CC BY
48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
UTILITY BIOLOGICAL POTENTIAL OF TRANSGENIC ANIMALS MAMMARY GLAND FOR PRODUCTION OF RECOMBINANT ENDOSTATIN
E.S. Zakharova, M. V. Pryzhkova, E.S. Zavadskaja, S.G. Kadulin, A. V. Kibardin, L.S. Popov, S.L. Kiselev, N. V. Gnuchev Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
ABSTRACT
Using expression construction on the basis of the bovine SI-casein promoter elements and endostatin-coding fragment of mouse collagen XVIII cDNA a number of transgenic mice* populations were generated. Construction stably transmitted to the progeny and provided up to 0,6 g/L endostatin in the milk during lactation.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ СИНТЕЗА РЕКОМБИНАНТНОГО ЭНДОСТАТИНА
Е.С. Захарова, М.В. Прыжкова, Е.С. Завадская, С. Г. Кадулин, А.В. Кибардин, Л.С. Попов, C.JI. Киселев, Н.В, Гнучев Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; факс; (095) 1354105; e-mail: dna@biogen.msk.su
РЕЗЮМЕ
Получено несколько популяций трансгенных мышей с помощью генетической конструкции, созданной на основе гена a S1 -казеина крупного рогатого скота. Данная генетическая конструкция содержит фрагмент кДНК коллагена ХУШ мыши, кодирующий полипептид эндостатин. Уровень секреции эндостатина в молоко достигал 0,6 г/л.
Введение. Среди онкологических заболеваний заметную часть составляют солидные метастазирующие опухоли. Традиционные методы лечения в первую очередь предлагают оперативное вмешательство. Однако, из практики известно, что в ряде случаев удаление первичной опухоли приводит к быстрому росту отдаленных метастазов. Этот факт натолкнул исследователей на мысль, что первичная опухоль своим присутствием в организме до определенного этапа развития ингибирует рост отдаленных метастазов. Это явление тесно связано с ангиогенезом. Ангиогенез - процесс развития новых кровеносных сосудов. В процессе своего развития опухоль прорастает сетью кровеносных сосудов, необходимых ей для питания. Ангиогенез практически не происходит в здоровом взрослом организме, однако, является одним из ключевых для развития опухоли и метастазов [9].
Ангиогенез - процесс многофакторный. Первичная опухоль способна вырабатывать как стимуляторы, так
и ингибиторы ангиогенеза, а ангиогенный фенотип является следствием конкретного соотношения этих факторов. Соотношение положительных и отрицательных факторов ангиогенеза в разных точках организма может быть разным и определяется удаленностью точки от первичной опухоли, скоростью синтеза и временем жизни этих факторов. Наблюдения показывают, что первичная опухоль способна стимулировать ангиогенез в своих собственных сосудах и ингибировать ангиогенез внутри метастазов и вторичных опухолей. Если предположить, что время жизни ингибиторов в циркуляции больше, чем время жизни стимуляторов, то кровеносных сосудов удаленных метастазов достигают только ингибиторы, и ангиогенез в них не происходит. Эта гипотеза была подтверждена экспериментально на животных моделях и такие ингибиторы ангиогенеза были выделены и охарактеризованы [16].
Одним из первых охарактеризованных факторов, блокирующих ангиогенез, стал 38 кДа белок - ингиби-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИО ТЕРАПИЯ
25
тор эндотелиальной пролиферации, названный ангио-статином. Он был выделен из сыворотки и мочи мышей - носителей опухоли LLC (Карциномы Легких Люис) с использованием нескольких стадий хроматографии. Микросеквенирование аминокислотной последовательности этого полипептида показало, что он гомологичен фрагменту плазминогена [15]. Аналогичным образом был получен и идентифицирован ингибитор эндотелиальной пролиферации выделяемый геман-геоэндотелиомой (ЕОМА). Им оказался 20 кДа полипептид идентичный С-концевому фрагменту коллагена XVIII [14].
Обнаруженные полипептиды были выделены и использованы в экспериментах на животных моделях. Оказалось, что периодические инъекции ангиостати-на могут ингибировать рост, по крайней мере, еще трех (кроме LLC) разновидностей опухолей мыши, даже если терапию начинали, когда опухоль достигла 2% от веса животного [15]. Для дальнейших исследований были получены рекомбинантные ангиоста-тин и эндостатин в системах экспрессии E.coli и баку-ловируса [15, 14].
