор различных штаммов этой бактерии и найдены сходства в них. При этом была проведена идентификация различных штаммов на уровне вида, точность которой составила от 88% до 100%. Нужно отметить, что этап выделения культуры в этом случае удалось обойти [41], что подтверждается подобными исследованиями [12].
При прямом анализе воды на наличие патогенов с применением спектроскопии КР также были получены обнадеживающие результаты, когда объектами исследования служили споры грамположительных Bacillus atrophaeus и грамотри-цательные Escherichia coli. Были установлены различия в спектрах между двумя видами, а также сходства в пределах одного вида [44]. При оценке применения быстрого и прямого метода обнаружения патогенных микроорганизмов и их токсинов проводились перспективные исследования технологии микрочипов, содержащих участки захвата биомолекул (лиганды), иммобилизованные на ПУРС-ак-тивной поверхности металла. Спектры были получены с параллельной визуальной характеристикой при помощи рамановского микроскопа, так как площадь участка захвата составляла 1 микрон в диаметре. Первоначальные результаты показали, что грамположительные бактерии рода Listeria и грамотрицательные рода Legionella, споры Bacillus и ооцисты Cryptosporidium могут быть индивидуально определены по спектральным «отпечаткам пальцев». Кроме того, спектры КР отражали физиологическое состояние бактериальных клеток: нежизнеспособные и жизнеспособные микроорганизмы в пределах одного вида были дифференцированы. Наконец, были показаны высокие чувствительность и специфичность данной методики при выявлении токсинов, таких как афлатоксины B1 и G1. При этом уникальные спектры КР получались в течение 20 секунд [19].
В целом, за последние десять лет наблюдается стремительный рост применения спектроскопии КР в медицине, биологии, диагностике и смежных областях. Бесспорно, на сегодняшний день существует большое количество достоверных методов лабораторной диагностики, многие из которых имеют определенные недостатки. Спектроскопия КР обусловливает новый подход к идентификации, в том числе и бактериальной, обладая высокими показателями чувствительности,
специфичности, скорости получения результата (как количественного, так и качественного), которые являются первоочередными характеристиками достоверного исследования и обеспечивают такие критерии эффективности работы лаборатории, как аналитическая надежность, своевременность получения результата и экономическая эффективность. Указанные преимущества метода дают основание рассматривать спектроскопию КР в качестве перспективного универсального экспресс-метода в микробиологической диагностике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беккер Ю. Спектроскопия. М., Техносфера, 2009.
2. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. М., Мысль, 1993.
3. Жебрун А.Б., Ценева Г.Я., Хамдулаева Г.Н. Бактериологическая безопасность при дифтерии: от классических методов к современным миниатюрным устройствам специального микробиологического контроля. Биотехносфера. 2012, 1 (19): 20-23.
4. Замалеева А.И. Иммобилизация наноматериалов на поверхности живых клеток эука-риот и прокариот. Автореф. дис. канд. биол. наук. Казань, 2010.
5. Кишкун А.А., Гузовский А.Л. Лабораторные информационные системы и экономические аспекты деятельности лаборатории. М., Лабора, 2007.
6. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство. В.В. Долгов, В.В. Меньшиков (ред.). М., ГЭОТАР-Медиа, 2012.
7. Меньшиков В.В. Исследования вне лаборатории. Средства, технологии, условия применения. М., Агат-Мед, 2008.
8. Михайлова Д.О., Бобылева З.Д., Базарный В.В. Диагностическое значение различных иммунологических методов лабораторной диагностики легионеллеза. Журн. микро-биол. 2008, 2: 51-53.
9. Набиев И. Р., Ефремов Р. Г., Чуманов Г.Д. Гигантское комбинационное рассеяние и его применение к изучению биологических молекул. Успехи физических наук. 1988, 154 (3): 459-495.
10. Шмидт В. Оптическая спектроскопия для химиков и биологов. М., Техносфера, 2007.
11. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Н.Тица (ред.). М., Лабинформ, 1997.
12. Alexander T., Le D. Characterization of a commercialized SERS-active substrate and its application to the identification of intact Bacillus endospores. Appl. Opt. 2007, 46 (18): 38783890.
13. Barhoumi A., Zhang D., Tam F. et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of DNA. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (16): 5523-5529.
14. Benevides J., Overman S., Thomas G. Raman spectroscopy of proteins. Curr. Protoc. Protein. Sci. 2004, Chapter 17: Unit 17.8.
15. Choo-Smith L.P., Edwards H.G., Endtz H.P. et al. Medical applications ofRaman spectroscopy: from proof of principle to clinical implementation. Biopolymers. 2002, 67 (1): 1-9.
16. Chowdary M.V., Kumar K.K., Kurien J. et al. Discrimination ofnormal, benign, and malignant breast tissues by Raman spectroscopy. Biopolymers. 2006, 83: 556-569.
17. Fenollar F., Roux V., Stein A. Analysis of 525 samples to determine the usefulness of PCR amplification and sequencing of the 16S rRNA gene for diagnosis of bone and joint infections. J. Clin. Microbiol. 2006, 3: 1018-1028.
18. Gessner R., Rosch P., Kiefer W. et al. Raman spectroscopy investigation ofbiological materials by use of etched and silver coated glass fiber tips. Biopolymers. 2002, 67 (4—5): 327-330.
