CC BY
10
УДК 577.15.08+606.61
Шокодько М.И., Ванюшенкова А.А., Побережный Д.Ю., Калёнов С.В., Белов А.А.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОГЕННЫХ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА ПРИ СОЗДАНИИ НОВЫХ БИОМЕДИЦИНСКИХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ РАНОЗАЖИВЛЕНИЯ
Шокодько Мария Игоревна, бакалавр 3-го года обучения кафедры биотехнологии;
Ванюшенкова Анна Алексеевна, магистрант 2-го года обучения кафедры биотехнологии;
Побережный Даниил Юрьевич, аспирант кафедры биотехнологии;
Каленов Сергей Владимирович, д.т.н., профессор кафедры биотехнологии;
Белов Алексей Алексеевич, д.т.н., профессор кафедры биотехнологии; *[email protected]
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева»,
Россия, Москва, 125480, ул. Героев Панфиловцев, дом 20.
В статье рассмотрены взаимодействия ионов серебра (азотнокислый раствор), а также неорганических и биогенных наночастиц серебра, обладающих биоцидной активностью, с растворами применяемых в медицине протеаз. Проверена биоцидная активность изучаемых препаратов серебра с помощью микропланшетов (в течение 48 часов) и метода колодцев на твердых агаризованных средах.
Ключевые слова: материалы для ранозаживления, наночастицы серебра, антибактериальное действие, бионанотехнология, ферменты-гидролазы.
THE APPLICATION OF BIOGENIC SILVER NANOPARTICLES IN THE CREATION OF NEW BIOMEDICAL MATERIALS FOR WOUND HEALING
Shokodko M.I., Vaniushenkova A.A., Poberezhny D.Yu., Kalenov S.V., Belov A.A. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
The article discusses the interaction of silver ions (nitric acid solution), as well as inorganic and biogenic silver nanoparticles with biocidal activity, with solutions ofproteases used in medicine. The antibacterial effect of regarded types of silver was proved using microplate within 48hours and agar diffusion method.
Key words: wound healing compounds, silver nanoparticles, antibacterial effect, bionanotechnology, hydrolase enzymes.
Введение
Бактериальное заражение - не редкость в медицине. Все раны, полученные в нестерильных условиях, являются инфицированными. Рост бактериальной флоры в ране провоцирует развитие воспалительного процесса, сопровождающегося повышением местной температуры, гиперемией, болью и нарушением функции части тела, на которой находится рана. Частота развития инфекционных осложнений остается весьма значительной и достигает в целом 45% [1].
В настоящее время для решения данной проблемы создается множество бактерицидных препаратов. Учитывая различную
антибиотикорезистентность микрофлор, выбор средства становится все труднее и труднее. Одним из решений сложившейся ситуации могут быть наночастицы серебра. Из литературных данных известно, что у них есть ряд преимуществ: многоуровневый противомикробный эффект (антибактериальный, антигрибковый,
антивирусный), медленное развитие резистентности, более низкий уровень токсичности по сравнению с аналогами схожего типа воздействия, а также противовоспалительные, репаративные свойства (регулирование активности ряда про- и противовоспалительных цитокинов) [2].
Потенциал применения наночастиц серебра распространяется на такие отрасли их применения как очистка сточных и питьевых вод, производство лакокрасочных и дезинфицирующих средств. В
совокупности с нитридом бора они могут использоваться как катализатор для окисления метанола, что важно в сфере зеленой энергетики, или как адресный лиганд в процессе противораковой терапии с помощью направленного транспорта лекарств [3].
Кроме того, наночастицы серебра являются компонентами для изготовления бактерицидных текстильных материалов, которые позволяют добиваться различных эффектов терморегуляции тела человека, повышают эффективность работы кислородно-транспортной системы организма, поддерживают водно-жировой баланс, стимулируют работу иммунной системы, обмен веществ и регенерацию клеток [4].