Для получения достоверных результатов по терапии разных опухолей даже на мышах требуется довольно большое количество белка, и получение его из естественного источника крайне затруднительно и не эффективно. Рекомбинантный эндостатин, полученный в E.coli, выпадал в осадок в нерастворимом виде [14]. Рекомбинантный эндостатин, полученный с использованием бакуловируса, специфически ингибировал пролиферацию эндотелиальных клеток и по характеру ин-гибирования полностью соответствал природному продукту. Ингибирование происходило достаточно специфически, не наблюдалось ингибирования клеток не эн-дотелиального происхождения, в том числе ЕОМА-клеток [14].
В опытах на животных моделях было показано, что рекомбинанный эндостатин при введении 3 мкг на мышь в сутки ингибирует рост метастазов. При дозе 25 мкг на мышь в сутки рост опухоли ингибируется на 53%, доза 100 мкг на мышь в сутки ингибирует рост опухоли на 97 %, при дозе 200 мкг на мышь в сутки в отдельных экспериментах удавалось добиться почти полной регрессии первичной опухоли [14]. В отдельной серии экспериментов мышам имплантировали В16Р10-меланому, Е241-фибросаркому, ЕОМА ге-мангилиому и проводили терапию рекомбинантным эндостатином. Все привитые опухоли быстро регрессировали, и не было зафиксировано признаков токсичности ни в одной из обработанных эндостатином мышей [14].
Следовательно, использование ингибиторов анги-огенеза предоставляет уникальную возможность специфического воздействия на опухоль без оперативного вмешательства. В настоящее время опубликованы результаты первой стадии клинических испытаний препаратов рекомбинантного эндостатина [8,11,12].
Таким образом, эндостатин - ингибитор пролиферации эндотелиальных клеток и ангиогенеза, представляется очень перспективным для лечения целого ряда онкологических заболеваний. Существует несколько различных систем для получения рекомбинантного эндостатина. Каждая из этих систем имеет свои преиму-
щества и недостатки.
В настоящее время одной из перспективных систем продукции биологически активных белков считается молочная железа трансгенных животных [5, 6, 10]. Молочная железа физиологически обладает огромным потенциалом синтеза белка, что является хорошей предпосылкой ее успешного использования для производства рекомбинантных продуктов. Трансгенные мыши являются традиционной модельной системой для предварительного исследования созданной генетической конструкции и проверки функциональности белкового продукта перед получением высокопродуктивных крупных трансгенных животных.
Используя полученную в нашей лаборатории генетическую конструкцию, мы получили восемь популяций трансгенных мышей, секретирующих рекомбинантный эндостатин в молоко.
Материалы и методы.
1. Ферменты и реактивы. В работе использовались ферменты, производимые фирмами Fermentas (Lithuania), Promega (USA), Gibco (USA) и реактивы производства фирм Sigma (USA), Qiagen (Germany) и Merck (Germany). Для радиоавтографии применялась пленка BioMax MS Kodak (UK) с соответствующими усиливающими экранами. Радиоавтография при определении первичной последовательности ДНК проводилась с использованием односторонней пленки BioMax MR Kodak. Стандартные праймера (Т7, ТЗ и Sp6 праймеры) были получены от Promega (USA). Остальные олигонуклеотиды были заказаны в фирме Син-тол (Москва).
2. Выделение ДНК и РНК. Выделение геномной ДНК из образцов тканей мышей и тотальной РНК из тканей и органов мыши проводили как описано [17].
3. Агарозный гель-электофорез ДНК и РНК. Гель-электрофорез ДНК проводился в 0.8-2.0% агарозном ТАЕ-геле с бромистым этидием как описано [17]. ДНК детектировалась в ультрафиолете (302 нм). Для экстракции фрагментов ДНК из геля использовался QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Гель-электрофорез РНК проводился с использованием Na-фосфатного буфера (рН=7,0) в 1,0% агарозном геле с формамидом в денатурирующих условиях как описано [17].
4. Приготовление раствора ДНК для микроинъекций. Генетическую конструкцию, представляющую собой фрагмент ДНК размером 7,5 т.п.н. отщепляли от плазмиды при помощи рестрикционной эндонуклеазы и разделяли в 0,7% агарозном геле. Для элюции фрагмента ДНК из агарозы использовали колонки фирмы Qiagen согласно прилагаемой методике. Для микроинъекций использовали раствор ДНК в концентрации 400 копий/пкл в буфере (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,25 тМ EDTA).
