CC BY
12
ВИКОРИСТАННЯ Б1ОТЕХНОЛОГ1ЧНИХ ПРИЙОМ1В ДЛЯ П1ДВИЩЕННЯ ЦУКРОНАКОПИЧЕННЯ ТА СТ1ЙКОСТ1 ЦУКРОВИХ БУРЯК1В ДО НЕСПРИЯТЛИВИХ ЧИННИК1В ДОВК1ЛЛЯ
О.В. ДУБРОВНА, доктор б1олог1чних наук; О.М. ТИЩЕНКО, доктор б1олог1чних наук; В.Д. САКАЛО, доктор б1олог1чних наук; Т.В.
ЧУГУНКОВА, доктор б1олог1чних наук;
1.1. ЛЯЛЬКО, кандидат б1олог1чних наук 1нститут фiзiологii рослин i генетики НАН Украши, Кшв
Вступ
Розвиток сучасних бiотехнологiй розкривае новi перспективи для виршення глобальних проблем людства, одна з яких пов'язана з удосконаленням нових енергетичних джерел. Цукровi буряки можуть бути перспективною культурою для одержання бiопалива, зокрема бiоетанолiв та бiобутанолiв, якi е альтернативним джерелом бензину та газу. Бюбутанол - це наступний значний етап розвитку бiопалива, до того ж саме виробництво бюбутанолу з техшчно! точки зору значно простiше, шж етанолу. Разом з тим, використання цукрових бурякiв як сировини для бюпалива потребуе стабiльно високого виходу сировини, що забезпечуеться створенням нових форм рослин, яю поеднують високу продуктивнють зi стiйкiстю до стресових чинниюв довюлля. Рiзноманiтнi бiотехнологiчнi прийоми, зокрема кштинна селекцiя, е перспективним сучасним методом отримання таких матерiалiв. Крiм того, одним з прюритетних напрямiв бiотехнологiй е регуляцiя метаболiчних процесiв, спрямованих на синтез продукпв з полiпшеними якостями, що дозволяе пщвищувати енергетичну цiннiсть рослин при використанш 1х у промисловому виробницга. У зв'язку з цим, метою роботи було створення нових форм буряюв, яю характеризуються стiйкiстю до абютичних стресових чинниюв довюлля, та оптимiзацiя у цих рослин шляхiв регуляци вуглеводного метаболiзму.
Об'екти та методи дослщжень
Калюснi культури цукрових буряюв були отримаш з листкових експлашив дипло1дних рослин сорту 1ндус^альний, попередньо введених в культуру т \Ито. Як абiотичнi стресовi чинники використовували сольовий та низькотемпературний стрес. Для створення стшких до засолення кл^инних лшш як селективнi чинники застосовували солi хлориду натрiю (№С1) та сульфату натрiю (Ка2Б04), яю в рiзних концентрацiях додавали до живильних середовищ.
Для отримання резистентних форм використовували методи прямо1 та ступшчасто! кштинно! селекци. За прямого добору у живильне середовище МС додавали солi хлориду та сульфату натрш у сублетальних концентрацiях - 2% №С1, та 2,5% №2Б04. Стiйкi клони добирали через 4 тижш. Зпдно зi стандартною схемою кштинно! селекци, калюси перевiряли в селективних i неселективних умовах. Ступшчасту селекцiю проводили за схемою: 1,5% №С1 (3 пасаж1) ^ 2,0% №С1 (3 пасаж1) ^ 2,5% №С1 (3 пасаж1) ^ основне середовище МС (3 пасаж1); а також 2,0% Ка2Б04 (3 пасаж1) ^ 2,5% Ка2Б04 (3 пасаж1) ^ 3,0% Ка2Б04 (3 пасаж) ^ основне середовище МС (3 пасаж1).
Вивчення дп позакореневого пщживлення мiнеральним мiкродобривом (акварином № 5) та регулятором росту (бетастимулшом) на бюсинтетичш процеси i продуктивнiсть цукрових буряюв проводили в умовах вегетацшних дослвдв. У дослiдах були використаш: рослини лшп 1, якi характеризуються перехресною стшюстю до хлоридного засолення та низьких температур, а також рослини лшп 2, яю мають перехресну стшюсть до сульфатного типу засолення i низьких температур. Рослини вирощували в посудинах iз темно-арим пiдзоленим грунтом (15 кг) з внесенням поживно! сумiшi ВН1С i одноразовим пiдживленням у серединi вегетацп
нгтроамофоскою (5 г на посудину). Повторшсть дослщу 15-разова. Обробку листюв проводили двiчi протягом вегетаци розчином акварину № 5 разом з бетастимулiном (70 мкл бетастимулшу в 1,5 л 1,5% акварину). Перша обробка в фазу 6-8 листюв (23.06), друга - через мюяць (14.07), у перюд штенсивного цукронакопичення.
