CC BY
41
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009
В. Т. Пивень,
доктор сельскохозяйственных наук, профессор
О. А. Сердюк,
кандидат сельскохозяйственных наук
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17 тел.: (861)275-74-47, факс: (861)254-27-80 e-mail:zaschita-vniimk@mail.ru
ИСКУССТВЕННОЕ ИНФИЦИРОВАНИЕ РАСТЕНИЙ ГОРЧИЦЫ САРЕПТСКОЙ
ВОЗБУДИТЕЛЕМ АЛЬТЕРНАРИОЗА В ЛАБОРАТОРНЫХ И ПОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ
Ключевые слова: альтернариоз, горчица, проростки, инокулирование, влажная камера, температура, суспензия, титр, патоген.
УДК 633.853.483:632.9
В последние годы увеличивается вредоносность некоторых болезней горчицы сарептской, ранее не имевших существенного значения. Вероятность их эпифитотийного развития повышается в связи с географической концентрацией культуры и возрастанием генетической однородности сортов.
Одним из наиболее распространенных и вредоносных заболеваний является альтернариоз, вызываемый грибами рода ЛЫвтапа. Болезнь поражает как вегетативные, так и генеративные органы растений, вызывая снижение урожая до 40-50 %, а также ухудшение посевных и товарных качеств семян.
В настоящее время отсутствуют сорта горчицы сарептской, устойчивые или толерантные к альтер-нариозу. Выявить селекционные образцы, способные сопротивляться поражению болезнью возможно в результате проведения искусственного инфицирования растений возбудителем болезни, создав благоприятные условия для развития патогена.
Из литературных источников известно о заражении растений пшеницы грибом ЛЫвтапа МЫапа суспензией конидий 1,6-Ш4 кон./мл в тепличных условиях в разные фазы вегетации [5], растений амаранта грибом Л. аЫгта(а суспензией конидий 1,0-Ш7 спор в 1 мл рапсового масла в полевых условиях [2]. Сведений об оценке капустных культур, в частности горчицы сарептской, на устойчивость к альтернариозу в литературных источниках не обнаружено.
Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось определение условий, необходимых для искусственного заражения растений горчицы сарептской грибом Л. Ьга^^1асо1а в лабораторных и полевых условиях, а также камере искусственного климата, для проведения оценки сортов и сортообразцов на устойчивость к альтернариозу. В задачи исследований входило определение оптимального титра суспензии конидий и фрагментов мицелия патогена, диапазона температур и периода увлажнения для успешного процесса инокулирования проростков, а также фазы развития растений при проведении оценки в камере искусственного климата и полевых условиях.
Материал и методы. В качестве материала были использованы проростки и растения горчицы сарептской перспективного сорта Росинка, так как в ходе исследований отмечено поражение альтернариозом растений данного сорта на 5,0-7,0% выше, чем других сортов.
Для инокулирования использовали изоляты гриба Л. Ьга^^1асо1а, как наиболее патогенного вида рода ЛЫвтапа для растений горчицы.
Агрессивность патогена определяли по модифицированной нами методике P.A. Delwiche [4]. Проростки горчицы сарептской выращивали в лабораторных условиях в стерильном песке при температуре 2022 оС в течение 7 дней. Исследования проводили в двух вариантах: с механическим травмированием поверхности семядольных листьев стерильной иглой и без него, создавая условия влажной камеры. На каждую половину семядольных листьев капали суспензию конидий и фрагментов мицелия патогена с разной концентрацией - от 5,0-Ш3 до 1,0-Ш7 КОЕ/мл. Учеты проводили каждый день в течение 10 дней при температуре 20-22 оС. По данным наших исследований, эта температура окружающей среды является оптимальной для роста и развития гриба Л. Ьт&^'1асо1а. Критериями агрессивности служили инкубационный период болезни, количество пораженных семядолей и развитие болезни на семядолях.