5. Получение трансгенных мышей. Трансгенных мышей получали стандартным методом микроинъекции рекомбинантной ДНК в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. В качестве доноров яйцеклеток использовали неполовозрелых самок (CBAxC57BL) F1, у которых проводили гормональную стимуляцию суперовуляции. После микроинъекции ооциты культивировали 1-2 часа in vitro (37С°, 5% С02) и трансплантировали псевдобеременным самкам
26
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
(CBAxC57BL) Fl, которых предварительно спаривали с вазэктомированными самцами [13].
Полученных первичных трансгенных мышей скрещивали с нетрансгенными (CBAxC57BL) Fl, для получения популяций трансгенных животных.
6. Анализ потомства на интеграцию конструкции. Идентификацию трансгенных мышей осуществляли с помощью Саузерн-блот анализа ДНК родившихся особей [17]. ДНК выделяли из хвостов. Для идентификации трансгенных животных, 100-200 нг ДНК расщепляли рестриктазой Xbal, разделяли в 1% агароз-ном геле, содержащем этидий бромид и переносили на мембрану Hybond-N (Amersham) в соответствии с рекомендациями производителя мембран. Фиксация ДНК на мембране проводилась облучением ее ультрафиолетом (302 нм) в течении 10 мин. Зонд для гибридизации (2000 п.н. фрагмент ДНК из З'-области ос S1 -казенного гена крупного рогатого скота) метили с использованием a P32-dATP с помощью Prime-a-Gene Labeling System (Promega) и очищали от невключившихся нук-леотидов на PCR QIAquick Spin Column (Qiagen). Гибридизация мембран проводилась в буфере, содержащем 0.5 М Na-фосфат, pH 7.2; 7% SDS; 1 мМ ЭДТА, pH 8.0; 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (Sigma) и меченный зонд (1 -6х 106 срт), при 65С°. После гибридизации мембраны отмывали в 0.1% SDS/ 2XSSC (О.ЗМ NaCl, ЗОмМ Ыа-цитрат) при 65С°. Отмытые мембраны радиоавтографировались.
7. Анализ РНК. Фракционированную в агарозном геле РНК переносили на мембрану Hybond-N (Amersham) методом стандартного Ноузерн-блот переноса [17] с последующей гибридизацией с меченым фрагментом кДНК эндостатина мыши или с 2000 п.н. фрагментом ДНК из З'-области a S1-казенного гена крупного рогатого скота, как описано выше.
8. Анализ молока трансгенных животных. Молоко получали от лактирующих трансгенных самок на разных стадиях лактации (2, 5, 10, 15 и 20 дней). Для этого самку на 2,5-3 часа отсаживали от мышат, затем вводили 2/3 дозы наркоза и 0,5 ед. окситоцина [1]. После этого капилляром вручную сдаивали молоко и до исследования хранили его при -20°С.
Анализ проводили с помощью иммуноблотинга (Вестерн-блот анализ). Белки молока разделяли в 15% SDS-полиакриламидном геле с использованием трис-глицинового буфера как описано [17]. В качестве стандартов молекулярных весов использовали Prestained Protein Molecular Weight Standards (Gibco). После окончания гель-электрофореза белки переносили на нитро-целлюлозную мембрану Immobilon-P (Millipore) с помощью Т70 Semi-Dry Transfer Unit (Hoefer Scientific) в соответствии с рекомендациями производителя оборудования. Для детекции эндостатина использовали антитела к 6xHis Tetra-His Antibody (Qiagen). Анализ иммобилизованных на мембране белков проводился с применением ECL Detection Reagents (Amersham) в соответствии с протоколом производителя.
Результаты и обсуждение. Молочная железа предназначена для синтеза большого количества белка. Опубликованно много исследований по созданию генетических конструкций для получения трансгенных животных, секретирующих в молоко гетерологичные белки [5,6,10]. Во всех ранее описанных исследовани-
ях в молоко секретировался продукт целого гена или полноразмерной кДНК. В нашем случае необходимо получить С-концевой фрагмент естественного полимера, и следовательно, в конструкции использовался фрагмент кДНК коллагена XVIII. Схема конструкции pVI-end описана ранее [2].