В онтогенезi рослин визначали активнiсть ферменту синтезу сахарози - СФС; вмют сахарози в листках, судинно-провщних пучках черешкiв, коренеплодах. Аналiзували рiст гички 1 коренеплсццв, розраховували врожайшсть 1 продуктивнють. Активнють СФС визначали за модис]мкованим нами методом Губера сшвавт. [4]. Видшення СС (сахарозосинтази) з коренеплод1в цукрових буряюв 1 визначення п активносп проводили за методикою, описаною в [4]. Анашз сахарози проводили резорциновим методом [5]. Цукристють коренеплод1в визначали поляриметричним методом [3]. Урожайшсть розраховували виходячи з того, що на 1 гектарi 76 000 рослин.
Результати та обговорення
Методами прямо! та стугпнчастоТ селекцп отримано калюсш лшп цукрових буряюв, стшю до 2,0% хлоридного 1 2,5% сульфатного засолення [1]. Була проведена сер1я експеримешив з визначення перехресно'1 стiйкостi цих форм i до температурного стресу. Експерименти проводили в два етапи - початкове загартування з наступною обробкою негативними температурами. Загартування дослщного матерiалу здiйснювали у 2-х режимах: 7 дiб при +2°С i 14 дiб з послщовною з тижневим iнтервалом змшою температур - +6°С i +2°С. Наступна обробка загартованих калюсiв температурою -2°С протягом 1, 8 i 16 годин не призвела до загибелi клiтинних лiнiй у жодному з випробуваних варiантiв. Солестiйкi кл^инш лшп були повторно обробленi температурою -5°С протягом 21 години. Через 7 тижшв виявлено близько 40% живих калюсiв. Пiсля перенесення на свiже живильне середовище калюси з перехресною стiйкiстю добре росли протягом кшькох пасаж1в при низьких позитивних температурах (+4 °С).
Частота регенерацп у отриманих лшш, стiйких до комплексу абютичних стресiв, виявилась низькою - п рiвень не перевищував 10%. З калюсних культур цукрових бурякiв з перехресною стшкютю було регенеровано кшька десяткiв рослин.
Враховуючи специфiчнiсть отриманого нами матерiалу, для збiльшення кшькосп рослин було проведено клональне мшророзмноження отриманих форм удосконаленим нами методом прямоi регенерацii пагонiв iз тканин вегетативних органiв, який дозволяе репродукувати у чистот! генетично-цiнний матерiал та збшьшуе вихiд регенерантiв на один експлант [2].
Перевiрка ознаки стшкосп отриманих регенерантiв показала, що серед рослин, шдукованих iз клiтинних лшш з хлоридним типом засолення, тсля десяти пасаж1в було виявлено 40-45% стшких (рис. 1), тодi як iз клiтинних лiнiй з сульфатним типом засолення - у межах 50-54%. Одержат результати можуть свщчити про те, що кл^инш лши та регенеранти, яю зберiгали нормальний рют за дii комплексу стресових чинниюв, мають генетично обумовлену ознаку стшкосп. Це пiдтвердив i аналiз збереження ознаки у насiнневих поколшнях.
Нами вивчено спiльний вплив препара^в «Бетастимулiн» та «Акварин» на бюсинтетичш процеси (активнiсть ключових ферментiв вуглеводного обмшу -сахарозофосфатсинтази в листках i сахарозосинтази в коренеплодах) на продуктившсть нових форм цукрових буряюв. Враховуючи можливiсть регуляцii цукронакопичення через вплив бюлопчно активних речовин на ферментш системи, якi вiдповiдають за синтез та метаболiзм сахарози, доцшьним е поеднання двох бiотехнологiчних пiдходiв, що, iмовiрно, буде сприяти одночасному полiпшенню селекцiйних та технологiчних якостей цукрових буряюв.
IU
Рис. 1. Регенерант цукрових бурякчв з перехресною стшкктю до хлоридного засолення та низьких позитивних температур
Обробка рослин акварином та бетастимулшом стимулювала актившсть СФС починаючи з перiоду початку цукронакопичення. У рослин лшш актившсть СФС практично не вiдрiзнялася вщ рослин вихiдного сорту. Так, у рослин лшп 1 у другу половину вегетацп питома активнiсть СФС збшьшувалася на 96%, загальна - на 70%, а в iншi перюди онтогенезу вiдмiчена тенденцiя до активацп ферменту. У рослин лшп 2 практично протягом уае' вегетацп вiдмiчено значне збiльшення як питомо'', так i загально'' активностi ферменту (71-172%).
