CC BY
304
2005
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА.
Сер. 3. Вып. 1
ИЗ ИСТОРИИ НАУКИ
УДК 577.3
3. И, Крутецкая, А. Д. Ноздрачев
ИОННАЯ ТЕОРИЯ НЕРВНОГО ИМПУЛЬСА
(К 50-летию создания модели Ходжкина-Хаксли и 40-летию Нобелевской премии по физиологии и медицине 1963 г.)
Нобелевская премия по физиологии и медицине 1963 г. «За открытия, касающиеся ионных механизмов, участвующих в возбуждении и торможении в периферическом и центральном участках мембраны нервной клетки».
Алан Ходжкин Эндрю Хаксли Джон дкклс
Электрическое происхождение нервных импульсов было установлено в экспериментах Луиджи Гальвани в конце XVIII в. Основоположник мембранной теории биопотенциалов Юлиус Бернштейн в начале XX в. (1902, 1912) предположил, что нестимулирован-ные нервные клетки имеют Потенциал покоя (разность электрических потенциалов между внутренней и наружной поверхностями мембраны в состоянии физиологического покоя клетки), который обусловлен неравномерным распределением ионов между цитоплазмой клеток и окружающей средой [2]. Концентрация ионов К+ внутри клеток в 20-40 раз превышает их содержание в,межклеточной жидкости. Напротив, концентрация ионов Ыа+ в межклеточной жидкости в 10-20 раз выше, чем внутри клеток. В состоянии покоя клеточная мембрана проницаема преимущественно для ионов К+. Ионы К+ диффундируют по концентрационному градиенту через клеточную мембрану в межклеточную жидкость; анионы не могут проникать через мембрану и остаются на ее внутренней поверхности.
© 3. И. Крутецкая, А. Д. Ноздрачев, 2005
Так как ионы К+ имеют положительный заряд, а анионы; остающиеся на внутренней поверхности мембраны, — отрицательный, то наружная поверхность мембраны при этом заряжается положительно, а внутренняя — отрицательно. Потенциал покоя у разных клеток имеет величину от -50 до -100 мВ.
Бернштейн рассматривал потенциал действия, возникающий при возбуждении клеток, как «отрицательное колебание» потенциала покоя. Он полагал, что при возбуждении мембрана утрачивает свою избирательную проницаемость для ионов К+ и становится проницаемой для всех ионов. Ионные градиенты вследствие этого исчезают, разность потенциалов, имевшая место в покое, быстро выравнивается и потенциал покоя уменьшается до нуля. Последующее восстановление исходной ионной проницаемости приводит к возвращению мембранного потенциала к уровню потенциала покоя. Таким образом, согласно теории Бернштейна, потенциал действия не может быть больше потенциала покоя.
В 1939 г. Алан Ходжкин и Эндрю Хаксли из Кембриджского университета использовали для проверки теории Бернштейна гигантские аксоны кальмара, достигающие 1 мм в диаметре (рис. 1). Введя внутрь аксона тонкий металлический электрод, ученые показали, что при возникновении нервного импульса происходит не просто исчезновение потенциала покоя, как это предполагал Бернштейн, но создается новая разность потенциалов противоположного знака. При этом превышение потенциала действия над величиной потенциала покоя, так называемый «овершут», составляет более 40 мВ [5]. «К нашему удивлению, было обнаружено, что потенциал действия часто оказывался значительно. больше, чем потенциал покоя», — сообщил позднее Ходжкин [4, с. 36]. При возникновении потенциала действия вместо ожидаемой разности потенциалов в 60 мВ Ходжкин и Хаксли зарегистрировали разность потеньщалов в 90 мВ или более, что указывало на временное появление большего положительного заряда на внутренней поверхности аксо-нальной мембраны по отношению к наружной. •.
