CC BY
173
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 5, с. 107-112
Почвенная микробиология
УДК 631.147:579.64 doi: 10.15389/agrobiology.2014.5.107rus
ИНТРОДУКЦИЯ В ПОЧВУ Bacillus megaterium 501": ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ВЫЖИВАНИЕ, СПОРООБРАЗОВАНИЕ И РАЗЛОЖЕНИЕ ГЕРБИЦИДА ПРОМЕТРИНА
Ю.В. КРУГЛОВ, Т.О. ЛИСИНА
Вопросы интродукции микроорганизмов в почву относятся к фундаментальным основам применения микробных препаратов в земледелии, растениеводстве и экологии. Эффективность интродукции зависит от совокупности многих факторов — вида и штамма микроорганизма, физико-химических свойств почвы, растительного покрова, климата и т.д., которые изучены недостаточно, что обусловливает высокую вариабельность результатов применения микробных препаратов. В настоящей работе впервые исследована динамика роста и спорообразования у интродуци-руемого в дерново-подзолистую почву штамма Bacillus megaterium 501rlf в зависимости от температуры почвы, содержания органического вещества и 2-метилтио-4,6-бис (изопропиламино)-сим-триазина (гербицид прометрин). В лабораторных опытах было установлено, что оптимальные условия для интродукции бактерий складываются при температуре 20 °С: спустя 3 сут после инокуляции титр бактерий в почве возрастал почти на порядок и оставался таким до окончания эксперимента (32 сут). Интродуцированная культура B. megaterium 501rlf в течение всего опыта находилась в форме физиологически активных вегетативных клеток, становясь конкурентоспособным компонентом почвенного микробиома. Дополнительное введение в почву органического вещества в виде соломы зерновых и кукурузной муки в этих условиях приводило к увеличению численности интродуцируемых бактерий на 1-2 порядка. При 37 °С общая численность B. megaterium 501rlf снижалась в несколько раз и стабилизировалась на установившемся уровне до конца опыта. При этом 100 % клеток бактерий формировали споры и находились в физиологически неактивном состоянии. Температура ниже физиологического минимума репродукции B. megaterium (4 °С) подавляла спорообразование и приводила к быстрому отмиранию вегетативных клеток бактерий, вносимых в почву. Их общая численность в течение месяца уменьшалась в 1000 раз. Эти данные приводят к заключению, что низкотемпературный шок снижает конкурентоспособность B. megaterium в отношении аборигенной микрофлоры и устойчивость интро-дуцируемой культуры к бактерицидным продуктам метаболизма почвенного биома. Показано, что при оптимальной температуре (20 °С) инокуляция почвы штаммом B. megaterium 501rlf и дополнительное внесение органического вещества в виде соломы ускоряли разложение промет-рина, что потенциально может быть использовано в биотехнологии ремедиации почвы, загрязненной этим гербицидом.
Ключевые слова: Bacillus megaterium, спорообразование, интродукция, почва, температурный режим, органическое вещество, прометрин.
Биопрепараты на основе бактерий применяются в практике сельского хозяйства для стимуляции роста и развития растений, их защиты от фитопатогенов и вредителей, а также очищения почв от ксенобиотиков (1-4). При этом особое место занимают биопрепараты аэробных споровых бактерий, относящиеся к роду Bacillus. В растениеводстве широкое применение нашли средства на основе B. thuringiensis (5, 6), B. subtilis (7), B. megaterium (8-10). Они достаточно технологичны при производстве, имеют длительный срок хранения, удобны для применения в полевых условиях. Вместе с тем эффективность использования таких препаратов варьирует в широком диапазоне из-за малой изученности поведения интродуцируемых в почву бацилл.
Споровые бактерии широко распространены в различных типах почв. Их численность зависит от почвенно-климатических условий и растительного покрова и составляет от 103 до 106 КОЕ/г (11). Одни авторы (11, 12) считают эти бактерии свободноживущими почвенными микроорганизмами, другие (13) — напротив, обычными обитателям ризосферы, по крайней мере, ряда растений, а таких, как B. subtilis и B. megaterim, относят к факультативным эндофитам (14, 15). По данным А.И. Мелентьева (16),
107
приживаемость споровых бактерий в ризосфере зерновых культур зависела от вносимого количества, вида и штамма интродуцента. Их численность на корнях растений варьировала в среднем от 104 до 107 КОЕ/г корней и, как правило, к концу вегетации была ниже исходного содержания. Бактерии в основном находились в виде спор, которые физиологически неактивны и, соответственно, не могут каким-либо образом влиять на рост и развитие растений.