После проведенных микроинъекций было получено девять первичных трансгенных мышей. Идентификация трансгенных мышей осуществляли с помощью Саузерн-блот анализа (Рис 1).
1 2 3 4 5 6 7
• • * * -
1,2,3,5- пробы ДНК трансгенных мышей; 4 - проба ДНК нетрансгенной мыши;
6 - положительный контроль (ДНК плазмиды рУЬепё);
7 - отрицательный контроль (ДНК нетрансгенной мыши)
Рис.1. Саузерн-блот-анализ ДНК потомства первичных трансгенных мышей по генетической конструкции рУЬепё
Этот метод позволяет примерно оценить количество встроившихся копий рекомбинантной конструкции. У полученных нами трансгенных животных этот показатель составил 5 -15 копий на геном. При последующих скрещиваниях, одна из первичных мышей не передавала трансгенный локус потомству и в дальнейших исследованиях не использовалась. От восьми оставшихся трансгенных мышей были получены восемь популяций трансгенных животных.
Самки мышей, начиная с первичных трансгенных животных и до третьего поколения, были протестированы на экспрессию введенной генетической конструкции. Для этого во время лактации у них брали молоко и определяли уровень секретируемого в него эндостатина. Рекомбинантный белок был детектирован в молоке трех поколений трансгенных животных (далее не проверяли). Уровень экспрессии колебался среди разных особей в пределах от 0,03 до 0,6 г /л.
Было замечено, что уровень экспрессии в одной из популяций трансгенных мышей зависит от стадии лактации. Максимальная экспрессия наблюдалась в первые дни лактации, а затем количество эндостатина в молоке быстро снижалось ниже уровня детекции (Рис. 2а). В остальных популяциях трансгенных мышей подобная закономерность не прослеживалась, и уровень экспрессии оставался примерно одинаковым на протяжении всего наблюдаемого периода лактации (Рис. 26). Можно предположить, что изменение уровня экспрессии гена на разных стадиях лактации определяется генетическим окружением места интеграции конструкции в геноме. Из литературных источников известно, что активность гена CAT, находящегося под контролем регуляторных областей a S1-казеина, увеличивается до 12 дня лактации, а затем наблюдается падение его активности [7].
Уровень продукции рекомбинантного эндостатина в молоко полученных трансгенных животных дос-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИО ТЕРАПИЯ 27
а) б) 1234567 12345 ^^2J^a 20кДа а) популяция №2, F2: 1,2- положительный контроль: 100 нг и 500 нг рекомбинантного эндостатина, полученного в E.coli (при разделении в полиакриламидном геле, эндостатин, подученный в данной системе экспрессии, виден в виде двух полос; нижняя полоса является результатом неполного синтеза; указанное количество эндостатина содержится суммарно в двух полосах); 3 - отрицательный контроль (молоко нетрансгенной мыши); 4, 5, 6, 7 - пробы молока трансгенной самки, полученные на 2-й, 5-й, 10-й и 15-й дни лактации соответственно; б) популяция №21, F3: 1 - положительный контроль (500нг рекомбинантного эндостатина), 2 - отрицательный контроль; 3, 4, 5 - пробы молока трансгенной мыши на 2-й, 5-й и 10-й дни лактации соответственно. Рис.2. Вестерн-блот-анализ молока трансгенных самок мышей на разных стадиях лактации
тигал 0,6 г/л. Это больше, чем уровень продукции aS 1 - Положительный сигнал, соответствующий разме-казеинового мини-гена (гена без интронов) под соб- ру рекомбинантной РНК (на Рис. 3, отмечено стрелка-ственным промотором (0,01 г/л) [7], но меньше, чем ми), как и предполагалось, наблюдается на дорожках, таковой при использовании конструкции с полнораз- соответствующих молочной железе. Верхний сигнал на мерной геномной копией проколлагена типа I под кон- дорожке 3 соответствует эндогенному казеину. Всего тролем a SI-казеинового промотора (8 г/л) [19]. На было проанализировано 12 особей из разных популя-настоящий момент существует набор средств для по- ций на разных стадиях беременности и лактации. Не-вышения уровня синтеза гетерологичного продукта, большой неспецифический уровень транскрипции был Возможно, нужно обратиться к попыткам синтезиро- замечен у двух самок. У одной из самок (№386, попу-вать полноразмерный коллаген XVIII с последующим ляция 91) положительный сигнал детектирован в под-протеолитическим отщеплением эндостатина. Все это желудочной железе (примерно 1% от уровня транскрип-требует дальнейших разработок. Нам представляет- ции в молочной