Результаты исследований Ходжкина и Хаксли опровергли теорию Бернштейна, показав, что потенциал действия не может быть вызван диффузией только ионов К+: в этот процесс должен быть вовлечен и другой ион, чтобы потенциал действия превышал обусловленный ионом К+ потенциал покоя. Из различных ионов, которые Ходжкин и Хаксли, рассматривали на эту роль, наиболее вероятным им представлялся ион Согласно натриевой гипотезе, вначале клеточная мембрана становится более проницаемой для ионов Иа+, чем для ионов К\ что достигается посредством открывания потенциал-зависи-мых Ыа+-каналов. Когда Ыа+-каналы открыты, ионы 1Ма+ диффундируют по градиенту
■Ш:
Рис. I. Кальмар ЬоПдо.
0 12-345 Время после начала стимула, мс
Рис. 2. Регистрация ионных токов с помощью метода фиксации потенциала (voltage clamp). А: фиксация потенциала на гигантском аксоне кальмара; i — электрод для. измерения мембранного потенциала, соединенный со входом предварительного усилителя A; v — раздражающий электрод; Аи — усилитель обратной, связи, осуществляющий фиксацию потенциала на мембране аксона на уровне, соответствующем потенциалу, приложенному к одному из входов усилителя; с — электрод, подключенный к наружной поверхности мембраны аксона кальмара; Vm — мембранный потенциал. Б: 1„ — суммарный ионныйЧок при деполяризации мембраны от потенциала -65 мВ до -9мВ; Vm— мембранный потенциал; /Na — натриевый ток. /к — калиевый ток; /Na сначала возрастает (активируется), а затем убывает (инактивируется). /к- увеличивается с некоторой задержкой при ступенчатой деполяризации мембраны. В: в №+-канале выделяют воротные - структуры двух типов: активационные m-ворота и инактивационные /изорота.
концентрации внутрь клетки, что приводит к уменьшению мембранного потенциала (деполяризации мембраны). Интенсивность же потока ионов К+, направленного из клетки наружу, в первые моменты возбуждения остается прежней. Усиленный поток положительно заряженных ионов Na+ внутрь клетки вызывает вначале исчезновение избыточного отрицательного заряда на внутренней поверхности мембраны, а затем приводит к перезарядке мембраны. «Простое следствие натриевой гипотезы заключается в том, что величина потенциала действия определяется концентрацией ионов Na+ во внеклеточной жидкости», — сказал Ходжкин [1, с. 51]. Совместно с Бернардом Катцем он провел первые эксперименты для проверки этого предположения в 1947 г. и доказал, что потенциал действия — но не потенциал покоя — изменяется в зависимости от концентрации ионов Na+ во внеклеточном пространстве [8].
Для дальнейшего изучения ионных механизмов нервного импульса Ходжкин и Хаксли в 1949 г. применили новый метод фиксац^и.потенциала (voltage clamp method) на мембране гигантского аксона кальмара [6]. Сущность метода состоит в измерении токов, протекающих через клеточную мембрану в условиях, когда мембранный потенциал автоматически (при помощи усилителя с обратной связью) поддерживается на любом заданном уровне (рис. 2, А). Данные, полученные с использованием метода фиксации потенциала, позволили авторам произвести количественное описание ионных токов через мембрану и тем самым сформулировать математическую теорию нервного импульса. Хаксли
Время, мс
Рис. 3. Фазы потенциала действия в гигантском аксоне кальмара.
проделал многочисленные расчеты на ручном арифмометре; позднее более сложные и точные расчеты были получены при помоги первых цифровых вычислительных машин (компьютеров).
Согласно модели, которую Ходжкин и Хаксли описали в цикле классических статей в 1952 г. [7], в мембране гигантского аксона существуют два пространственно и функционально независимых механизма транспорта ионов — потенциал-зависимые Ыа+- и К+-каналы. Потенциал действия возникает при деполяризации мембраны до некоего порогового "уровня .(рис. 3, 4).
Деполяризация открывает Ыа+-каналы, ионы Ыа+ диффундируют по градиенту концентрации внутрь аксона, и внутренняя поверхность мембраны на короткое время становится заряженной положительно. Поступление ионов Ыа+ в клетку продолжается до тех пор, пока внутренняя поверхность мембраны не приобретет положительный заряд, достаточный для уравновешивания градиента концентрации Иа+ и прекращения его дальнейшей диффузии внутрь клетки. Описанные процессы изменения проницаемости мембраны для ионов характерны для первой фазы потенциала действия — фазы деполяризации.