Что касается судьбы споровых аэробных бактерий, инокулируемых в почву, то этот вопрос практически не изучен. Недостаточные знания в этой области не позволяют оптимизировать условия жизнедеятельности бацилл в почве и эффективно использовать биопрепараты на их основе для повышения продуктивности растений и биоремедиации почв.
Нашей целью было изучение влияния различных факторов на результаты интродукции Bacillus megaterium в почву и деградацию гербицида прометрина.
Методика. В опытах использовали устойчивый к антибиотику ри-фампицину мутантный штамм B. megaterium 501nf, полученный градиентным отбором устойчивых резистентных форм (17) на основе исходного родительского штамма B. megaterium 501, который был выделен нами из чернозема обыкновенного среднесуглинистого (Кокчетавская обл., Казахстан). B. megaterium 501 депонирован в ведомственной коллекции микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСХМ, Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии). Биомассу B. megaterium 501nf выращивали в колбах Эрленмейера на ротационной качалке (УМВТ-12-250, «Эллион», Россия) при интенсивной аэрации (140 об/мин). Состав питательной среды (г/л): K2HPO4 — 1,6, KH2PO4 — 0,4, NH4nO3 — 0,5, MgSO4 — 0,2, CaCO3 — 0,025, FeSO4 — 0,025, дрожжевой экстракт — 0,2, сахароза — 10, рН 6,8-7,0. Дерново-подзолистую легкосуглинистую почву (рН 6,7) расфасовывали в пластмассовые емкости и инокулиро-вали 2-суточной жидкой культурой B. megaterium 501rif, содержащей не менее 90 % вегетативных клеток. Влажность почвы поддерживали в пределах 50-60 % от полной влагоемкости.
Влияние температурного режима на рост и спорообразование оценивали в трех вариантах — при 4, 20 и 37 °С. Для изучения эффекта органического вещества измельченную солому овса (0,2 мм) и кукурузную муку вносили в количестве 20 г/кг почвы. При исследовании влияния прометрина — 2-метилтио-4,6-бис (изопропиламино)-сим-триазина
(18) на B. megaterium 501rif, а также динамики его бактериальной деградации гербицид вносили в почву в виде водной эмульсии 50 % смачивающего порошка («Panama Agrochemicals Inc.», Республика Панама) в дозе 4 и 20 мг/кг.
Общую численность B. megaterium 501rif (КОЕ/г почвы) учитывали общепринятым методом серийных разведений (19) с высевом почвенной суспензии на агаризованную минеральную среду следующего состава (г/л): NH4NO3 — 0,5, K2HPO4 — 1,6, KH2PO4 — 0,4, MgSO4 — 0,2, CaCO3 — 0,025, FeSO4 — 0,025, сахароза — 10, дрожжевой экстракт — 0,2, агарагар — 20, рифампицин — 0,02. Для учета числа спор почвенную суспензию перед посевом пастеризовали при 80 °С в течение 10 мин.
Гербицид экстрагировали из почвы ацетоном и анализировали с использованием газожидкостной хроматографии (ГЖХ) (20).
Статистическая обработка результатов была проведена до уровня Р0,05 (21).
Результаты. В нестерильной почве в условиях низкой температуры
108
(рис. 1) наблюдалось резкое снижение численности B. megaterium 501nf после инокуляции в почву, при этом 12 сут бациллы находились в состоянии вегетативных клеток. При 4 °С, что ниже температурного минимума развития для B. megaterium 501rif, задерживалось формирование спор и, соответственно, происходило быстрое отмирание вегетативных клеток. Через 1 мес общая численность инокулянта в почве оказалась меньше исходной в 1000 раз. Наблюдалось интенсивное развитие грибов, относящихся к родам Fusarium и Penicillium. Из этого следует, что «низкотемпературный шок» снижает защитные функции и конкурентоспособ-
Относительно высокую выживаемость B. megaterium 501rif регистрировали при температуре 37 °С. На 32-е сут общая численность инокулиро-ванных в почву бактерий снизилась относительно исходной в 3 раза, при этом наблюдали активное спорообразование: уже на 12-е сут степень спору-Рис. 1. Динамика выживаемости и спорообразования Bacillus megateri- ляции составила 100 %. um 501rif при инокуляции в зависимости от температуры почвы: а, б, Наиболее бла-
в — соответственно 4, 20 и 37 °С; серый и белый цвет — соответственно число спор и вегетативных клеток (лабораторный опыт). г°приятНЫе усЛ°вия
для B. megaterium 501rif в
нестерильной почве сложились при 20 °С. Уже на 3-и сут после инокуляции титр бактерий в почве возрастал почти на порядок и оставался таким практически до конца опыта (32 сут). Спорообразование наблюдалось на 12-е сут, но доля спор не превышала 30 %. Следовательно, B. megaterium 501rif в течение всего опыта находилась в активном состоянии в микробиоме дерново-подзолистой почвы.