Для определения условий внешней среды, при которых отмечают три этапа распространения болезни: начало процесса инфицирования растений горчицы сарептской грибом А. Ьга^^'1С1со1а, массовое проявление признаков альтернариоза и полное поражение растений, семядоли внешне здоровых проростков травмировали стерильной иглой и наносили на место укола суспензию конидий и фрагментов мицелия гриба А. brassicicola с титром 1,0-107 КОЕ/мл. Исследования проводили в термостатах при температурах 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 оС, создавая условия влажной камеры. В качестве контроля - капли стерильной воды. Поражение проростков горчицы в условиях влажной камеры учитывали в течение 2-х суток.
В камере искусственного климата и полевых условиях инокуляцию горчицы сарептской возбудителем альтернариоза проводили в разные фазы развития растений, начиная с фазы розетки, по адаптированной нами для данной культуры и данного патогена методике Б. В. Квасникова [1] путем опрыскивания растений суспензией спор и конидий патогена (1,0-Ш7 КОЕ/мл) с помощью пульверизатора.
Результаты и обсуждение. Для успешного проведения искусственного инфицирования растений возбудителем болезни необходимы: восприимчивое растение, оптимальный титр суспензии спор и фрагментов мицелия патогена - КОЕ/мл (колониеобразующие единицы в 1 мл суспензии) и благоприятные условия окружающей среды для развития патогена - прежде всего температура и период увлажнения (рис. 1).
Рисунок 1 - Факторы, необходимые для успешного процесса инокулирования.
Изучение агрессивности гриба А. brassicicola, определение необходимого для инокулирования титра суспензии спор и фрагментов мицелия патогена проводили на проростках горчицы сарептской в лабораторных условиях. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 — Развитие альтернариоза на проростках горчицы сарептской в зависимости от титра суспензии конидий и фрагментов мицелия гриба Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts. и механического повреждения поверхности семядолей, сорт Росинка
ВНИИМК, 2006 г.
Вариант Титр суспензии, КОЕ/мл Инкубационный период, сутки Пораженных семядолей, % Развитие болезни, %
С повреждением семядолей 5Д103 9 13,2 16,8
1,0 104 9 27,5 19,2
1,0 105 4 30,0 33,0
2,5-105 4 30,0 42,0
5,0-105 4 42,4 60,0
1,0-106 1 70,4 93,4
1,0107 1 100 100
Без повреждения семядолей 5,0-103 9 5,6 5,8
1,0 104 9 10,3 6,4
1,0 105 7 11,4 17,6
2,5-105 6 15,6 20,0
5,0-105 5 25,0 36,0
1,0-106 1 43,4 64,0
1,0107 1 61,4 68,0
Выявлено, что титр суспензии гриба А. brassicicola влияет на длительность инкубационного периода альтернариоза. В вариантах с повреждением семядолей проростков горчицы сарептской и без него при увеличении количества спор и фрагментов мицелия патогена в 1 мл суспензии сокращается время проявления первых признаков болезни на семядолях. Минимальный инкубационный период составил всего 1 день при инокулировании их титром 1,0^ 106 и 1,0-107 КОЕ/мл. Количество пораженных семядолей проростков составило: при механическом повреждении поверхности листовой пластинки 70,4 и 100 % соответственно, без повреждения - 43,4 и 61,4 % соответственно.
Развитие болезни при повышении титра суспензии увеличивается, достигая наибольшего значения при инокулировании титром 1,0-107 КОЕ/мл, в обоих вариантах - 100 и 68,0 % соответственно.
Следовательно, титр суспензии гриба А. brassicicola 1,0-107 КОЕ/мл является оптимальным для проведения первичной оценки селекционного материала горчицы сарептской на устойчивость к альтернариозу.
Следующим этапом исследований было определение всего температурного диапазона, при котором возможно заражение проростков горчицы возбудителем альтернариоза, и соответствующего ему периода увлажнения (рис. 2).
Для этого в лабораторных условиях проростки инокулировали суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба А. brassicicola с концентрацией 1,0-107 КОЕ/мл.
S2
О А---------1--------1---------1---------1--------1----------1—
4.0 ао 12.0 16.0 20.0 24.0 28.0
ТаиЕрадивздв) °С
----5 % пористых проростков --------50% тракяшхфоропкое
----100 % пораимых прорости®
Рисунок 2 - Влияние длительности периода увлажнения и температуры воздуха на инфицирование проростков горчицы сарептской грибом Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts.,
ВНИИМК, 2006 г.
