CC BY
44
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК: 616.329-002-073
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЛАЗЕР-ИНДУЦИРОВАННОЙ АУТОфЛУОРЕСЦЕНЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ ПИщЕВОДА БАРРЕТТА
О.Б. Дронова1, А.А. Третьяков1, А.Н. Мищенко1, Н.Н. Булгакова2
кафедра хирургии фППС Оренбургской медицинской академии1 Институт общей физики РАН им. А.М. Прохорова, г. Москва2
Методом локальной флуоресцентной спектроскопии in vivo проведены измерения и анализ спектров лазер-индуцированной аутофлуоресценции нормального и метаплазированного эпителия пищеводно-желудочного перехода у больных гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью. Показано, что применение локальной флуоресцентной спектроскопии в ходе гастроэзофагоскопии способствует повышению качества диагностики пищевода Барретта.
Ключевые слова: гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, пищевод Барретта, флуорецентная диагностика, локальная флуоресцентная спектроскопия.
LASER INDUCED AUTOFLUORESCENCE OF NORMAL AND METAPLASTIC EPITHELIUM OF ESOPHAGOGASTRIC TRANSITION AT GASTROESOPHAGEAL REFLUX DISEASE O.B. Dronova1, A.A. Tretyakov1, A.N. Mishchenko1, N.N. Bulgakova2 Surgery Department, Orenburg Medical Academy1,
A.M. Prokhorov Institute of General Physics, Russian Academy of Sciences2
In vivo autofluorescence of normal and metaplastic epithelium of esophagogastric transition in patients with reflux-esophagitis was studied by local fluorescence spectroscopy under 532 nm excitation. It was shown that application of in vivo local fluorescence spectroscopy during gastroesophagoscopy makes it possible to improve a quality of diagnostics of Barrett’s esophagus.
Key words: gastroesophageal reflux disease, Barrett’s esophagus, fluorescent diagnosis, local fluorescent spectroscopy.
Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ) является широко распространенным заболеванием, в последнее время отмечена тенденция к росту частоты ее возникновения [1, 2]. Наиболее грозным осложнением ГЭРБ является пищевод Барретта (ПБ), т.е. появление кишечной метаплазии в области пищеводножелудочного перехода. Распространенность пищевода Барретта среди лиц с эзофагитом колеблется от 5 до 30 % [5]. При пищеводе Барретта риск развития аденокарциномы пищевода повышается в десятки раз [1, 2, 9]. Поэтому своевременное распознавание пренеопласти-ческих осложнений гастроэзофагеальной реф-люксной болезни становится одной из важных задач диагностической службы и лежит в основе
первичной профилактики онкопатологии этого отдела пищеварительной системы.
Одним из методов оптической спектроскопии, совершенствующих диагностику предрака и раннего рака ПБ, является флуоресцентная спектроскопия, которая выполняется при эндоскопическом исследовании [3, 8]. Основным достоинством этого метода является возможность неинвазивного получения в реальном времени in vivo информации о патологии в той точке поверхности слизистой оболочки, где производятся измерения спектров. Поэтому в литературе их принято называть методами локальной (или точечной) спектроскопии.
Принцип действия локальной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС) основан на реги-
страции индуцированного слабого свечения биологической ткани в УФ и видимом диапазоне спектра (350-700 нм), возникающего при поглощении квантов света определенными биологическими молекулами, эндогенными или экзогенными флуорофорами, содержащимися в тканях. Эндогенная флуоресценция (или аутофлуоресценция) биологических тканей, обусловленная излучением эндогенных флуорофоров, является информативным диагностическим параметром. Различия в спектрах аутофлуоресценции между злокачественными и здоровыми тканями составляют основу аутофлуоресцентной диагностики рака [6, 10, 14].
В целях аутофлуоресцентной диагностики тяжелой дисплазии и аденокарциномы пищевода ЛФС была впервые применена в 1996 г. [4]. В последующие годы диагностическая эффективность этого метода изучалась во многих научных центрах [3, 8]. В то же время существует только две зарубежные публикации, в которых описаны возможности аутофлуоресцентного детектирования метаплазированного эпителия слизистой пищеводно-желудочного перехода [7, 13].
С целью улучшения диагностики пренеопла-стических осложнений гастроэзофагеальной рефлюксной болезни в данной работе были исследованы возможности лазер-индуцированной аутофлуоресценции в выявлении in vivo различий между нормальным и метаплазированным эпителием слизистой пищеводно-желудочного перехода.
Материал и методы
В наших исследованиях использовалась методика ЛФС, которая применяется в МНИОИ им. П.А. Герцена в отделении эндоскопических и физических методов диагностики и лечения опухолей (руководитель - проф. В.В. Соколов) для флуоресцентной диагностики рака слизистых оболочек полых органов [11, 14]. Измерения спектров аутофлуоресценции проводили с помощью компьютеризованной спектральнофлуоресцентной установки «Спектр-Кластер» (ООО «Кластер») [12].