По данным Ходжкина и Хаксли, отношение коэффициентов проницаемости мембраны аксона кальмара для различных ионов в это время составляет: Рк*:Р№*:РС|-= 1:20:0,45. Если сравнить его с аналогичным соотношением в состоянии покоя Рк*:РЫа+:РсГ= 1:0,04:0,45, то видно, что для К+ и С1" в первой фазе возбуждения проницаемость не изменилась, а для она увеличилась в 500 раз. Период, в течение которого проницаемость мембраны для Ыа+ при возбуждении клетки возрастает, является небольшим (0,5-1 мс). Вслед за этим происходит открывание потенциал-зависимых К+-каналов и повышение проницаемости мембраны для К+. Увеличение потока К+, направленного из клетки наружу, приводит к уменьшению мембранного потенциала, что, в свою очередь, обусловливает уменьшение проницаемости мембраны для Ыа+ и инактивацию Ыа+-каналов. Таким образом, второй этап возбуждения характеризуется тем; что поток К+ из клетки наружу возрастает, а встречный поток уменьшается. Это продолжается до тех пор, пока не произойдет
+30 мВ -
-90 мВ Ь
Ыа+ К+ Гиперполяризация
Рис. 4. Потенциал действия (ПД) в гигантском аксоне кальмара. Генерация ПД вклкУчает несколько стадий: Г) при стимуляции аксона происходит открывание №+-каналов и деполяризация мембраны от -70 мВ до -55 мВ; 2) при достижении критического уровня деполяризации мембраны происходит открывание большего числа Ма+-каналов и вход Ка+ в клетку. Это приводит к деполяризации мембраны до +30 мВ. Восходящая фаза ПД называется фазой деполяризации; 3) далее происходит инактивация №+-каналов и активация К+-каналов; 4) выход К+ из клетки приводит к реполяризации мембраны и возвращению мембранного потенциала к уровню потенциала покоя; 5) мембранный потенциал часто превышает уровень потенциала покоя и достигает -90 мВ. Эта фаза носит название фазы гиперполяризации; 6) далее благодаря активности Ыа+/К+-насосов происходит возвращение мембранного потенциала к уровню потенциала покоя.
восстановление потенциала покоя — реполяризация мембраны. После этого проницаемость мембраны для К+ также падает до исходной величины. Наружная поверхность мембраны за счет вышедших в среду положительно заряженных ионов К* опять приобретает положительный потенциал по отношению к внутренней. Эта фаза, в течение которой мембранный потенциал возвращается до уровня потенциала покоя, называется фазой реполяризации. В некоторых случаях проницаемость мембраны, для и К+ после окончания возбуждения остается повышенной. Если скорость уменьшения проницаемости мембраны для Ыа+ в фазе реполяризации замедляется, то возникает отрицательный следовой потенциал.
Положительный следовой потенциал выражается в гиперполяризации (увеличении отрицательного значения мембранного потенциала) мембраны и обусловлен тем, что проницаемость мембраны для К+ в восстановительный период некоторое время'остается повышенной. В периоды'покоя концентрационные градиенты К+ и №+ восстанавливаются в результате работы Ыа+-К+-АТФазы, обеспечивающей активный перенос этих ионов против градиента концентрации (См. рис. 4).
Таким образом,' формирование потенциала действия обусловлено двумя ионными потоками.через мембрану: поток ионов Ыа+ внутрь клетки приводит к перезарядке мембраны, а противоположно направленный поток ионов К+ обусловливает восстановление ис-
Рис. 5. Потенциал-зависимый №+-канал. ' А — топология в мембране порообразующей а-субъединицы и вспомогательной /2-субъединицы. • а-субъединица включает 4 гомологичных домена (I-IV). Цитоплазматический фрагмент между, доменами III и IV участвует в образовании инактивационных /г-ворот. Р — сегменты, образующие пору Ыа+-канала. Б — профиль №+-канал* в мембране. Показаны активационные Ы) и инактивационные (h) ворота. В — все четыре домена (I-IV) участвуют .в образовании поры. ..