В опыте рассматривалось три показателя: 5, 50 и 100 % пораженных проростков горчицы сарептской - для того, чтобы определить, при каких условиях начинается процесс инфицирования, отметить массовое проявление признаков альтернариоза и полное поражение проростков.
Установлено, что инфицирование проростков горчицы сарептской грибом A. brassicicola происходит в интервале температур 8,0-28,0 оС с удлинением влажного периода до 48 ч. При данных температурах количество пораженных проростков составило 5 %. Наиболее благоприятной можно считать температуру 20 оС, при которой первые признаки заражения проявляются уже после 5-часового периода увлажнения. Чем больше температура воздуха отклоняется от оптимальной в ту или иную сторону, тем больший период увлажнения требуется для инфицирования и проявления первых признаков альтернариоза на проростках.
В более узком температурном диапазоне - 12-24 оС - количество пораженных проростков составило 50 % после 50-часового периода увлажнения, при температурах 20 и 24 оС - 100 % через 24 и 36 ч соответственно.
При температуре 28 оС наибольшее количество пораженных проростков, не превышающее 5 %, отмечено при 18-часовом периоде увлажнения. При большей экспозиции увеличения количества пораженных проростков отмечено не было, что, видимо, связано с угнетением процессов жизнедеятельности патогена при длительном воздействии высоких температур.
На основании вышеизложенных данных нами разработана методика искусственного заражения проростков горчицы сарептской в лабораторных условиях без повреждения поверхности семядольных листьев: визуально здоровые семена высевают в стерильный песок в пластиковые ящики и выращивают при температуре 20-22 оС. Через 7 дней после посева на все семядольные листья наносят капли суспензии конидий и фрагментов мицелия гриба А. brassicicola с титром 1,0-107 КОЕ/мл. В течение суток создают влажную камеру, обильно поливая проростки водой и накрывая ящики пленкой. Через сутки у восприимчивых растений проявляется пожелтение семядолей, часто с некротическими поражениями, по которым и оценивают их устойчивость, используя модифицированную нами шкалу P. A. Delwiche [4]:
0 - отсутствие пожелтения семядольных листьев;
1 - пожелтение семядольных листьев ограниченное, диаметр 0,5-1,0 мм;
2 - пожелтение семядольных листьев, диаметр 1,5-3,0 мм;
3 - темные некротические поражения 1,5-3,0 мм, вокруг которых имеется узкая светлоокрашенная полоса больной ткани;
4 - темные некротические поражения более 3,0 мм, листья с серо-зелеными некротизированными
краями;
5 - семядольные листья усыхают полностью.
По данной шкале: 0 - растение устойчивое, 1-2 балла - растение средне устойчивое, 3-5 баллов -растение восприимчивое.
Суспензию, состоящую из конидий и фрагментов мицелия гриба А. brassicicola, готовят следующим образом. Гриб предварительно выращивают на агаризованной среде Чапека в течение 14 дней при температуре 20-22 оС. Стерильной водой проводят смыв конидий и фрагментов мицелия гриба с поверхности среды в чашках Петри. Суспензию взбалтывают, подсчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл с помощью камеры Горяева. При необходимости проводят разведение таким образом, чтобы в каждом из маленьких квадратов камеры находилось 22-25 или в каждом большом 36-40 конидий и фрагментов мицелия. Для инокулирования семядолей используют только свежеприготовленную суспензию конидий и фрагментов мицелия гриба А. brassicicola.
С целью оценки растений горчицы сарептской на устойчивость к болезни в камере искусственного климата или полевых условиях необходимо определить оптимальную фазу вегетации, в которую следует проводить инокулирование. В этом случае критериями поражения болезнью служат инкубационный период при инокулировании в определенной фазе, количество пораженных растений и развитие болезни на них.
Относительно зависимости длительности инкубационного периода альтернариоза горчицы сарепт-ской и развития болезни от фазы развития растений, в которую происходит заражение, имеющиеся сведения носят ограниченный характер [3, 6].
