CC BY
57
УДК 616.248—07:575.113
ИНТРОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ rs324011 ГЕНА БЕЛКА STAT6 У ПАЦИЕНТОВ С РАЗЛИЧНОЙ ТЯЖЕСТЬЮ ТЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ
Валерий Николаевич Минеев, Лада Николаевна Сорокина, Михаил Александрович Нёма, Михаил Владимирович Дубина, Елена Дмитриевна Янчина
Кафедра госпитальной терапии (зав. — проф. В.И. Трофимов), отдел молекулярно-генетических технологий НИЦ (зав. — чл.-корр. РАН М.В. Дубина) Санкт-Петербургского государственного медицинского университета, e-mail: [email protected]
Реферат
Выявлена связь полиморфного варианта rs324011 гена белка STAT6 с тяжестью течения бронхиальной астмы, причем наличие в генотипе данного полиморфизма обладает, по-видимому, протективным эффектом в отношении тяжести заболевания.
Ключевые слова: полиморфизм rs324011, STAT6, бронхиальная астма.
Бронхиальная астма (БА) относится к полигенным заболеваниям. К настоящему времени опубликованы результаты исследований ассоциаций БА и других атопических заболеваний примерно с 80 генами-кандидатами [5]. Полагают, что исследование гена белка STAT6 представляет собой одно из перспективных направлений в изучении генов-кандидатов при БА [10]. Речь идет о белке STAT6 системы JAK-STAT (Janus Kinases — Signal Transducer and Activator of Transcription) — сигнальной системы, реализующей цито-киновую сигнализацию при БА и других аллергических заболеваниях. К настоящему времени имеются данные литературы [1—3], которые позволяют предполагать, что белок STAT6 играет ключевую роль в развитии аллергической БА и может представлять большой интерес как мишень для воздействия на патогенез аллергических реакций [7]. Однако к настоящему времени остается много невыясненного в особенностях функционирования STAT6 при БА, в том числе возможная роль полиморфизма гена этого белка в развитии полигенного заболевания. Белок STAT6 активирует транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку клетки в сторону лимфоцитов ^2 типа. Для гена, кодирующего этот белок, был найден ряд полиморфных вариантов (SNP), которые, возможно, влияют на активность элементов данной сигнальной системы [9]. Од-12
нако при более детальном анализе лишь немногие полиморфизмы показали связь с фенотипами БА [14]. В частности, в немецкой популяции для варианта rs324011 гена STAT6 была обнаружена значимая связь с уровнями сывороточного IgE [14]. Данный полиморфизм заключается в замене цитозина на тимин (С6613Т) во 2-м интроне, и таким образом эта замена не сказывается на кодировании аминокислоты и не должна отражаться на первичной структуре белка.
Подчеркнем, что исследований, касающихся полиморфизма гена белка STAT6 при БА в мировой литературе крайне мало [4].
Целью нашей работы было оценка связи полиморфного варианта rs324011 гена белка STAT6 с фенотипами БА, характеризующими тяжесть заболевания в славянской популяции Санкт-Петербурга.
Были обследованы 67 больных БА славянской популяции Санкт-Петербурга, не связанных узами родства и находившихся в клинике в связи с обострением БА (смешанный клинико-патогенетический вариант с преобладанием аллергического) различной тяжести течения. Для идентификации полиморфного варианта rs324011 гена была использована полимеразная цепная реакция с ДНК, выделенной из клеток периферической крови, последующей рестрикцией и анализом количества и длины получившихся отрезков ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Праймеры для фрагмента 2 интрона гена STAT6 были разработаны на основе известной последовательности 12-й хромосомы AC018673 (GenBank). Продукт амплификации размером 216 нуклеотидов обрабатывался эндонуклеазой Ava II (Есо47!, Fermentas).
STAT6 аллель С
Avail Avail
L
121 и.о. 27 68 п.о.
STAT6 аллель Т
Avail
г
121 п.о. 95 п.о.
Рис. 1. Идентификация замены С/Т (rs324011) в гене STAT6.
В результате у носителей аллеля С ампли-фикат расщеплялся на 3 фрагмента длиной 121, 27 и 68 нуклеотидов, у носителей аллеля Т — на 2 фрагмента 121 и 95 нуклеотидов (рис. 1).