При дополнительном внесении соломы в почву численность B. megaterium 501rif (рис. 2) уже на 12-е сут после инокуляции увеличивалась на порядок. При этом высокий титр сохранялся на протяжении 1 мес, а численность физиологически активных бактерий превышала 105 КОЕ/г. Аналогичная закономерность наблюдалась и в варианте с кукурузной мукой. Однако в этом случае происходило интенсивное спорообразо-
Рис. 2. Динамика выживаемости и спорообразования Bacillus megaterium 501nf при инокуляции с дополнительным внесением
органического вещества: а, б, в — соответственно контроль, овсяная солома и кукурузная мука; серый и белый цвет — соответственно число спор и вегетативных клеток (лабораторный опыт).
ность B. megaterium.
109
вание: через 1 мес 100 % бактерий находились в виде спор.
Положительное действие соломы и кукурузной муки на B. me-gaterium 501rif, безусловно, с одной стороны, связано с дополнительным введением в почву питательных элементов, поддерживающих жизнедеятельность этого микроорганизма, с другой — обусловлено влиянием этих субстратов на формирование микробной ассоциации, благоприятной для B. megaterium.
На протяжении ряда десятилетий обсуждаются вопросы взаимодействия микроорганизмов и ксенобиотиков в почве, к которым, в частности, относятся гербициды, используемые в сельскохозяйственном производстве для борьбы с сорняками (18). Актуальность таких исследований обусловлена воздействием этих препаратов на почвенно-микробиологические процессы и в целом на плодородие почвы, а также проблемой детоксикации и деградации пестицидов в окружающей среде, поскольку многие из них представляют опасность для экологии и здоровья человека и животных.
В связи с этим мы исследовали взаимодействие инокулированной в почву B. megaterium 501rif и гербицида прометрина, который эффективно используется для борьбы с сорняками в посевах картофеля, сои, моркови и других сельскохозяйственных культур. Установлено, что прометрин в дозах, превышающих производственные в десятки раз, не оказывал отрицательного влияния на B. megaterium 501rif, а при дополнительном внесении соломы численность этой бактерии существенно возрастала (табл.).
Динамика численности и спорообразования (КОЕ, тыс/г) при инокуляции в почву Bacillus megaterium 501rif на фоне внесения разных доз гербицида прометрина и овсяной соломы (Х+х, лабораторный опыт)
Время, сут Контроль Прометрин
4 мг/кг почвы 20 мг/кг почвы | 20 мг/кг почвы + солома (2 %)
0 80+1.2. 80+1,2 80+1,2 80+1,2
13+0,5 13+0,5 13+0,5 13+0,5
3 200+3,4 135+24,2 90+6,0 1600+100,8
150+12,6 65+0,9 40+6,2 500+8,0
12 135+5,3 114+3,5 100+10,0 1200+150,0
115+1,5 112+4,0 54+2,7 1000+21,0
32 110+10,7 140+1,5 118+9,4 1200+63,6
90+2,7 140+10,3 115+1,5 1100+49,5
Примечание. Над чертой — общая численность, под чертой — число спор.
Рис. 3. Динамика деградации гербицида прометрина в почве при разных вариантах инокуляции Bacillus megaterium 501rif: 1 — контроль, 2 — инокуляция, 3 — инокуляция с внесением овсяной соломы (2 %) (лабораторный опыт).