Для решения этого вопроса в условиях камеры искусственного климата нами проведено единовременное искусственное заражение растений горчицы сарептской в разные фазы вегетации (розетка, стеблевание, цветение, зеленый стручок, желто-зеленый стручок) возбудителем альтернариоза А. brassicicola и в регулируемых условиях изучено влияние заражения растений альтернариозом на длительность инкубационного периода и развитие болезни (рис. 3).
а)
б)
в) г)
Рисунок 3 - Фазы развития растений горчицы сарептской при искусственном инфицировании в камере искусственного климата (ориг.):
а) розетка, б) стеблевание, в) цветение, г) желто-зеленый стручок.
Растения горчицы сарептской изолировали на все время исследований. Влажность воздуха внутри изоляторов поддерживалась на уровне 90-92 % ежедневным опрыскиванием растений водой, а также помещением в изоляторы влажной ваты. Изолированные растения горчицы сарептской всех фаз развития одновременно инокулировали суспензией спор и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с титром 1,0-107 КОЕ/мл (табл. 2). Среднесуточная температура воздуха и длительность светового дня в камере искусственного климата составляли 22 оС и 16 ч соответственно.
Таблица 2 - Восприимчивость горчицы сарептской к альтернариозу при инокулировании грибом Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts. в разные фазы развития растений (камера искусственного климата), сорт Росинка
_______________________________________ВНИИМК, 2004-2006 гг._____________________
Фаза вегетации растений в момент инокулирования Инкубационный период, сут. Количество пораженных растений, % Развитие болезни, %
Розетка 0 0 0
Стеблевание 10 64,0 15,7
Цветение 7 100 56,1
Зеленый стручок 4 100 51,2
Желто'-зеленый стручок 2 100 64,7
Из данных, представленных в таблице 2, следует, что наименьший инкубационный период альтерна-риоза отмечен в фазе желто-зеленого стручка, - 2-е суток. Количество пораженных растений и развитие болезни в этой фазе было максимальным - 100 и 64,7 % соответственно. При инокулировании растений патогеном в фазе стеблевания потребовалось 10 дней для проявления первых признаков альтернариоза. Количество пораженных растений и развитие болезни составило 64,0 и 15,7 % соответственно.
Следовательно, при оптимальных условиях для развития гриба А. Ьт&^1асо1а растения горчицы сарептской в условиях камеры искусственного климата наиболее восприимчивы к альтернариозу в фазе желтозеленого стручка.
Перед нами стояла задача проверить восприимчивость горчицы сарептской к альтернариозу при искусственном заражении растений в полевых условиях. Растения также изолировали на все время проведения исследований. Под один изолятор помещали два рядом растущих растения. Внешний вид изолятора из спан-бонда (материал для парников) представлен на рисунке 4.
Инокулирование растений горчицы сарептской суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба А. Ьга^^1С1со1а проводили в вечерние часы в безветренную погоду. Учеты проводили ежедневно в течение 14 дней.
Среднесуточная температура воздуха за время проведения опыта составляла 14,6-24,6 оС. Заражение растений альтернариозом отмечено в диапазоне температур от 17,5 до 24,6 оС.
Как в условиях камеры искусственного климата, так и в полевых условиях при искусственном заражении растения горчицы сарептской обладают разной степенью восприимчивости к альтернариозу в зависимости от фазы развития в момент инокуляции возбудителем болезни.
І?я, '$ ?
щ щ
■ ж, 1 чш
**> 1 > А ш/ш. " 1 к, •* яіЗи
Рисунок 4 - Изолятор на растениях горчицы сарептской (ориг.)
Восприимчивость растений горчицы сарептской к болезни повышается по мере их роста и развития (табл. 3).