ПЦР проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для ПЦР (67 мМ Tris-Ha (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100), 2,5 мM MgC4l2, 2040 мкМ dNTP, по 50 пмоль каждого праймера, 1u Taq ДНК полимеразы и 1 мкг геномной ДНК. Термоциклирование выполняли в следующем температурном режиме: предварительная денатурация — 5 мин 94°С; 30 циклов: денатурация —
1 мин 94°С, отжиг праймеров — 1 мин 58°С, синтез — 1 мин 72°С; досинтез — 5 мин 72°С.
Продукт амплификации размером 216 нуклеотидов обрабатывался 1u эндонуклеазой Ava II (Есо47Т Fermentas) в однократном буфере R+ (1 мМ Tris-HCl pH 8,5,
1 мM MgCl2, 10мM KCl) при 37°С в течение 24 часов. Продукты рестрикционного анализа разделяли в 8% ПААГ.
Аллель С гена STAT6 содержит сайт рестрикции, в этом случае на электрофо-реграмме присутствуют фрагменты размером 27 и 68 нуклеотидов. При наличии аллеля Т данный сайт пропадает. Кроме того, полученный фрагмент (216 нуклеотидов) содержит постоянный сайт рестрикции для эндонуклеазы AvaII, и после реакции наблюдается фрагмент размером 121 нуклеотид. Схема рестрикции представлена на рис. 1.
Распределение больных БА по генотипам и тяжести заболевания показано на рис. 2.
Как видно из рис. 2, среди гомозигот по тимину (ТТ) не было ни одного больного с тяжелым течением и меньше всего с течением средней тяжести. Большинство пациентов со среднетяжелым и тяжёлым
Рис. 2. Распределение генотипов в зависимости от тяжести БА.
течением БА были гетерозиготами (СТ). У больных с легким течением БА распределение по гомозиготности и гетерозигот-ности было примерно одинаковым.
На рис. 3 представлена частота встречаемости аллеля Т в зависимости от тяжести БА. Из рис. 3 хорошо видно, что полиморфизм гс324011 у больных со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания встречался реже, чем у больных с легкой формой БА.
Тяжелое
течение
Средней
тяжести
Легкое
течение
< 1 1 1 i
1 0,4 U
0,46 [I
0,56
У
0 0,1 ог 0.3 0.4 0,5 0
о;
Частота встречаемости Рис. 3. Частота встречаемости аллеля Т в зависимости от тяжести течения БА.
Таким образом, можно предположить, что наличие полиморфизма гена белка STAT6 C6613T предрасполагает к более легкому течению БА.
Нами проведен корреляционный анализ частоты встречаемости аллеля Т и ряда показателей, характеризующих некоторые патогенетические механизмы БА (табл. 1).
Как видно из табл. 1, частота встречаемости аллеля Т (р=0,005) положительно коррелирует с содержанием моноцитов в мокроте. С тем же положительным знаком выявлена корреляция частоты встречаемости аллеля Т с макрофагами в смыве из бронхов.
Отметим, что выявлена отрицательная корреляция (хотя и статистически недостоверная) частоты встречаемости аллеля Т с такими показателями, характеризующими патогенетические механизмы,
Таблищ 1
Значения коэффициента корреляции Спирмена (г) аллеля Т с некоторыми клинико-лабораторными
показателями у больных БА
как количество эозинофилов и лимфоцитов в смыве из бронхов. Подобная корреляция может отражать тот факт, что аллель Т встречался у тех больных БА, у которых локальный воспалительный процесс (на уровне бронхов) выражен в меньшей степени.
Любопытно, что корреляция (хотя и невыраженная) частоты встречаемости аллеля Т и тяжести БА у обследованных имеет отрицательный знак. Более выраженная связь выявлена с уровнем кортизола (функция коры надпочечников), и обратный ее характер достаточно прямо также отражает определенную закономерность — присутствие аллеля Т в генотипе чаще выявляется у больных БА, страдающих заболеванием с менее выраженной тяжестью течения.