В ряде случаев наночастицы серебра обладают даже более выраженным антибактериальным эффектом, нежели ионы серебра. Ионное серебро, попадая в большинство биологических сред, образует нерастворимые соли, выпадающие в осадок, что приводит к потере биоцидной активности. Наночастицы серебра, особенно если они стабилизированы, обладают большей устойчивостью и могут находиться в действующем виде более длительное время, тем самым обеспечивая пролонгацию действия. Наночастицы серебра прикрепляются к поверхности бактериальной клеточной стенки и нарушают ее важнейшие функции, такие как проницаемость и дыхание. Образованные из наночастиц серебра ионы серебра ингибируют дыхательные ферменты, способствуя
синтезу активных форм кислорода, которые повреждают бактериальную клетку. Высокое сродство наночастиц серебра к бактериальной клеточной стенке может быть вызвано присутствием в белках клеточной стенки тиольных групп, с которыми связываются ионы серебра. На поверхности бактериальной клеточной мембраны образуются «ямки», наблюдается перфорация клеточных стенок. В результате происходит значительное увеличение проницаемости оболочки, ведущее к неконтролируемому транспорту через мембрану и, в конце концов, к гибели клеток [5].
Для максимального комплексного воздействия на очаг инфекции и заживления ран, в разрабатываемом препарате для лечения гнойно-некротических ран должны быть ферменты-гидролазы для очищения раневого ложа от нежизнеспособных клеток, биоциды для предотвращения микробного заражения, а также антиоксиданты и обезболивающие средства. Создание многоцелевых перевязочных лечебных материалов для ран и ожогов позволяет заменить прием нескольких средств, способствующих ранозаживлению, уменьшить нагрузку на организм человека за счет комплексной терапии и снизить риски возникновения осложнений при несовместимости с другими лекарственными веществами при раздельном применении, поэтому исследование свойств и синтез материалов на основе модифицированной целлюлозы с
иммобилизованными ферментами, антиоксидантами и антисептиками является очень актуальной проблемой в современной медицине [6].
(значение коэффициента молярной экстинкции (е, Л*МОЛЬ-1*СМ-1) принимали = 2*104 при Xmax).
Были проведены микробиологические исследования использованных концентраций ионов серебра и наночастиц серебра с помощью микрометода и метода колодцев. В результате установлено наличие биоцидных свойств в растворах, полученных после взаимодействия различных форм серебра с иследованными ферментами. Методом колодцев была проверена антибактериальную активность препаратов серебра и ферментов к патогенной микрофлоре (Staphylococcus aureus и Bacillus cereus) (рис. 1). Предварительно на поверхность агаризованной среды помещают полый цилиндр диаметром 8,0 мм, что позволяет создать колодцы заданной глубины и диаметра. После засева в колодцы помещался исследуемый раствор. В качестве объектов сравнения используют стерильную дистиллированную воду. Посевы инкубировались при температуре 37°С в течение 24 часов.
Оценку результатов производили путем сравнения размеров зон задержки роста микроорганизмов, вызванными растворами препаратов серебра. Концентрация клеток была определена по микрометоду Коха и составила 106 КОЕ/мл, что соответствует обсемененности гнойной воспалительной раны, переходящей в сепсис.
Полученные результаты для препаратов наночастиц серебра (препарат Argentum, PlantoSys, Нидерланды) различной концентрации представлены на рисунке 1. Аналогичные данные были получены для всех исследованных препаратов серебра.