Таблица 3 - Восприимчивость горчицы сарептской к альтернариозу при инокулировании грибом Alternaria brassicicola (Schw.) Wilts. в разные фазы развития растений (полевые условия), сорт Росинка
__________________________________ВНИИМК, 2004-2006 гг.______________________
Фаза вегетации растений в момент инокулирования Инкубационный период, сут. Количество пораженныхо растений, % Развитие болезни, %
Розетка O O O
Стеблевание 11 54,O 13,2
Цветение 8 1OO 54,1
Зеленый стручок 4 1OO 47,9
Желто-зеленый стручок 2 1OO 63,4
При инокулировании растений суспензией спор патогена в фазе розетки признаков болезни не отмечено. С начала стеблевания до желто-зеленого стручка происходит увеличение количества пораженных растений и развития болезни, достигая в фазе желто-зеленого стручка 100 и 63,4 % соответственно. Инкубационный период альтернариоза при заражении растений в этой фазе составил 2-е суток. При инокулировании растений горчицы сарептской в фазе зеленого стручка альтернариоз получает развитие на 4,0-7,0 % ниже, чем в фазе цветения. Одним из объяснений этого факта может являться физиологическая устойчивость тканей зеленых стручков горчицы.
Следовательно, при старении ткани растения горчицы сарептской (фаза желто-зеленого стручка) более подвержены проникновению возбудителя альтернариоза внутрь клеток.
На основании вышеизложенных данных нами адаптирован метод искусственного заражения растений возбудителями болезней Б. В. Квасникова [1] для инфицирования горчицы сарептской возбудителем альтернариоза с целью оценки селекционного материала на устойчивость к болезни в камере искусственного климата и полевых условиях. Суть его заключается в следующем: инокулируют 20 растений без внешних признаков поражения болезнями суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба А. Ьга^^1С1со1а с титром 1,0^ 107 КОЕ/мл в наиболее уязвимой для них фазе развития - желто-зеленый стручок - с помощью пульверизатора. Расход суспензии - 5 мл/раст. Растения поливают, накрывают изоляторами из спанбонда, помещают внутрь мокрую вату. После первых суток дополнительно опрыскивают растения стерильной водой и смачивают вату. Через 2 суток проводят учет поражения растений возбудителем болезни.
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009
Выводы: 1. При первичной оценке селекционного материала горчицы сарептской на устойчивость к альтернариозу проростки следует инокулировать суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassi-cicola с титром 1,0-107 КОЕ/мл в условиях влажной камеры без повреждения поверхности семядольных листьев в течение суток при температуре 20-22 оС.
2. С целью оценки сортообразцов горчицы сарептской на устойчивость к болезни в камере искусственного климата и полевых условиях растения инокулируют суспензией конидий и фрагментов мицелия гриба A. brassicicola с титром 1,0-107 КОЕ/мл в фазе желто-зеленого стручка.
Литература
1. Квасников, Б. В. Методы фитопатологических и энтомологических исследований в селекции растений / Б. В. Квасников, Е. Д. Черемсина, Н. М. Маслова. - М.: Колос, 1977. - С. 174-176.
2. Ghorbani, R. Evaluation of Alternaria alternate for biological control of Amaranthus retroflexus /
R. Ghorbani, W. Seel, A. Litterick, C. Leifert // Weed Sci. - 2000. - V. 48. - № 4. - P. 474-480.
3. Grontoft, M. Resistens mot Svartflacksjucka (Alternaria spp.) i oljevaxter / M. Grontoft // Sveriges Utsa-desforenings Tidskrift. - 1986. - № 96. - 263 р.
4. Delwiche, P.A. Aspects of blackleg (Leptosphaeria masculans) resistance in rapeseed (Brassicae napus) / P.A. Delwiche // Ph. D. thesis. Wisconsin, USA : University of Wisconsin - Madison, 1980. - Р. 78-80.
5. Ram, B. Effect of artificial inoculation of Alternaria triticina on yield components of wheat / B. Ram,
L.M. Joshi // Z. Pflanzenkrankh. und Pflanzenschutz. - 1979. - V. 86. - № 12. - P. 741-744.
6. Tewari, J. P. Relationship between epicuticular wax and blackspot caused by Alternaria brassicae in three lines of rapeseed / J. P. Tewari, W. P. Skoropad // Canadian Journal of Plant Science. - 1976. - № 56. - Р. 781-785.