И еще один вывод, вытекающий из анализа таблицы, — это отсутствие во всей обследованной группе больных БА корреляции частоты встречаемости аллеля Т со скоростными показателями функции внешнего дыхания (ОФВ1), в частности с индексом Тиффно. Этот же вывод можно сделать и при отдельном анализе в группе больных БА с гомозиготным вариантом генотипа (ТТ) — значение коэффициента корреляции г=0,104 (Спирмен), р=0,791 (п=9). Вместе с тем при таком же отдельном анализе в группе больных БА с 14
гомозиготным вариантом генотипа (СС) выявлена существенная обратная корреляция частоты встречаемости аллеля С со значениями индекса Тиффно (-0,754 по Спирмену, р=0,005, п=12).
С этими данными согласуются результаты отдельного корреляционного анализа частоты аллеля Т в группе больных БА с тяжёлым течением заболевания. Так, установлена существенная прямая корреляция со значениями индекса Тиф-фно (0,642 по Спирмену, р=0,024, п=12). Подчеркнем, что в этой группе больных также выявлена существенная прямая корреляция с содержанием моноцитов в мокроте (г=0,695, р=0,018, п=11).
Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, что наличие полиморфизма С6613Т (^324011) гена белка STAT6, возможно, имеет протектив-ное значение для течения БА, предрасполагая к более легкой форме заболевания.
Обратим внимание на то, что наиболее выраженная и достоверная корреляция аллеля Т выявлена нами с содержанием моноцитов в мокроте. Как известно, моноциты из кровотока закономерно мигрируют в ткани, в частности в легкие. Моноциты входят в так называемую “систему мононуклеарных фагоцитов” [6], клетки которой обеспечивают неспецифическую антибактериальную защиту за счет как своей фагоцитарной функции, так и сек-ретируемых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Велика роль мононуклеарных фагоцитов, в частности в обеспечении преимущественной дифференцировки ТМ-клеток в ТЫ-клет-ки, ответственные за клеточный специфический иммунный ответ, причем нельзя не отметить, что при распознавании антигена ТЫ-лимфоциты отдают четкое предпочтение взаимодействию с макро-фагальными клетками [6].
Участие мононуклеарных фагоцитов в эффекторной фазе специфического иммунного ответа проявляется их мобилизацией в очаг иммунного воспаления и активацией под влиянием лимфоцитарных цитокинов, в частности ШБу. Подчеркнем, что ЮТу ингибирует активацию STAT6 в моноцитах, индуцированную 1Ь4 [8].
Исходя из указанных фактов, можно предположить, что обнаруженная нами
Показатели г п; р
Тяжесть течения БА (легкое, средней тяжести, тяжелое) -0,138 п=67; р=0,266
Кортизол крови, нмоль/л -0,454 п=15; р=0,08
Содержание моноцитов в мокроте, % 0,429 п=42; р=0,005
Содержание макрофагов в смыве из бронхов, % 0,407 п=9; р=0,277
Содержание эозинофилов в мокроте, % -0,038 п=42; р=0,813
Содержание эозинофилов в смыве из бронхов, % -0,535 п=9; р=0,13 8
Содержание лимфоцитов в смыве из бронхов, % -0,327 п=9; р=0,391
ОФВ1 в % от должного -0,007 п=53; р=0,962
Отношение ОФВ1 к ЖЕЛ в % к должному (индекс Тиффно) -0,042 п=53; р=0,767
прямая корреляция между частотой встречаемости аллеля Т и уровнем моноцитов в мокроте может отражать, по-видимому, склонность больных БА с исследуемым полиморфизмом к фенотипическим проявлениям, связанным со сдвигом цитоки-нового профиля в сторону Th1-ответа. Выявленный нами феномен протективного значения для течения БА полиморфизма гена белка STAT6 не является уникальным в отношении белка STAT6, так как аналогичный феномен описан в отношении полиморфизма гена белка STAT1. Так, было показано, что частота встречаемости интронного (интрон 24) полиморфизма С39134А гена белка STAT1 обратно коррелирует с атопическим состоянием, выявляемым с помощью рйс-теста и общего и уровней общего и специфического 1яБ у детей, больных БА и другими аллергическими заболеваниями [11].