У середиш вегетацп' вмют сахарози в листках i судинно-провщних пучках у генотипiв, оброблених ФАР, шдвищувався. Це корелюе зi значною активацieю СФС у цей перюд. Разом з тим активнiсть ферменту до кшця вегетацп' поступово знижувалася, i тому високий рiвень сахарози в тканинах може свщчити про деяке уповшьнення вiдтоку в цей перюд. Обробка ФАР змшюе розподш сахарози, активуючи транспорт ii в коренеплщ, в основному в середиш вегетацп.
Обробка листав фiзiологiчно активними речовинами також впливала на вмют легкорозчинних бiлкiв. У рослин лшп 2 вiдмiчено стабiльне пiдвищення рiвня легкорозчинних бiлкiв протягом усього онтогенезу, а у рослин лшп 1 - незначне збшьшення в кшш вегетацп при майже дворазовому зменшенш рiвня бiлкiв у контролi.
Спшьне використання мiнерального добрива i бетастимулшу позитивно впливало на ростовi процеси та накопичення сухо'' речовини в листках. Маса гички у рослин лшш 1 та 2 була достовiрно вища в кшш вегетацп. Взагалi можна сказати, що обробка лшш акварином i бетастимулшом позитивно впливала на формування бюмаси цукрових буряюв. Збшьшення маси гички, разом з активашею СФС, пвдвищенням рiвня сахарози в листках i в русл транспорту, примножують ефект вщ застосування акварину i бетастимулiну на нових формах буряюв. Виходячи з того, що для виробництва бюпалива може використовуватись рослинницька продукшя техшчного характеру, вiдходи виробництва, надлишки сировини, iмовiрно, збагачена сахарозою гичка цукрових буряюв теж могла б використовуватись у цьому виробництва
Таким чином, позакореневi обробки цукрових бурякiв мшеральним мiкродобривом (акварином № 5) у комплекс з бетастимулiном у перюд утворення 6-8 листав i штенсивного цукронакопичення пiдтримувала до кiнця онтогенезу функцюнальну активнiсть листкiв рослин лшш, яю вiдрiзняються високою стiйкiстю до стресових факторiв довкiлля. Бiохiмiчно це виявлялося в активацп ферменту синтезу сахарози в листках (СФС), тдтриманш високого рiвня хлорофшу, бiлкiв, стимуляцп вiдтоку сахарози, збiльшеннi маси гички.
Обробка ФАР призводить до збшьшення вщношення реакцш синтез/розщеплення.
Щодо рослин лшп 1 можна сказати, що розщеплення сахарози в коренеплодах на початку вегетацп було практично на рiвнi контролю, а в кшщ дещо шпбувалося, але вщношення реакцiй синтез/розщеплення було вище в контролi. За цим показником можна сказати, що обробка ФАР бшьш сприяе процесу розщеплення сахарози, хоча рiзниця у вщношенш цих реакцiй незначна. В коренеплодах рослин лшп 2 активащя СС в реакцп розщеплення сахарози при обробщ посiвiв ФАР вiдмiчена тiльки в кiнцi вегетацп (26-23%), у той же час як синтез сахарози залишався практично на рiвнi контролю. На початку вегетацп вщношення реакцш синтез/розщеплення сахарози було на користь розщеплення, а в кшщ - синтезу, що е дуже позитивним для забезпечення як ростових процеав, так i цукронакопичення
У рослин лшп 1 метаболiзм сахарози при обробщ акварином спшьно з бетастимулшом був спрямований на збшьшення цукронакопичення, що призвело до пщвищення цукристосп коренеплодiв на 0,4% i збшьшило збiр цукру на 4,6%, проте розрахункова врожайшсть залишалась на рiвнi контролю. Найкращi результати були отримаш у рослин лшп 2, де на фош пщвищення урожайносп цукристiсть пiдвищувалась на 0,8%, що дало розрахункове збшьшення збору цукру на 16%. Обробка посiвiв акварином спшьно з бетастимулшом позитивно впливала i на доброяюсшсть цукросировини. Так, вмют «нецу^в» у складi сухо'' речовини знижувався у рослин лшш, а стввщношення сахароза / «нецукри» було вище в уах дослiджених генотипiв, що свiдчить про фiзiологiчну зрiлiсть коренеплодiв.
Обробка посiвiв цукрових бурякiв акварином i бетастимулшом збшьшувала функцiональну активнiсть листкiв: активащю СФС у листках, пiдсилення ростових процеав i вiдтоку сахарози в коренеплоди. Регулящя СС у коренеплодах стимулювала або 1'х рiст, або цукронакопичення. Як результат - вихщ цукру збшьшувався не тiльки за рахунок пщвищення врожайносп, але й внаслщок пiдвищення цукристостi. Одержанi даш свiдчать про те, що, змшюючи дози добрив i спiввiдношення в них елемешив живлення, використовуючи 1'х з регуляторами росту, можна впливати на спрямованiсть метаболiчних процесiв, яю визначають як iнтенсивнiсть росту коренеплодiв, так i 1'х цукристiсть.