Данная установка включает в себя волоконно-оптическое устройство доставки лазерного излучения и сбора флуоресцентного излучения;
спектрометр; персональный компьютер; специализированное программное обеспечение и лазерный источник излучения для возбуждения флуоресценции мощностью 5 мВт и длиной волны 532 нм.
Для интерпретации спектров и получения диагностической информации использовали интенсивность регистрируемого сигнала аутофлуоресценции (1) и отношение интегральных интенсивностей спектра в двух спектральных областях (2): 620-650 нм и 555-585 нм, т.е. спектрально-флуоресцентный диагностический параметр Df [11]. В спектрально-флуоресцентной диагностической установке «Спектр-Кластер» величина диагностического параметра Df рассчитывается с помощью специализированного программного обеспечения в реальном времени, отображается на экране монитора компьютера и вносится автоматически в протокол спектрально-флуоресцентного обследования.
Результаты и обсуждение
Спектральные измерения слизистой оболочки в области пищеводно-желудочного перехода были проведены в ходе эзофагогастро-дуоденоскопии у 41 пациента. У 15 пациентов кишечная метаплазия в слизистой оболочке с цилиндрическим эпителием была подтверждена морфологически.
Нормальная слизистая пищевода
Типичные спектры аутофлуоресценции нормальной слизистой пищеводно-желудочного перехода (ПЖП) представлены на рис. 1. При данном возбуждении спектры аутофлуоресценции многослойного плоского эпителия выше Z-линии и цилиндрического эпителия ниже Z-линии располагаются в области 550-800 нм с максимумом в районе 590-600 нм, их формы идентичны, величина спектрально-флуоресцентного диагностического параметра составляет Df = 1,0 ± 0,2 (рис. 1).
Слизистая ПЖП с кишечной метаплазией
Исследования аутофлуоресценции эпителия слизистой пищеводно-желудочного перехода у 15 пациентов с кишечной метаплазией слизистой с цилиндрическим эпителием и анализ полученной спектральной информации показали следующие особенности in vivo спектров аутофлуоресценции при кишечной метаплазии.
1.Неоднородное распределение интенсивности аутофлуоресценции
У пациентов с морфологически подтвержденной кишечной метаплазией цилиндрического эпителия регистрировалось неоднородное распределение интенсивности аутофлуоресценции при измерениях спектров ниже Z-линии. В целом, по всей группе пациентов можно отметить тенденцию к понижению интенсивности аутофлуоресценции в зоне кишечной метаплазии, однако в силу указанных ранее особенностей измерений спектров аутофлуоресценции in vivo оценки интенсивности аутофлуоресценции не могут претендовать на строгий количественный анализ. Значительное уменьшение интенсивности аутофлуоресценции при кишечной метаплазии и атрофии отмечено у 8 пациентов.
2. Возрастание величины спектральнофлуоресцентного диагностического параметра Df^
Анализ полученной спектральной информации показал, что у 13 из 15 пациентов в спектрах метаплазированного цилиндрического эпителия пищеводно-желудочного перехода величина спектрально-флуоресцентного диагностического параметра Df возрастает (рис. 1). При кишечной метаплазии данный параметр достоверно
Рис. 1. Спектры аутофлуоресценции in vivo в двух точках выше Z-линии (плоский многослойный эпителий) и в двух точках ниже Z-линии (метаплазированный цилиндрический эпителий):
1 - пищевод выше Z-линии;
2 - пищевод ниже Z-линии;
3, 4 - пищевод ниже Z-линии (полная кишечная метаплазия)
возрастает (в среднем Df = 1,7 ± 0,2), в то время как в спектрах аутофлуоресценции нормального цилиндрического эпителия и многослойного плоского эпителия в районе Z-линии величина Df остается на уровне нормальных значений либо возрастает незначительно (Df = 1,1 ± 0,2).
У 2 пациентов (с неполной и полной кишечной метаплазией) не было выявлено особенностей в спектрах аутофлуоресценции метаплазированного эпителия. Можно предположить, что это связано с неточностью проведения спектральных измерений в местах прицельной биопсии. Напротив, у 4 пациентов ниже Z-линии были зарегистрированы спектры аутофлуоресценции с повышенными значениями спектрально-флуоресцентного диагностического параметра Df, однако биопсия не подтвердила наличие кишечной метаплазии. У всех этих пациентов отмечался хронический активный хеликобактерный гастрит с различной степенью атрофии. У одного пациента ранее было подозрение на MALT-лимфому тела желудка. Представляется обоснованным дальнейшее тщательное наблюдение пациентов с положительными результатами ЛФС.