Добавим, что протективная роль полиморфизмов целого ряда генов, наряду с их патогенетической ролью, уже установлена при онкологических заболеваниях, сахарном диабете, ИБС и других заболеваниях, включая исследования по распределению ВИЧ-протективных аллелей. Изучаемый полиморфизм находится не в кодирующем районе гена белка STAT6 и, как предполагается [14], может иметь функциональное значение. Полиморфизм локализован в том же районе (интроне 2), где на близком расстоянии обнаружены
2 сайта для транскрипционного фактора №кВ, что может указывать на регулирующую функцию этого района в транскрипции STAT6.
Можно предположить, что при полиморфизме ^324011 нарушается связывание №КВ с соответствующими транскрипционными сайтами. Это тем более важно, что имеются данные, свидетельствующие о том, что транскрипционный фактор №КВ взаимодействует, возможно, синергично, со STAT6 [12, 13]. Следовательно, близкое присутствие двух сайтов для №кВ и гена STAT6 может указывать на то, что, существует механизм обратной отрицательной регуляции между активацией №КВ и STAT6.
Таким образом, нами выявлена связь полиморфного варианта ^324011 гена белка STAT6 с тяжестью течения БА, причем наличие в генотипе данного полиморфиз-
ма, обладает, по-видимому, протективным эффектом в отношении тяжести заболевания. Этот вывод следует учитывать при анализе исследований роли в патогенезе БА такой сигнальной системы, реализующей цитокиновую сигнализацию, как JAK-STAT-система, и прежде всего роли ключевого белка STAT6.
Работа поддержана грантами правительства Санкт-Петербурга 28-04/17 (диплом № ПСП 080591) и грантом для молодых ученых СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова за 2008 год.
ЛИТЕРАТУРА
1. МинеевВ.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о Jak-Stat системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммунной патологии. Часть I. // Аллергология. - 2005. - № 4. - С. 38-44.
2. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Современные представления о Jak-Stat системе как новой сигнальной системе и ее нарушениях при иммунной патологии: механизмы негативной регуляции. Часть II. // Аллергология. - 2006. - № 1. - С. 49-55.
3. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н. Экспрессия STAT6 в лимфоцитах периферической крови больных аллергической бронхиальной астмой // Мед. иммунол. - 2007. -Т.9, № 4-5. - С.405-410.
4. Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Нёма М.А. Полиморфизм гена белка STAT6 и бронхиальная астма. // Казанский мед. ж. - 2009. - № 1. - С. 102-109.
5. Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М., Пузы-рев В.П. Генетика атопии: современное состояние//Вест-ник ВОГиС. - 2006. - Том 10. - № 3. - C. 492-503.
6. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Иммунологические механизмы аллергических реакций. / Общая аллергология. Т.1. Под ред. Г.Б.Федосеева. - СПб.: Нордмед-Издат, 2001. - С.169-381.
7. Chen W, Hershey G. K.K. Signal transducer and activator of transcription signals in allergic disease // J. Allergy Clin. Immunol. - 2007. - Vol.119. - P.529-541.
8. Dickensheets H. L, Venkataraman C, Schindler U, Donnelly R. P. Interferons inhibit activation of STAT6 by interleukin 4 in human monocytes by inducing SOCS-1 gene expression // PNAS USA. - 1999. - Vol. 96. -P. 10800-10805.
9. Duetsch G, Illig T, Loesgen S. et al. STAT6 as an asthma candidate gene: polymorphism-screening, association and haplotype analysis in a Caucasian sib-pair study // Hum. Mol. Genet. - 2002. - Vol. 11, № 6. -P. 613-621.
10. Holgate S.T., Davies D.E, Powell R.M. et al. Local genetic and environmental factors in asthma disease pathogenesis: chronicity and persistence mechanisms // Eur.Respir. J. - 2007. - Vol. 29, № 4. - P.793-803.
11. Pinto L.A., Steudemann L, Depner M. Et al. STAT1 gene variations, IgE regulation and atopy // Allergy. - 2007. -Vol.62, № 12. - P.1456-1461.