Висновки
Вперше за допомогою методiв кл^инно!' селекцп отримано новi форми цукрових буряюв, у яких поеднуються стшюсть до кiлькох стресових чинникiв. Експериментально обгрунтована можливiсть регуляцп цукронакопичення через вплив бюлопчно активних речовин на ферментш системи, якi вiдповiдають за синтез та метаболiзм сахарози, що пов'язано з пiдвищенням продуктивностi цукрових буряюв. Поеднання двох бiотехнологiчних пiдходiв сприяе одночасному полiпшенню селекцiйних та технолопчних якостей бурякiв.
Список лггератури
1. Дубровна О.В., Лялько 1,1., Хомочкша М.П. Добiр закрiплювачiв стерильносп О-типу цукрових буряк1в з пщвищеною стiйкiстю до хлоридного засолення в культурi in vitro // Фактори експериментально'' еволюци органiзмiв: Збiрник наукових праць. - К.: Логос, 2006.
- Т. 3. - С. 556-560.
2. Дубровна О.В., Лялько I.I. Мжроклональне вщтворення селекцшно-цшних форм цукрових та кормових буряюв // Фактори експериментально'' еволюцiï органiзмiв: Збiрник наукових праць. - К.: Аграрна наука, 2003. - С. 410-414.
3. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений. - К.: Наукова думка, 1976.
- С. 154-157.
4. Сакало В.Д. Активация сахарозосинтазы в "стареющих" тканях корнеплодов сахарной свеклы // Физиология и биохимия культ. растений. - 1993. - Т. 25, № 1. - С. 66-72.
5. Huber S.C., Huber J.L. Role and regulation of sucrose phosphate synthase in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1996. -V. 47. - P. 431-444.
6. Roe J.H. A Colorimetric method for the determination of fructose in blood and urine // J. Biol. Chem. - 1954. - V. 107. - P. 15-22.
ЭФФЕКТИВНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (BETA VULGARIS L.) ДЛЯ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ СИНТЕТИЧЕСКИМ ГЕНОМ
CRY1AC
В.В. ИВАНИЦКАЯ; Д.И. ЛИТВИН, кандидат биологических наук;
А.И. ЕМЕЦ, кандидат биологических наук;
Я.Б. БЛЮМ, доктор биологических наук Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев
Введение
Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) является одной из наиболее важных технических культур, поскольку около 40% сахара в мире изготавливается из сахарной свеклы [11]. В прошлом году площадь посевов данной культуры на Украине составляла примерно 400 тыс. га с урожайностью около 300 ц/га. Данная культура используется не только для производства сахара, но и для получения патоки, а зеленую массу используют в качестве корма для домашних животных. Поэтому развитие селекционно-генетических работ, направленных на улучшение потенциала выращивания сахарной свеклы и производство сахара, имеет большое экономическое значение для нашей страны. Однако ввиду вариабельности генотипа, низкого регенерационного и трансформационного потенциала сахарной свеклы существуют серьезные ограничения для применения основных биотехнологических манипуляций in vitro с исходным экспериментальным материалом этой культуры, призванных обеспечить ускорение и технологическое обновление арсенала селекционных возможностей, направленных на повышение показателей урожайности и устойчивости данной культуры к различного рода патогенам и вредителям.
Результаты ряда работ указывают на то, что регенерация сахарной свеклы в условиях in vitro является достаточно сложным процессом. И хотя были получены регенеранты из листьев, черешков [1-3], гипокотилей [5], семядолей [2], базальной части побега [4, 7] и узлов семядольных листьев [6], воспроизводимость данных методик для различных генотипов сахарной свеклы является проблематичной. Также отсутствует хорошо разработанная универсальная методика агробактериальной трансформации для этой культуры [4, 6, 7, 9].
Поэтому целью данного исследования был подбор оптимальных условий для регенерации растений сахарной свеклы из листовых дисков и оптимизация протокола агробактериальной трансформации данного типа эксплантов для переноса синтетического гена crylAc, обеспечивающего устойчивость к ряду насекомых-вредителей отряда Lepidoptera (Чешуекрылые).
Объекты и методы исследования
Растительный материал. В работе использовали исходную отцовскую селекционную линию свеклы ММ1/2, любезно предоставленную Институтом сахарной свеклы УААН. Стерильные побеги выращивали на среде Мурасиге и Скуга (МС) [8], содержащей либо 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1 мг/л, либо комбинацию регуляторов роста 0,25 мг/л БАП и 0,1 мг/л Р-индолил-3-масляную кислоту (ИМК). Для индукции корнеобразования культивируемые микропобеги пересаживали на безгормональную среду МС.