ходного потенциала покоя. Потоки приблизительно равны по величине, но сдвинуты во" времени. Благодаря этому сдвигу во времени и возможно появление потенциала действия. Если бы потоки Nat и К+ через Мембрану совпадали во времени, то они бы компенсирова-' ли друг друга и никакого изменения мембранного потенциала не могло бы происходить.'
С помощью метода фиксации потенциала ;на мембране Ходжкин и Хаксли показали,' что суммарный ионный ток, текущий-через мембрану гигантского аксона кальмара после ступенчатой деполяризации, состоит из трех компонентов: быстрого натриевого тока, задержанного калиевого тока'и постоянного* во времени небольшого тока утечки (рис. 2, Б). Сложная кинетика натриевого и калиевого токов при "сдвигах мембранного потенциала определяется специфическими изменениями ионной проницаемости мембраны. Третий компонент ионного тока, неспецифический ток утечки, практически не меняется й в первом приближении пропорционален сдвигу мембранного потенциала. Натриевый и ка: лиевый токи развиваются независимо. С помощью специальных приемов можно разделить суммарную кривую ионного тока на компоненты и охарактеризовать свойства Na+- и К+-каналов. Так, при замене в среде ионов Na+ на непроникающие катионы холина натриевый ток практически исчезает, и регистрируется только выходящий калиевый ток! При добавлении'специфических блокаторов Na+* и К+-каналов подавляется натриевый ток (тетродотоксином) или блокируется калиевый ток (тетраэтиламмонием).
«За открытия, касающиеся ионных механизмов возбуждения и торможения в периферических и центральных участках мембраны нервных клеток» А. Ходжкин и Э. Хаксли получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1963 г. Они разделили, ее с Джоном Экклсом, который изучал механизмы транспорта различных ионов в возбуждающих и тормозных синапсах. В своей речи на церемонии награждения исследователь из
Каролинского института Рагнар Гранит сказал, обращаясь к лауреатам: «Ионная теория нервного импульса Ходжкина и Хаксли содержит, принципы, применимые также и к импульсам в мышцах, включая электрокардиографию, что имеет клиническое значение... Установив единую природу электрических процессов, протекающих в периферической и центральной нервной системе, вы внесли такую ясность в наши представления о деятельности нервных структур, до которой наши современники не мечтали дожить». Открытие Ходжкина-Хаксли, заявил Гранит, «является вехой на пути к пониманию природы возбудимости» [10, с. 556].
Уравнения Ходжкина-Хаксли были использованы для описания различных характеристик процесса возбуждения в аксоне кальмара. С их помощью теоретически рассчитаны амплитуды потенциалов действия, скорость их распространения, влияние температуры на распространяющийся потенциал действия. Результаты теоретических расчетов хорошо согласовывались с данными экспериментов.
Следует отметить, что Ходжкин и Хаксли отнюдь не считали предложенные ими уравнения, окончательными. Они подчеркивали, что эти уравнения описывают только быстрые явления, разыгрывающиеся в мембране во время и непосредственно вслед за потенциалом действия, но не адекватны для анализа изменений проницаемостей и потенциалов, длящихся секунды и минуты. «Ходжкин и я, — указывал в своей Нобелевской речи Хаксли, — считаем, что эти уравнения должны рассматриваться как первое приближение, которое во многих отношениях нуждается в уточнении и развитии в процессе поисков действительного механизма изменений ионной проницаемости на молекулярном уровне» [9, с. 69].
Модель Ходжкина-Хаксли с небольшими модификациями была использована для описания свойств воротных механизмов потенциал-зависимых ионных каналов многих возбудимых образований (К+- и Са2+-каналов соматической мембраны нейронов моллюсков, ионных каналов мембраны перехвата Ранвье и т.д.).
' Модель нервного импульса А. Ходжкина и Э. Хаксли — одно из крупнейших достижений физиологии и всей современной науки, служащее примером удивительного соответствия экспериментальных данных теории. Невозможно переоценить важность этой модели для физиологии и биофизики и, в частности, для изучения мембранных механизмов нервных процессов.
