CC BY
12
УДК 577.15.08+606.61
Шокодько М.И., Побережный Д.Ю., Каленов С.В., Белов А.А.
ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ СЕРЕБРА НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ПРОТЕАЗ
Шокодько Мария Игоревна, студент 2-го курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Побережный Даниил Юрьевич, аспирант кафедры биотехнологии; Каленов Сергей Владимирович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Белов Алексей Алексеевич, д.т.н., профессор кафедры биотехнологии, *E-mail: ABelov2004@ yandex.ru Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Изучено взаимодействие ионов серебра (азотнокислый раствор), а также неорганических и биогенных наночастиц серебра, обладающих биоцидной активностью, с растворами применяемых в медицине протеаз. Показано отсутствие инактивирующего действия наночастиц серебра на исследованные ферменты при совместной инкубации(комнатная температура, рН 6,3) наночастиц и растворов ферментов до 7 дней. Ключевые слова: протеазы, соединения серебра, инактивация, биогенные наночастицы, неорганические наночастицы.
EFFECT OF SILVER PREPARATIONS ON THE ENZYMATIVE ACTIVITY OF PROTEASES
Shokodko M. I.., Poberezhny D.Yu., Kalenov S.V., Belov A.A.*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
*e-mail: abelov2004@ yandex.ru
The interaction of silver ions (nitric acid solution), as well as inorganic and biogenic silver nanoparticles with biocidal activity, with solutions ofproteases used in medicine has been studied. The absence of the inactivating effect of silver nanoparticles on the studied enzymes was shown during joint incubation (room temperature, pH 6.3) of nanoparticles and enzyme solutions for up to 7 days.
Keywords:proteases, silver compounds, inactivation, biogenic nanoparticles, inorganic nanoparticles..
Введение
Современный комплексный препарат для лечения гнойно-некротических ран должен обладать рядом свойств: хемосорбция гнойного отделяемого, ферментативная, антимикробная, антиоксидантная активности [1]. Обсемененность раны, является распространенной проблемой лечения гнойных поражений. Риск микробного заражения возрастает при наложении и смене перевязочных материалов, в случаях длительных операбельных вмешательств, при лечении ослабленных пациентов. В настоящее время существует широкий спектр антимикробных препаратов - антисептиков и антибиотиков. При повреждении кожного покрова для транзиторной (непостоянной) микрофлоры становятся доступны ткани эпидермиса, проникая в них бактерии способны вызвать сильные осложнения процесса заживления. Для достижения антибактериальной активности возможно использование различные терапевтические агенты (ТА). В литературе было показано, что соединения серебра являются хорошими антимикробными препаратами и давно применяются в медицине [2,3]. Для наружного применения чаще всего используют растворы азотнокислого серебра (А§ р) в концентрации 0,25-5 масс.%. Ферменты являются наиболее лабильными компонентами разрабатываемых изделий для лечения гнойно-некротических ран. Ионы тяжелых металлов, и в частности серебра являются сильными ингибиторами ферментов [4]. Наночастицы серебра в настоящее
время находят все большее применение в качестве антимикробного агента [2]. Экспериментальная часть
В работе были использованы: протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба (ПК), трипсин (Тр) КРС; бромелаин (Брм); химопсин (Хмп) КРС и папаин (Пап). Ферментативные активности по синтетическим субстратам BАpNa и BocAlaONp определяли как описано в [1], в 0,2М ацетатном буферном растворе (0,2М АцБ) рН-6,2 с некоторыми изменениями.
Изменение ферментативной активности (ФА) протеаз в присутствии различных препаратов серебра препаратов проводили следующим образом. К раствору фермента (в 0,2М АцБ) добавляли препараты серебра и 0,2М АцБ до необходимого объема. Выдерживали при комнатной температуре 15 минут и по нижеприведенным методикам определяли ФА.
Определения амидазной активности по паранит-роанилиду N-бензоил-D,L-аргинина (ВАрЫА). К раствору фермента (суммарный объем фермента, 0,2М АцБ и раствора серебра 2,0 мл), помещают в водяной термостат пpи 37°С на 10 минут, затем быстро добавляют 2,5 мл раствора субстрата. Через 30 минут (точное время отмечают по секундомеру) останавливают реакцию добавлением в каждую пробирку по 0,5 мл раствора ледяной уксусной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и измеряют оптические плотности растворов на спектрофотометре при 410 нм.
Спектрофотометр настраивают по раствору, содержащему 0,2М АцБ и раствор ледяной уксусной кислоты в соотношении 9:1. В качестве контроля используют раствор субстрата содержащий и не содержащий препараты серебра, проведенный по методике аналогично опытным образцам.