12. Shen C.H., Stavnezer J. Interaction of Stat6 and NF-kappaB: direct association and synergistic activation of interleukin-4-induced transcription // Mol. Cell. Biol. — 1998. — Vol.18. — P.3395—3404.
13. Stütz A.M., Woisetschlager M. Functional synergism of STAT6 with either NF- kappa B or PU.1 to mediate IL-4-induced activation of IgE germline gene transcription // J. Immunol. — 1999. — Vol.163. — P. 4383—4391.
14. Weidinger S., Klopp N., Wagenpfeil S. et al. Association of a STAT6 haplotype with elevated serum IgE levels in a population based cohort of white adults // J. Med. Genet. — 2004. — Vol.41. — P.658—663.
Поступила 28.02.09.
INTRON POLYMORPHISM OF THE RS324011 GENE OF STAT6 PROTEIN IN PATIENTS WITH VARYING SEVERITY OF BRONCHIAL ASTHMA
V.N. Mineev, L.N. Sorokina, M.A. Nema, M.V. Dubina, E.D. Yanchina
Summary
Revealed was the relationship of the polymorphic variant of rs324011gene of STAT6 protein with the severity of bronchial asthma course. The presence of this polymorphism in the genotype apparently could induce a protective effect on the severity of the disease.
Key words: polymorphism, rs324011, STAT6, bronchial asthma.
УДК 616.24—002.2—008.8-036.12—085.356:577.152.34.042.2].0I5.2:6i5.33j.032.24—036.8-07
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕРИНАТА В ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
Наиля Исхаковна Кубышева1, Лариса Борисовна Постникова2,
Рамиль Зинурович Миндубаев2, Виктор Владимирович Новиков1
1НИИ молекулярной биологии и региональной экологии (директор — докт. биол. наук В.В. Новиков) Нижегородского государственного университета, 2Городской центр для больных ХОБЛ (руководитель — Л.Б. Постникова), Нижегородская городская больница №28, в-таИ:а1Ьо(и70@таИ.ги
Реферат
Изучена эффективность небулайзерных ингаляций иммуномодулятора дерината у некурящих больных с обострением хронической обструктивной болезни легких II стадии. Установлены достоверное увеличение показателя функции внешнего дыхания — емкости вдоха, снижение уровня молекул адгезии 1САМ-1 и 1САМ-3, метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха и снижение концентрации ИЛ-8 в циркуляции у больных, получавших ингаляционную форму дерината.
Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, иммунитет, оксидативный стресс, деринат.
В последние годы во всем мире наблюдается неуклонный рост распространенности хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и смертности от данного заболевания. Согласно современной концепции патогенеза ХОБЛ, данная патология — это аномальная воспалительная реакция легочной ткани в ответ на воздействие патогенных частиц и газов, результатом которой является частично обратимое ограничение скорости воздушного потока [6]. Ключевая роль в повреждении и ремоделировании бронхолегочной ткани при ХОБЛ принадлежит дисрегуляции системного и местного иммунитета, оксидативного стресса и др. Дисбаланс про- и антиоксидантной 16
систем при ХОБЛ характеризуется повышением выработки активных форм кислорода (АФК), продуктов перекисного окисления, ростом уровня оксида азота и его метаболитов как на общеорганизмен-ном, так и на местном уровнях [5].
Развитие воспалительного процесса при ХОБЛ во многом обусловлено увеличением количества эндобронхиальных нейтрофилов, макрофагов и Т-лимфоци-тов [6]. Этот феномен объясняется усилением рекрутирования клеток в очаг воспаления. Важная роль в реализации данных реакций принадлежит антигенам адгезии и различным хемокинам, в том числе ИЛ-8, патогенетически значимому медиатору ХОБЛ. В исследованиях последних лет продемонстрирован подъем уровня растворимых форм молекул адгезии 1САМ-1, 1САМ-3 и содержания ИЛ-8 у больных с обострением ХОБЛ [3, 4].
Недостаточная эффективность современной терапии требует поиска препаратов, обладающих противовоспалительной активностью. С этих позиций рациональным в лечении обострения ХОБЛ может быть дополнительное применение препаратов, обладающих иммумодулирующим и антиоксидантным действием, что, вероятно, позволит повысить эффективность