19. Grow A., Wood L., Claycomb J. et al. New biochip technology for label-free detection of pathogens and their toxins. J. Microbiol. Methods. 2003, 53 (2): 221-233.
20. Haka A.S., Shafer-Peltier K.E., Fitzmaurice M. et al. Diagnosing breast cancer by using Raman spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2005, 102: 12371-12376.
21. Harrison G.R., Lord R.C. Practical Spectroscopy. New York, 1948.
22. Howell S., Haffajee A., Pagonis T. et al. Laser raman spectroscopy as a potential chair-side microbiological diagnostic device. J. Endod. 2011, 37 (7): 968-972.
23. Ivleva N.P, Wagner M, Horn H.et al. In situ surface-enhanced Raman scattering analysis of biofilm. Anal. Chem. 2008, 80 (22): 8538-8544.
24. Jaanalves G.T. Luminescense and аbsorbtion of hybrid хerogels doped with PbS Nanoparticles prepared by gas diffusion method. Materials Science Forum. 2006: 1221-1224.
25. Kem W., Tu C., Williams R. et al. Circular dichroism and laser Raman spectroscopic analysis of the secondary structure of Cerebratulus lacteus toxin B-IV. J. Protein Chem. 1990, 9 (4): 433-443.
26. Kim N., Lee S., Moskovits M. Aptamer-mediated surface-enhanced Raman spectroscopy intensity amplification. Nano Lett. 2010, 10 (10): 4181-4185.
27. Kinalwa M., Blanch E.W., Doig A.J. Determination ofprotein fold class from Raman or Raman optical activity spectra using random forests. Protein Sci. 2011, 20 (10): 1668-1674.
28. Li L., Hutter T., Finnemore A.S. et al. Metal oxide nanoparticle mediated enhanced Raman scattering and its use in direct monitoring of interfacial chemical reactions. Nano Lett.2012, 12 (8): 4242-4246.
29. Maquelin K., Choo-Smith L., van Vreeswijk T. et al. Raman spectroscopic method for identification of clinically relevant microorganisms growing on solid culture medium. Anal. Chem. 2000, 72 (1): 12-19.
30. Matousek P., Stone N. Prospects for the diagnosis of breast cancer by noninvasive probing of calcifications using transmission Raman spectroscopy. J. Biomed. Opt. 2007, 12: 024008.
31. Mengqiu Li, Jian Xu, Maria Romero-Gonzalez.et al. Single cell Raman spectroscopy for cell sorting and imaging. Curr. Opin. in Biotechnol. 2012, 23: 56-63.
32. Moore B., Stevenson L., Watt A. et al. Rapid and ultra-sensitive determination of enzyme activities using surface-enhanced resonance Raman scattering. Nat. Biotechnol. 2004, 22 (9): 1133-1138.
33. Nikula T. A human Immunochip cDNA microarray provides a comprehensive tool to study immune responses. J. Immunol. Meth. 2005, 1-2: 122-134.
34. Nolan J., Duggan E., Liu E. et al. Single cell analysis using surface enhanced Raman scattering (SERS) tags. Methods. 2012, 57 (3): 272-279.
35. Ochsenktihn M., Borek J., Phelps R. et al. Redox potential dependence of peptide structure studied using surface enhanced Raman spectroscopy. Nano Lett. 2011, 11 (7): 2684-2688.
36. Qian J., Jiang L., Cai F. et al. Fluorescence-surface enhanced Raman scattering co-functionali-zed gold nanorods as near-infrared probes for purely optical in vivo imaging. Biomaterials. 2011, 32: 1601-1610.
37. Qiang Tu, Chang Chang. Diagnostic applications of Raman spectroscopy. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2012, 8: 545-558.
38. Schmit V., Martoglio R., Carron K. Anal. Chem. 2012, 84 (9): 4233-4236.
39. Sebastian W., Tyler W, Thomas H. Chemical analysis in vivo and in vitro by Raman spectroscopy from single cells to humans. Curr. Opin. Biotechnol. 2009, 20: 63-73.
40. Smith W. Practical understanding and use of surface enhanced Raman scattering/surface enhanced resonance Raman scattering in chemical and biological analysis. Chem. Soc. Rev. 2008, 37 (5): 955-964.
41. Stockel S., Meisel S., Elschner M. et al. Identification of Bacillus anthracis via Raman Spectroscopy and Chemometric Approaches. Anal. Chem. 2012, 84 (22): 9873-9880.
42. Takamatsu T., Harada I., Hayashi K. Raman spectra of some snake venom components. Biochim. Biophys. Acta. 1980, 622 (2): 189-200.
43. Thomas G. New structural insights from Raman spectroscopy of proteins and their assemblies. Biopolymers. 2002, 67 (4-5): 214-225
44. Thomas G. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1999, 28: 1-27.
45. Tripathi A., Jabbour R Treado P. et al. Waterborne pathogen detection using Raman spectroscopy. Appl. Spectrosc. 2008, 62 (1): 1-9.
46. Webb-Robertson B., Bailey V., Fansler S. et al. Spectral signatures for the classification of microbial species using Raman spectra. Anal. Bioanal. Chem. 2012, 404 (2): 563-572.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Наумик Андрей Владимирович,
197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812)498-09-39