Активность рассчитывают по формуле *:
А = (До"-Дк)х^х^к, мкМоль рЫА/мг (1) дхкпхуфхг ' ^ ' и
где Доп - оптическая плотность опытной пробы при
410 нм;
Дк - оптическая плотность контрольной пробы при 410 нм;
ЕУ=(У ф+Уб+УвгДг§кл+Унсь) - сумма объемов растворов фермента, буфера, (V ф+Уб = 2,0 мл), раствора субстрата, уксусной кислоты, для нашего случая оно равно 5 = 2, 0 + 2, 5 + 0,5, мл;
Ук - объем колбы, мл, в которой растворяли навеску фермента массой g, мг;
I - время инкубации в минутах; Кп = 7,00 опт. Ед410нм* мл/мкМ паранитроанилина, (коэффициент пересчета от оптической плотности раствора к мкМ паранитроанилина (рКА) в мл раствора). Определения эластолитической активности препаратов по БосЛ1аОЫр. Кинетику ферментативного расщепления ВоеЛ1аОКр изучают с помощью регистрирующего спектрофотометра фирмы Shimadzu ИУ-2600 при длине волны 347,5 нм [1]. В опытах используют кварцевые кюветы толщиной 1 см и объемом 3,5 мл. Во всех случаях определения оптической плотности растворов в кювете сравнения находится соответствующий раствор субстрата ВоеЛ1аОКр (в случае необходимости содержащий препараты серебра). Раствор субстрата готовят непосредственно перед кинетическим экспериментом. Кинетические эксперименты проводят в 0,2М АцБ (рН 6,2) при 25°С.
Типичный кинетический эксперимент состоит в следующем: в кювете спектрофотометра фирмы Shimadzu ИУ-2600 при 25°С в термостатируемой ячейке (ТСС-240А) смешивают раствор фермента, серебра и 0,2М АцБ, до суммарного объема 2,9 мл выдерживают в течении 15 минут, в контрольную кювету к раствору АцБ добавляли раствор, в котором растворяют фермент и при необходимости препараты серебра. Затем в кюветы вводят по 0,1 мл раствора субстрата и содержимое кювет тщательно перемешивают в течение 2-5 с. Регистрацию оптической плотности проводят при 347,5 нм.
Начальную скорость (Уо) гидролиза находят как тангенс угла наклона касательной к кинетической кривой в начальный период времени и выражают как изменение поглощения (ДД347,5) за минуту. Активность рассчитывают по формуле:
А = ^ х 546; нМВ°сД|а0Мр * мин (2)
д мг
где 546 - коэффициент пересчета ДДз47,5 в нмоль гидролизованного ВоеЛ1аОКр
Уо - начальная скорость гидролиза ВоеЛ1аОКр, линейный прирост оптической плотности за 1 минуту;
§ - количество фермента в пробе, мг. За 100% (за 1) принимали значение ФА без препаратов серебра. На рисунке 1 приведены полученные данные о взаимодействии Л§ р с раствором ПК. Из литературы [1, 5-7] известно, что молекулярная масса ферментов входящих в ПК составляет 23^30 кДа, причем для них не отмечалось наличие углеводородной части. Существенным признаком, объединяющим молекулярные свойства этих ферментов, служит их необычайно низкая изоэлектрическая точка, приводимые обычно значения р1 ниже 3,5. Это связано с тем, что коллагенолитические протеазы ракообразных характеризуются повышенным содержанием отрицательно заряженных аминокислот при низком содержании положительно заряженных. Как было установлено в работах [5-7], ПК содержит в своем составе помимо истинной коллагеназы, различные протеиназы, что и объясняет его широкую субстратную специфичность и уникальные терапевтические свойства. Растворы серебра оказывают наиболее сильное ингибирующее действие из изученных протеаз на ферменты ПК. И это мы связываем с его аминокислотным составом. Потенциальные центры координации в белках, способные связывать ионы металлов - способные к ионизации боковые цепи аминокислот (СО - из пептидной связи, СООН, КН, КН2, К), гетероатомы боковых цепей серина, треонина, цистеина, метионина. Центров координации, таким образом, очень и очень много, и то, с какими донорными атомами будет происходить связывание, будет определяться конформацией белка, сродством металла к гетероатому и кислотностью среды рН. Металл может распределяться между несколькими связывающими центрами с различными величинами кислотности [8]. Средняя молекулярная масса одного аминокислотного остатка обычно принимается за 120. Используемые нами ферменты [9] имеют молекулярную массу 20-30 кДа т.е. порядка 200-250 аминокислотных остатков содержится в этих ферментах, с ионами металла могут взаимодействовать только доступные
аминокислотные остатки. В работах [4,10,11] показано, что с ионами серебра из аминокислот наиболее сильно взаимодействует цистеин. Осуществляется координация по аминогруппе, а карбоксильные остатки принимают слабое участие. В последнее время наночастицы серебра находят применение в качестве биоцидного агента в медицине. Они обладают меньшей токсичностью (особенно биогенные наночастицы) и меньшим повреждающем действием на компоненты организма [2,12,13,15]. Концентрацию ионов серебра в наночастицах рассчитывали с использованием литературных данных о коэффициентах молярной экстинкции [14].