Поскольку величина диагностического параметра Df отражает соотношение интегральных интенсивностей в красной и желтой
спектральных областях, то ее увеличение может свидетельствовать о возрастании интенсивности аутофлуоресценции в красной области спектра. Однако в подавляющем большинстве спектров аутофлуоресценции метаплазированного эпителия не было зарегистрировано появление отдельных пиков флуоресценции эндогенных порфиринов. Только у 2 пациентов, при атрофии и значительной полной кишечной метаплазии, в некоторых точках метаплазированного эпителия на фоне крайне низкой интенсивности аутофлуоресценции были зарегистрированы пики флуоресценции эндогенных порфиринов в красной области спектра с максимумом на 635 нм. Наличие этих пиков приводило к значительному возрастанию диагностического параметра (до 2-2,6).
3. Особенности спектров лазер-индуци-рованной аутофлуоресценции при аденокарциноме пищевода
Локальная флуоресцентная спектроскопия была проведена у пациента с аденокарциномой пищевода, у которого зубчатая линия расположена на 35 см от резцов, кардия - на 38 см от резцов. Опухоль визуализировалась по переднеправой стенке, ниже Z-линии, в дефекте слизистой с многослойным плоским эпителием на 33 см от верхних резцов, а выше Z-линии
Рис. 2. Спектры in vivo лазер-индуцированной аутофлуоресценции при аденокарциноме пищевода
определялась деформация слизистой пищевода при эндоскопическом осмотре. Гистологически ниже Z-линии (1) раковые клетки определяются на фоне фундально-кардиальной слизистой с некротическими массами, воспалительными грануляциями, остатками лимфофолликул, на 33 см от верхних резцов - низкодифференцированная аденокарцинома, а выше Z-линии -перстневидноклеточный рак на фоне тяжелой дисплазии кардиальных желез кардиальной слизистой. Пищеводный эпителий опухолевым ростом малоизменен.
Во всех спектрах аутофлуоресценции, измеренных в пищеводе на 33 см, ниже и выше зубчатой линии, в зоне прорастания опухолевого поражения и в визуально нормальном многослойном плоском эпителии над опухолью, присутствуют пики флуоресценции c максимумом в красной области спектра на 635 нм и 705 нм (рис. 2). Величина диагностического параметра в очагах рака возрастала до 7.
Объяснение данного феномена заключается в следующем. На определенных стадиях развития в спектрах аутофлуоресценции злокачественных опухолей наблюдается красная флуоресценция эндогенных порфиринов, которую дают продукты гемолитических процессов либо некоторые типы бактерий, способные продуцировать про-
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЛАЗЕР-ИНДУЦИРОВАННОй АУТО ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ...
------------------------------------------------------------------------------ 15
то- и копропорфирины. Полосы флуоресценции в красной области, регистрируемые в спектрах аутофлуоресценции у данного пациента, полностью соответствуют полосам флуоресценции эндогенного протопорфирина IX при возбуждении его флуоресценции в 405 нм и 532 нм [10]. Таким образом, данное наблюдение показало. что в случае подслизистого роста перстневидноклеточного рака и низкодифференцированной аденокарциномы пищевода происходит накопление эндогенного протопорфирина IX, флуоресценция которого регистрируется не только в зоне опухолевого поражения, но и над опухолью в визуально не измененной слизистой пищевода.
Спектр аутофлуоресценции биологических тканей является суперпозицией спектров флуоресценции отдельных эндогенных флуо-рофоров и зависит от многих факторов. На его интенсивность и форму влияют концентрация и распределение эндогенных флуорофоров, их спектральные характеристики возбуждения и флуоресценции, особенности метаболизма, архитектоники и оптических свойств ткани, обусловленные присутствием нефлуоресцирующих хромофоров.
Наиболее значительными эндогенными флуорофорами видимого диапазона спектра являются:
- элементы соединительной ткани - коллаген и эластин;
- компоненты дыхательной цепи - флави-ны и никотинамиддинуклетид (НАДН), участвующие в окислительно-восстановительных процессах;
- порфирины, которые участвуют в биосинтезе гемма в клетках или являются продуктами биосинтеза сапрофитирующей или патогенной микрофлоры при бактериальной инфекции.
При развитии неоплазии эпителиальные ткани подвергаются различным биохимическим и структурным изменениям, которые отражаются на спектре аутофлуоресценции. Различия в спектрах аутофлуоресценции между нормальным и диспластическим эпителием пищевода были показаны в ряде зарубежных публикаций [12].
Как показали наши исследования, нормальный плоский и метаплазированный цилиндрический эпителий также имеют различия в
спектрах АФ. Различия в спектрах АФ нормального плоского и цилиндрического эпителия с метаплазированным по кишечному типу цилиндрическим эпителием пищеводно-желудочного перехода выявлены при возбуждении в зеленой области спектра у 13 из 15 пациентов. Информативным параметром является соотношение интегральных интенсивностей в красной и желтой области спектра, которое достоверно возрастает при развитии кишечной метаплазии. Резкий рост данного параметра наблюдается при аденокарциноме пищевода.