В почве, инокулированной B. megaterium 501rif, скорость деградации прометрина значительно увеличивалась (рис. 3). Наиболее интенсивно этот процесс протекал при дополнительном внесении соломы (спустя 1 мес содержание гербицида было в 10 раз ниже, чем в контроле), и это коррелировало с увеличением общей численности B. megaterium 501rif.
Результаты этих исследований позволяют сделать вывод, что важным, а может быть, и основным условием повышения эффективности процесса биоремедиации при загрязнении прометрином служит введение в почву органического вещества в виде растительных остатков, богатых целлюлозой, и инокуляция почвы микроорганизмами, способными разлагать гербицид.
Итак, показано, что инокулируемые в почву вегетативные клетки
110
Bacillus megaterium 501rif достаточно длительное время находятся в физиологически активном состоянии. Дополнительное внесение в почву органических веществ в виде соломы зерновых и кукурузной муки приводит к быстрому размножению бактерий. Их численность возрастает в сотни раз, и титр стабильно сохраняется. Через 12 сут после инокуляции бактерий в почву начинается активное спорообразование. Эффективность интродукции и физиологический статус бактерий напрямую зависят от температурного режима почвы. Наиболее благоприятна для выживания B. megaterium (при оптимальной влажности почвы) температура в диапазоне 20-37 °С, а также наличие органического вещества в виде растительной массы, богатой целлюлозой (соломенная резка, пожнивные остатки и т.д.). Выделенный нами штамм B. megaterium 501rif заметно ускоряет процесс деградации прометрина и может быть полезен при разработке биотехнологии ремедиации почвы, загрязненной этим гербицидом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тихонович И.А., Кожемяков А.П., Чеботарь В.К., Круглов Ю.В., Кандыбин Н.В., Лаптев Г.Ю. Биопрепараты в сельском хозяйстве. Методология и практика применения микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве. М., 2005.
2. Завалин А.А. Биопрепараты, удобрения и урожай. М., 2005.
3. B a s h a n Y. Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture. Biotechnology Advances, 1998, 16(4): 729-770 (doi: 10.1016/S0734-9750(98)00003-2).
4. Mostafiz S.B., Rahman M., Rahman M. Biotechnology: role of microbes in sustainable agriculture and environmental health. The Internet Journal of Microbiology, 2012, 10(1) (http://ispub.com/IJMB).
5. Кандыбин Н.В., Патыка Т.И., Ермолова В.П., Патыка В.Ф. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis. СПб, 2009.
6. Sanahuja G., Banakar R., T wyman R.M., Capell T., Christou P. Bacillus thuringiensis: a century of research, development and commercial applications. Plant Biotechnol. J., 2011, 9(3): 283-300 (doi: 10.1111/j.1467-7652.2011.00595.x).
7. Чеботарь В.К., Завалин А.А., Кипрушкина Е.И. Эффективность применения препарата экстрасол. М., 2007.
8. Omer A.M., Bioformulations of Bacillus Spores for using as biofertilizer. Life Sci. J., 2010, 7(4): 124-131.
9. Chumthong A., Kanjanamaneesathian M., Pengnoo A., Wiwattana-patapee R. Water-soluble granules containing Bacillus megaterium for biological control of rice sheath blight: formulation, bacterial viability and efficacy testing. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(11): 2499-2506 (doi: 10.1007/s11274-008-9774-7).
10. Злотников А.К., Алёхин В.Т., Андрианов А.Д. и др. Биопрепарат альбит для повышения урожая и защиты растений: опыты, рекомендации, результаты применения /Под ред. В.Г. Минеева. М., 2008.
11. Мишустин Е.Н., Мирзоева В.А. Спорообразующие бактерии в почвах Советского Союза. Известия АН СССР, Серия биологическая, 1965, 5: 682-691.
12. Beattie G.A. Plant associated bacteria: survey, molecular phylogeny, genomics and recent advances. In: Plant associated bacteria /S.S. Gnanamanickam (ed.). Springer, Dordrecht, Neth-erland, 2007: 1-56.
13. Miller H.J., Henren G., Van Veen L.F. Variation and composition of bacterial populations in the rhizospheres of maize, wheat and grass cultivars. Can. J. Microbiol., 1989, 35(46): 656-660 (doi: 10.1139/m89-106).
14. Rosenblueth M., Martinez-Romero E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Mol. Plant Microbe Interact., 2006, 19: 827-837 (doi: 10.1094/MPMI-19-0827).