Рис 1. Потеря ФА (А/Ао) ПК в присутствии Ag р (субстрат БосА1аОЫр)
На рис.2 приведены полученные спектры использованных препаратов серебра.
Рис. 2. УФ-Вид спектры различных препаративных форм серебра (F O - биогенные наночастицы полученные с помощью гриба; AgNOs - раствор соли; In N -неорганические наночастицы
Как было установлено в предыдущих работах [15] используемые нами наночастицы серебра обладают антимикрообными свойствами по отношению ко многим патогенным микроорганизмам которые могут присутствовать в гнойной ране. Нами было исследовано взаимодействие наночастиц серебра (F O и In N) с раствором ПК в 0,2М АцБ (рН 6,2 - модель гнойной раны) при комнатной температуре в течении 168 ч ( в качестве контроля использовали раствор ПК в той же концентрации и условиях). Было установлено отсутствие инактивирующего действия использованных наночастиц на ферментативную активность ПК. Что говорит о возможном совместном использовании данных наночастиц и фермента. Заключение
Установлено, что использованные наночастицы серебра не оказывают инактивирующего действия на исследованные ферменты в отличии от раствора серебра. Возможно совместное использование наночастиц серебра без потери ферментативных свойств, полученные растворы обладают антимикробными свойствами. Список литературы
[1] Белов А.А. Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов
на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества // Дисс. на соис. уч. степ. докт. техн. наук М., РХТУ, 2009. 385 с.
[2] Щербаков А.Б., Корчак Г.И., Сурмашева Е.В. и др., Препараты серебра: вчера, сегодня и завтра Фармацевтический журнал. - 2006. - №5. - С. 45-57.
[3] Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна. 15-е изд. 2006. - 1206 с
[4] RUSSELL A.D., Path F.R.C., Pharm.S. F.R. and HUGO W.B., 7 Antimicrobial Activity and Action of Silver// Progress in Medicinal Chemistry - 1994.-Vol. 31-Р.351-370.
[5] Литвин Ф.Е. Коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса камчатского краба; выделение и свойства // Дисс. ... канд. биол. наук. М., 1993.- 136 с.
[6] Климова О.А., Ведищева Ю.В., Стронгин А.Я. Выделение и характеристика коллагенолитических ферментов из гепатопанкреаса краба-стригуна Chionoecetes Opilio //Доклады Акад. Наук СССР.- 1991. №2.- Том 317.- С. 482-484.
[7] Rudenskaya G.N., Isaev V.A., Shmoylov A.M. et al Preparation of proteolytic enzymes from kamchatka crab paralithodes camchatica hepatopancreas and their application // App.Biochem.Biotech. - 2000. - Vol.22. -p.175-184.
[8] Клячко Н. Л., Казанков Г. М. Механизмы ферментативного катализа/Конспект лекций , Фонд Вольное Дело, Хим.Фак. МГУ , С 89-91.
[9] Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. -М.: Наука, 1971.- 404 с.
[10] Liau S.Y., Read D.C., Russel A.D. et al Interaction of silver nitrate with readily identifiable groups: relationship to the antibacterial action ofsilver ions //Lett. in Apl.Microb.-1997. -25. -P.279-283.
[11] Chambers J.L., Christoph G.O., Krieger M. et al Silver ion inhibition of serine proteases: crystallographic study of silver--trypsin //Biochemical and biophysical research communications 1974-Vol. 59,- No. 1, -P.70-74.
[12] A.M. Abdel-Mohsena, Radim Hrdinaa, Ladislav Burgertcrs et al Antibacterial activity and cell viability of hyaluronan fiber with silver nanoparticles // Carb. Polym.-2013-92- Р. 1177- 1187.
[13] Станишевская И.Е., Стойнова А.М., Марахова А.И., Станишевский Я.М. Наночастицы серебра: получение и применение в медицинских целях //Разработка и регистрация лекарственных средств.-2016 №1 (14), С. 66-69.
[14] Ершов Б.Г. Наночастицы металлов в водных растворах: электронные, оптические и каталитические свойства // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2001, т. XLV, № 3с20-30
[15] Mariia G. Gordienko , Vera V. Palchikova , Sergei V. Kalenov , Evgeniy A. Lebedev , Alexei A. Belov & Natalia V. Menshutina //The alginate-chitosan composite sponges with biogenic Ag nanoparticles produced by combining of cryostructuration, ionotropic gelation and ion replacement methods, International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials, (2020):
3.000
2.000
1.000
190.00
300.00
400.00
500.00