Эти данные согласуются с результатами, полученными в исследовании, в котором было показано, что информативным параметром, характеризирующим различия в спектрах АФ нормального плоского и метаплазированного цилиндрического эпителия, является соотношение интенсивностей в красной и зеленой областях спектра при возбуждении в УФ области [13]. Соответственно, авторы высказали предположение, что трансформация метапла-зированного эпителия в сторону дисплазии III и аденокарциномы пищевода сопровождается ростом этого соотношения.
Таким образом, применение в ходе эзофа-гогастродуоденоскопии ЛФС и оценка лазер-индуцированной аутофлуоресценции эпителия пищеводно-желудочного перехода позволяют in vivo в реальном времени получать диагностическую информацию. Необходимо отметить, что объем ткани, анализируемый in vivo методом ЛФС, зависит от оптических свойств ткани и в среднем составляет порядка 1-4 мм3, что сравнимо с объемом ткани, который берется при щипцовой биопсии. Однако размер выборки в случае локальной флуоресцентной спектроскопии значительно больше, поскольку спектры могут измеряться из множества точек, а количество биопсий ограничено. Кроме того, за то время, которое необходимо для одной биопсии, можно измерить большое количество спектров во многих точках поверхности слизистой. Следовательно, проведение in vivo ЛФС и оценка лазер-индуцированной аутофлуоресценции эпителия пищеводно-желудочного перехода могут способствовать взятию прицельной биопсии и позволят минимизировать количество необходимых биопсий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Баранская Е.К. и др. Трудности диагностики и лечения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни // Врач. 2003. № 5. С. 10-14.
2. Кубышкин В.А., Корняк В.С. Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь. Диагностика, консервативное и оперативное лечение. М., 1999. 208 с.
3. Соколов В.В., Булгакова Н.Н., Дронова О.Б. и др. Флуоресцентные методы в диагностике тяжелой дисплазии и раннего рака пищевода Барретта (Обзор литературы) // Российский онкологический журнал. 2008. № 3. С. 46-54.
4. Соколов В.В., Жаркова Н.Н., Филоненко Е.В. Патент РФ № 219273 на изобретение «Способ эндоскопической флуоресцентной диагностики злокачественных опухолей полых органов».
5. Трухманов А.С. Пищевод Барретта: эпидемиология, патогенез, клиническое течение и профилактика // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. 2002. Т. XII, № 5. С. 59-62.
6. Чиссов В.И., Соколов В.В., Булгакова Н.Н., Филоненко Е.В. Флуоресцентная эндоскопия, дермаскопия и спектрофотометрия в диагностике злокачественных опухолей основных локализаций // Российский биотерапевтический журнал. 2003. Т. 2, № 4. С. 45-56.
7. Чиссов В.И., Соколов В.В., Жаркова Н.Н. и др. Возможности применения флуоресцентной диагностической установки «Спектр» в онкологии // Лазерные и информационные технологии
в медицине XXI: Материалы международной конференции и научно-практической конференции Северо-Западного региона России. СПб., 2001. С. 513-514.
8. Bourg-Heckly G., Blais J., Padilla JJ. et al. Endoscopic ultraviolet-induced autofluorescence spectroscopy of the esophagus: tissue characterization and potential for early cancer diagnosis // Endoscopy 2000. Vol. 32. Р 756-765.
9. CameronA.J. The Epidemiology of Barrett’s Esophagus and Adenocarcinoma // Pract. Gastroentorol. 1995 Vol. 19, № 6. 24В-24Е
10. Georgakoudi I., Jacobson B.C., MullerM.G. et al. NAD(P)H and collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous changes // Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 682-687.
11. Kolli V, Savage H.E., Yao T.J., Schantz S.P. Native cellular fluorescence of neoplastic upper aerodigestive mucosa // Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 1995. Vol. 121. P 1287-1292.
12. Panjehpour M., Overholt B.F., Schmidhammer J.L. et al. Spectroscopic diagnosis of esophageal cancer. A new classification model, improved measurement system // Gastrointest. Endosc. 1996. Vol. 41. P. 577-581.
13. Stroka R., Baumgartner R., Buser A. et al. Laser assisted detection of endogenous Porphyrin in Malignant Diseases // SPIE. 1991. Vol. 1641. P. 99-105.
14. Wong Kee Song L.M., Marcon N.E. Novel optical diagnostic techniques for the recognition of metaplasia and dysplasia / Eds. P. Sharma, R.E. Sampliner. Barrett’s Esophagus and Esophageal Adenocarcinoma. Boston: MA, Blackwell Science, 2001. P. 123-136.
Поступила 30.05.08