15. Figueiredol J., Gomes E., Guimarres C., Gomes de Paula Lana С.и., Teixeira M, Lima G., Bressan W. Molecular analysis of endophytic bacteria from the genus Bacillus isolated from tropical maize (Zea mays L.). Braz. J. Microbiol., 2009, 40(3): 522-534 (doi: 10.1590/S1517-83822009000300014).
16. Мелентьев А.И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Chon. в агроэкосистемах. М., 2007.
17. Методы общей бактериологии /Под ред. Ф. Герхарда. М., 1983, т. 2.
18. Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Белан С.Р., Пылова Т.Н. Справочник по пестицидам. М., 1985.
19. Методы почвенной микробиологии и биохимии /Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1991.
20. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внеш-
111
ней среде /Под ред. М.А. Клисенко. М., 1983.
21. Плохинский Н.А. Биометрия. М., 1970.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию
микробиологии Россельхозакадемии, 24 апреля 2014 года
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: [email protected], [email protected]
Bacillus megaterium 501rif INTRODUCED INTO THE SOIL: FACTORS AFFECTING THE RATE OF SURVIVAL, SPORULATION AND DECOMPOSITION OF THE HERBICIDE PROMETRYN
Yu.V. Kruglov, T.O. Lisina
All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology, Russian Academy of Agricultural Sciences, 3, sh. Podbel-skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail [email protected], [email protected]
Received April 24, 2014 doi: 10.15389/agrobiology.2014.5.107eng
Abstract
Introduction of microorganisms into the soil is a fundamental problem in application of microbial preparations in agriculture, crop production and ecology. Its effectiveness depends on many factors (i.e. the type and strain of microorganism, the physical and chemical properties of the soil, plant cover, climate and so on), which are not well understood, leading to a high variability of the results of application of microbial preparations. In this article, there is reported the first investigation of survival and sporulation dynamics of Bacillus megaterium 501nf introduced into sod-podzolic soil, depending on the temperature of the soil, organic matter content and herbicide prome-tryn, the 2-methylthio-4,6-bis (iso-propylamino)-sim-triazine, application. In laboratory experiments it was found that the optimal conditions for the Bacillus megaterium 501nf introduced into the soil are achieved at a temperature of 20 °С. After the third day after inoculation the titer of bacteria in the soil increased almost 10 times and remained at that level until the end of the experiment (32 days/. B. megaterium 501nf throughout the experiment was mainly in the form of a physiologically active cells and fits well into the soil microbiom. Under these conditions an additional incorporation into the soil of the organic matter, such as cereal straw and corn flour, leads to 10-100-fold increase of the amount of B. megaterium 501nf. At 37 °C the total number of B. megaterium 501rlf reduced several times, and stabilized at this level until the end of the experiment. In this case, 100 % of B. megaterium 501rif revert into spores and are physiologically inactive. The temperature below the minimum for physiological reproduction of B. megaterium (4 °C) inhibits spore formation and leads to a rapid loss of physiologically active bacterial cells introduced into the soil. The total number of bacteria decreases 1000 times within a month. These data lead to the conclusion that the «low-temperature shock» reduces the competitiveness of B. megaterium to the indigenous microflora and its resistance to bactericidal metabolic products of soil biome. It is shown that at the optimum temperature (20 °C) of soil the B. megaterium inoculation and the use of additional organic matter such as straw accelerate the decomposition of herbicide prometryn, can potentially be used in a biotechnology of remediation of the soil, contaminated by herbicide.
Keywords: Bacillus megaterium, sporulation, introduction, soil, temperature, organic matter, prometryn herbicide.
Научные собрания
3-Я МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «ГЕНЕТИКА, ГЕНОМИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ»
(17-21 июня 2015 года, г. Новосибирск)
Организатор: Институт цитологии и генетики СО РАН, Сибирское отделение Российской академии наук, Вавиловское общество генетиков и селекционеров.
Направления работы предыдущих конференций:
Организация и эволюция генома растений
Секвенирование генома растений
Физиологическая и экологическая генетика растений
Генетика и селекция в изменяющихся условиях окружающей среды
Трансгенные технологии
Хромосомная и клеточная биотехнология
Геномика и системная биология
Контакты и информация: http://conf.nsc.ru/plantgen2015, [email protected]
112