железе), вторая самка (№33, популя-ся важным подчеркнуть, что синтез значимых коли- ция 18) - положительный сигнал в мышечной ткани и в честв эндостатина в молоке трансгенных животных мозге (менее 1% от уровня транскрипции в молочной возможен, несмотря на то, что эндостатин не является железе). Анализ РНК из органов других самок этой же непосредственным продуктом гена, а лишь протеоли- популяции и самок других популяций не обнаружил тическим фрагментом естественного полимера (кол- искомого транскрипта в аналогичных органах и тка-лагена XVIII) [18]. Второе важное наблюдение заключается в следую- 1 2 3 4 5 67 8 9 10 11 12 ^ щем. Наш рекомбинантный продукт предположитель- 4 * ¿ ^_ но ингибирует ангиогенез. Мы еще не имеем полной I Щ \ информации о том, где и на какой стадии развития орга- Щ * ~М низма работает а Sl-казеиновый промотор в естествен- щ Ш 18S ных условиях, не говоря уже об искуственно созданной .Ж """ генетической кассете в чужеродном организме. Не ис- """^flr ™ Я ключена неспецифическая экспрессия нашей генетичес- W Щ кой конструкции в разных органах и на разных стадиях развития организма. А ведь именно в развивающем- \.д _ пробы РНК из органов самки №391 (популяция 91), ся организме так необходим процесс ангиогенеза. По- 15-й день лактации: 1-сердце, 2-печень, 3-молочная же-этому полученые трансгенные мыши своим существо- леза, 4-легкое, 5-яичники, 6-брюшина, 7-почка, 8-селе-ванием позволяют надеяться, что наша конструкция зенка, 9-мышцы; работает достаточно специфично. Для проверки спе- Ю - пропуск; цифичности работы кассеты мы провели исследование П, 12 - пробы РНК из органов беременной самки мыши РНК на присутствие интересующего нас транскрипта. №1° (популяция 18), 15-й день беременности: 11-пла- Для анализа РНК забирали органы от беременных цента, 12-молочная железа и лактирующих трансгенных самок и выделяли из них РНК. РНК подвергали Ноузерн-блот анализу. Резуль- Рис.3. Нозерн-блот-анализ РНК из органов и тканей транс-таты приведены на Рис. 3. генных лактирующей и беременной самок мышей
№4/том1/2002 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
28
нях. Это позволяет нам предположить, что неспецифическая транскрипция с нашей генетической конструкции в двух описанных случаях является следствием генетических перестроек в геноме отмеченных самок (№386 и №33), а не следствием конструктивных особенностей нашей кассеты.
Известно, что тканеспецифичность экспрессии чужеродного гена в трансгенных животных зависит от длины используемого промоторного участка: более протяженные промогорные участка более специфичны. Для Б1 -казеина показано, что для специфической экспрессии в молочной железе достаточно протяженности промоторного участка ДНК в 1500 п.н. [4]. Мы в своей конструкции использовали промоторный участок а Б1-казеина в 2000 п.н.
При использовании 1500 п.н. промоторного участка в генетических конструкциях для получения трансгенных кроликов молочная железа была единственным местом синтеза рекомбинанного продукта [4]. Использование промоторного участка а Б1 -казеина длиной 11 т.п.н., как и ожидалось, позволило получить трансгенных кроликов со специфической экспрессией рекомби-нантного продукта только в молочной железе. Исследование РНК не обнаружило положительных сигналов в других проанализированных органах [3]. При получении трансгенных мышей с использованием репортер-ного гена САТ под а Б1 -казеиновым промотором длиной 1350 п.н. уровень экспрессии в различных органах трансгенных животных оценивался по активности гена САТ, что позволило авторам вести количественную оценку специфичности их генетической конструкции. Приведенные ими результаты показывают, что активность репортерного гена во всех проверенных органах кроме молочной железы находится на уровне фона [7].
Использование рекомбинантного продукта в экспериментах по ингибированию роста злокачественных образований требует тщательной очистки получаемого белка. Объем имевшихся в нашем распоряжении проб молока не позволил нам провести очистку продукта и оценить эффективность этого процесса, даже используя имеющийся на С-конце полученного эндос-татина эпитоп бхНю. Нами было установлено, что при проведении фракционирования молока (молоко разделяли центрифугированием: 15 минут, 15 000 об./мин.) на три фракции: казенны, сыворотку и жиры; эндоста-тин детектировался во фракции казеинов.