Экспериментальная часть
Ранее было исследовано влияние различных форм серебра на протеазы, использующиеся в медицине в 0,2М ацетатном буферном растворе при рН 6,2 (рН гнойной раны в начальный момент заживления), при различном времени совместного выдерживания [7]. В настоящей работе изучали влияние на биоцидность полученной композиции серебра при добавлении фермента или стабилизатора (хитозана). В качестве тест-культур использовались штаммы St. Aureus. Биоцидное действие разрабатываемых композиций анализировали при помощи 96-луночного планшета или на твердой агаризованной среде методом колодцев. Были использованы ферменты: протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба (ПК), трипсин (Тр) крупного рогатого скота (КРС), бромелаин (Брм), химопсин (Хмп) КРС или папаин (Пап). Использовали неорганические НЧ серебра препарат (Argentum, PlantoSys, Нидерланды) или НЧ синтезировали добавлением боргидрида натрия в раствор нитрата серебра и стабилизатора при интенсивном перемешивании. В качестве стабилизатора мы использовали арабиногалактан. Количество наночастиц в растворе рассчитывали из оптической плотности раствора используя [7,8]
Рис. 1 Staphylococcus aureus, выращенный на твердой агаризованной среде
Также биоцидное действие препаратов серебра изучалось с помощью 96-луночного планшета. В питательную среду (L-бульон, Кинг) вносили инокулят культуры и инкубировали на термостатируемом шейкере Thermo-Shaker PST-
60Hl-4, BioSan, при 320 об/мин при 37 ° С в течение 24 часов. Полученную культуру клеток разбавляли в 1000 раз. В лунки планшета вносили 20 мкл культуры, 80 мкл стерильной питательной среды и 100 мкл исследуемых образцов. Через каждые 2 часа проводили измерения оптической плотности при длине волны 505 нм на фотометре для микропланшетов iMark фирмы Bio-Rad Lab. Inc., USA в течение 24 часов.
Кривые ингибирования роста Staphylococcus aureus
-Культура
-Культура с НЧ Си
-Культура с нч Ag г
В рем л, час
Рис. 2 Сравнение кривых ингибирования роста культуры Staphylococcus aureus (c=2*104 КОЕ/мл) наночастицами серебра (НЧ Ag с=15 мг/мл) и меди (ИЧ Cu с=25мг/мл)
Как видно из полученных данных, НЧ серебра практически полностью ингибируют рост патогенной микрофлоры при концентрации 0,07М. Как нами было установлено ранее азотнокислое серебро [7] полностью ингибирует использованные ферменты при концентрации 10-6М (для ПК) или 10-4М (для Тр).
Заключение
В результате исследований была установлена возможность использования медицинские протеазы и биогенные наночастицы серебра в концентрации, превышающей концентрацию растворов
азотнокислого серебра, исследованные ферменты.
инактивирующих
Список литературы
1. Левчук И. П., Костюченко М. В. Антибактериальные препараты для местной терапии ранений различной этиологии //Русский медицинский журнал. Медицинское обозрение. -201S. - T. 2. - №. 2-2. - С. 64-6S.
2. Булыга Л. А. Исследование влияния гелей с наночастицами серебра на процесс заживления раны //Международный студенческий научный вестник. -2015. - №. 2-2. - С. 206-207.
3. Firestein K. L. et al. BN/Ag hybrid nanomaterials with petal-like surfaces as catalysts and antibacterial agents //Beilstein journal of nanotechnology. - 201S. -T. 9. - №. 1. - С. 250-261.
4. Савадян Э. Ш., Мельникова В. М., Беликова Г. П. Современные тенденции использования серебросодержащих антисептиков //Антибиотики и химиотерапия. - 19S9. - T. 34. - №. 11. - С. 874-S7S.
5. Надточенко В. А., Радциг М. А., Хмель И. А. Антимикробное действие наночастиц металлов и полупроводников //Российские нанотехнологии. -2010. - T. 5. - №. 5-6. - С. 37-46.
6. Белов A.A. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества // Дисс. на соис. уч. степ. докт. техн. наук М., РХTУ, 2009. 385 с.
7. Шокодько М.И., Побережный Д.Ю., Каленов С.В., Белов A.A. Влияние препаратов серебра на ферментативную активность протеаз // Сб. науч. трудов «Успехи в химии и химической технологии», 2021, т.ХХХV, №12(247), с.161-163.
8. Ершов Б.Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2001, т. XLV, № 3, с.20-30.
1S9