Теория Ходжкина и Хаксли является фундаментальной основой современных представлений о мембранных процессах, происходящих при возбуждении. Именно Ходжкин и Хаксли ввели понятие потенциал-зависимого ионного канала. Классические работы Ходжкина и Хаксли послужили отправной точкой для последующего бурного развития исследований структурно-функциональной организации и механизмов регуляции ионных каналов различных типов клеток.
Использование в последнее время широкого арсенала методов биофизики, биохимии, физиологии и молекулярной биологии позволило установить структурно-фуцкциональ- ' ную организацию потенциал-зависимых Na+- и К+-каналов и выявить структурные элементы, обеспечивающие основные функции каналов: активацию, инактивацию, селективность, взаимодействие с фармакологическими "агентами [3]. На рис. 5, А представлена топология в мембране субъединиц потенциал-зависимого №+-канала. Порообразующая а-субъедини-ца канала состоит из 4 повторяющихся доменов (I—IV), содержащих шесть трансмембранных сегментов (1-6J. Пять сегментов гидрофобны, а сегмент 4 несет большое число положительно заряженных аминокислот и выполняет функцию сенсора напряжения. Внутриклеточный фрагмент между доменами III и IV участвует в образовании инактивацион-ных Л-ворот. В образовании поры принимают участие сегменты 5,6 и соединяющие их
фрагменты (Р-участки) всех четырех доменов а-субъединицы Ыа+-каналов. Summary
Z. I. Krutetskaya, A. D. Nozdrachev. Ionic theory of nerve impulse.
It has taken three centuries to clarify the nature of the nerve impulse until the final answer provided by the Hodgkin-Huxley model for action potential generation in the squid giant axon. Hodgkin and Huxley carried out an impressive series of studies which led in 1952 to a model for nerve impulse generation and propagation that is still a reference scheme for membrane physiology. This model was successful on both phenomenological and mechanistic grounds, in that it explained nervous excitation and conduction on the basis of mechanisms that have been largely supported by subsequent research. Hodgkin and Huxley cleverly combined the voltage-ciamp technique, manipulations of ionic concentrations and quantitative modeling to demonstrate that spike generation is nonlinear phenomenon arising from voltage-dependent ionic currents that activate and inactivate in time. The model was formulated in a series of equations that 50 years ago were an elegant instance of mathematical modeling in biology, and that still remain a strong impact on modern membrane biophysics. This article deals with the ionic mechanisms of the action potential and the history of Hodgkin-Huxley model formulation.
Литопатопя ■----* "—'J f"
1. Ходжкин А. Нервный импульс / / M., 1965. 2. Bernstein J. Untersuchungen zur thermodynamik der bioelektrischen strome I / / Pflugers Archiv. 1902. Vol. 92. P. 521-562. 3. Catterall W. A. From ionic currents to molecular mechanisms: the structure and function of voltage-gated sodium channels / / Neuron. 2000. Vol. 26. P. 13-25. 4. Hodgkin A. L. The ionic basis of nervous conduction // Nobel lectures. Elsevier. 1964. P. 32-51. 5. Hodgkin A L., Huxley A. F. Action potentials recorded frbrri inside a nerve fibre // Nature. 1939. Vol. 144. P. 710-711. 6. Hodgkin A. L., Huxley A. FKatz B. Ionic currents underlying activity in the giant axon of the squid / / Arch. Sci. Physiol. 1949. Vol. 3. P. 129-160. 7. Hodgkin A. L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve //J. Physiol. 1952. Vol. 117. P. 500-544. 8. Hodgkin A. L., Katz B. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid / / J. Physiol. 1949. Vol. 108. P. 37-77-. 9. Huxley A. F. The quantitative analysis of excitation and conduction in nerve / / Nobel lectures. Ejsevier, 1964. P. 52-69. 10. Huxley A. F. From overshoot to.voltage clamp / / Trends Neurosci. 2002. Vol. 25. P. 553-558. 11. Huxley A. F. Hodgkin and action potential 1935-1952 // J. Physiol:2002. Vol". 538.l.P. 2.
Статья поступила в редакцию' 17 октября 2004 г.