Для детального изучения биологической активности полученного в молоке эндостатина необходимо получение более крупных трансгенных животных. Одним из промежуточных вариантов является получение трансгенного кролика, который может обеспечить достаточное количество белка как для проведения функциональных тестов, так и для проведения мелкомасштабных испытаний.
Таким образом, нами показано, что сконструированная нами генетическая кассета рЛТ-епё обеспечивает достаточно высокий уровень экспрессии эндостатина. Введенный ген экспрессируется у трансгенных самок в молочной железе в соответствии с используемым промотором, и рекомбинантный белок эндоста-тин секретируется в молоко лактирующих самок. Полученная конструкция способна эффективно интегрироваться в геном и стабильно передаваться по наслед-
ству вплоть до третьего поколения.
Работа поддерживалась грантами РФФИ и Московским Правительством,
ЛИТЕРАТУРА
1. Биология развития млекопитающих. Методы. Под ред. Манк М. М.: Мир, 1990, с.-398.
2. ЗавадскаяЕ.С., ЗахароваЕ. С., Кадулин С.Г. и др. //Генети-
ка, 2001,37, С. 1207-1212.
3. Зиновьева Н.А., Безенфельдер У., Мюллер М., и др. Исследо-
вание экспрессии IGF-1 человека у трансгенных кроликов.// Биотехнология, 1998, № 1, С. 3-11.
4. Зиновьева Н.А., Безенфельдер У., Мюллер М., и др. Трансгенные кролики как продуценты химозина крупного рогатого скота с молоком // Биотехнология, 1998, № 4, С. 17-31.
5. Brem G., Beaenfelder U., Hartl P. Production of foreign proteins in the mammary glands of transgenic mammals // Chimica Oggi., 1993, 11, P. 21-25.
6. Brem G., Hartl P., Beaenfelder U., WolfE. et.al. Expression of synthetic cDNA sequences encoding human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in the mammary gland of transgenic rabbits II Gene, 1994,149, P. 351-355.
7. ClarkeR.A., SokolD., RigbyN. etal. Mamary gland-specific expression of bovine SI-casein-derived transgenes in mice./ /Transgenics, 1994,1, P. 313-319.
8. Eder J.P., Supko J. G„ Clark J. W. et al. Phase 1 clinical trial of recombinant human endostatin administered as a short intravenous infusion repeated daily. // J.Clin.Oncol, 2002, 20, P. 3772-3784.
9. Folkman J". Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and
other disease // Nature medicine, 1995,1, P. 27-31.
10. Hennighausen L. The mammary gland as a bioreactor: production of foreign proteins in milk // Protein expression and purification, 1990,1, P. 3-8.
11. Herbst R.S., Hess K.R., Tran H.T. et al. Phas lstady of recombinant human endostatin in patients with advanced solid tumors.// Clin.Oncol., 2002,20, P. 3792-3703.
12. Herbst R.S., MullaniN.A., DavisD. W. etal.Development of biologic markers of respons and assassment of antiangiogenic activity in clinical trial of human recombinant endostatin.//Clin.Oncol, 2002,20, P. 3804-3814.
13. Hogan В., Constantini F. and Lacy E. //Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1986.
14. O'Reilly M.S., Boehm Т., Shing Y. et.al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth // Cell., 1997,88, P. 277-285.
15. O'Reilly M.S., Holmgren L„ Shing Y.et.al. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis Lung Carcinoma // Cell, 1994,79, P. 315-328.
16. O'Reilly M.S., RosenthalR., SageE.H. et.al. The suppression of tumor metastasses by a primary tumor II Surg. Forum, 1993,44, P. 474-476.
17. SambrookJ., FritschE.F., andManiatis T. Molecular cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Ann Arbor, MI, 1989.
18. Sasaki Т., Hohenester E„ Timpl R. Structure and function of collagen-derived endostatin inhibitors of angiogenesis.// IUBMB Life, 2002,53, P. 77-82.
19. Toman P.D., ChisholmG., McMullinH. et. al.Production of recombinant human type I procollagen homotrimer in the mammary gland of transgenic mice II Transgenic Res, 1999, 8, №6, P. 415-427.
