CC BY
43
Раздел - обзоры
Интернализуемые пептиды (cell-penetrating peptides, CPPs) и возможности их терапевтического применения
Кулинич Т.М., Иванов А.В., Захаренко М.В., Джикия Е.Л., Шишкин А.М., Боженко В.К. ФГБУ "Российский научный центр Рентгенорадиологии" Минздрава России, Москва 117997, ул. Профсоюзная, 86 Сведения об авторах
Кулинич Татьяна Михайловна - к.м.н., заведующая лабораторией иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Иванов Андрей Валерьевич - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ Захаренко Маргарита Владимировна - м.н.с. лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Джикия Екатерина Левановна - к.б.н., н.с. лаборатории иммунологии, онкоцитологии и клеточных технологий ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Шишкин Александр Михайлович - к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ
Боженко Владимир Константинович - д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ "РНЦРР" МЗ РФ Контактное лицо
Кулинич Татьяна Михайловна, e-mail: sobral@mail.com Резюме
Разработка эффективной системы внутриклеточной доставки лекарств - одно из основных направлений медицины и фармакологии. Несмотря на значительные успехи в развитии и
создании новых терапевтических подходов, эффективных методов лечения для многих социально значимых заболеваний все еще не разработано. Одним из современных и перспективных направлений в области новых средств доставки являются пептидные последовательности, обладающие векторными свойствами и получившие название cell penetrating peptides (CPP). Показано, что пептиды, обладающие подобными свойствами, могут являться эффективным транспортным средством для внутриклеточной доставки большого круга разнообразных веществ, начиная от наночастиц и до пептидов и полноразмерных белков.
Целью данного исследования являлся анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей проблемы поиска, разработки и использования пептидных конструкций, обладающих свойствами к внутриклеточной интернализации.
Ключевые слова: cell penetrating peptides, CPP, транспортные пептиды, противоопухолевые пептиды, трансфекция, транслокация, клеточная мембрана
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №20-015-00068\20
Cell-penetrating peptides (CPPs) and their therapeutic application
Kulinich T.M., Ivanov A.V., Zakharchenko M.V., Dzhikiya E.L., Shishkin A.M., Bozhenko V.K. Federal State Budgetary Institution "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (RSCRR), Moscow 117997, Profsoyuznaya, 86 Authors
Kulinich T.M. -MD, PhD, head of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy in Oncology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Ivanov A.V. - PhD, senior researcher of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy in Oncology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Zakharchenko M.V. - Researcher of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy in Oncology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Dzhikiya E.L. - PhD, Researcher of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy in Oncology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Shishkin A.M. - PhD, Senior researcher of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy in Oncology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Bozhenko V.K. - Professor of medicine, PhD, head of the Department of Molecular Biology and Experimental Tumor of the Laboratory of Immunology, Oncocytology and Cell Therapy in Oncology of the FSBI "Russian Scientific Center of Roentgenoradiology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
Summary
The development of an effective intracellular drug delivery system is one of the main areas of medicine and pharmacology. Despite significant advances in the development and creation of new therapeutic approaches, effective methods for the treatment of many socially significant diseases
have not yet been developed. One of the current and promising directions in the field of new delivery vehicles is peptide sequences that have vector properties and are called cellular penetrating peptides (CPP). It is shown that peptides with similar properties can be an effective vehicle of intracellular delivery of a wide range of different substances, ranging from nanoparticles to peptides and full-size proteins.
The purpose of this study was to analyze the current scientific, technical, regulatory and methodological literature on the search, development and application of peptide structures with the properties of intracellular internalization.
Key words: cell penetrating peptides, CPP, transport peptides, anticancer peptides, transfection, translocation, cell membrane
Funding: The reported study was funded by RFBR, project number №20-015-00068\20. Введение
Возможность эффективной внутриклеточной доставки и адресная доставка в целевые внутриклеточные компартменты является одной из основных проблем в создании новых лекарственных средств. Часто для проявления биологического эффекта, создания необходимой/действующей внутриклеточной концентрации, требуется введение в организм большого количества препарата, что сопровождается побочными эффектами и токсическим влиянием на здоровые ткани. Поэтому поиск новых средств доставки лекарственных препаратов является актуальной задачей современной медицины.
Одним из современных и перспективных направлений в области новых средств доставки являются пептидные последовательности, обладающие векторными свойствами и получившие название cell penetrating peptides (CPPs). Показано, что пептиды, обладающие подобными свойствами, могут являться эффективным транспортным средством для
внутриклеточной доставки большого круга разнообразных веществ, начиная от наночастиц и до пептидов и полноразмерных белков.
Метод доставки, основанный на CPPs, считается единственным методом, не нарушающим плазматическую мембрану и при этом обладающим такими важными свойствами, как эффективная доставка in vivo, внутриядерный транспорт, возможность применения ко всем типам клеток. Также важным свойством является низкая иммуногенность CPPs и возможность внутриядерного транспорта макромолекул. На сегодняшний день активно изучается возможность использования интернализуемых последовательностей в качестве векторов доставки в клетки биологически активных молекул.
Целью данного исследования являлся анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей проблемы поиска, разработки и использования пептидных конструкций, обладающих свойствами к внутриклеточной интернализации.
Изложение основного материала
Современное представление о пептидах, относящихся к классу CPPs
Метод внутриклеточной доставки различных веществ, основанный на технологии пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, является весьма перспективным ввиду слабой иммуногенности таких соединений и способности переносить достаточно крупные молекулы [1-3]. Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в белках регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул имеющих патогенетическую направленность [4]. Относительная простота синтеза таких молекул позволяет говорить о принципиальной
возможности создания индивидуальных химиопрепаратов на их основе, т.е. влияющих на патологические изменения свойственные данной конкретной опухоли [5].
Интернализуемые пептиды (СРРб) представляют собой короткие пептидные последовательности, менее чем 30 аминокислот, которые способны проникать через мембраны клеток и переносить в клетки различные соединения. Кажется, что единственной общей особенностью этих пептидов, является их положительный заряд и высокое содержание основных аминокислот [6]. Одним из общих свойств можно назвать почти обязательное присутствие нескольких молекул аргинина [7, 8]. Обнаружение такой закономерности позволило ряду исследователей говорить о свойствах интернализации - как о свойствах пептидов богатых аргинином. Однако позднее были синтезированы последовательности, не содержащие аргинин и имеющие свойства внутриклеточного транспорта [9].
Большинство СРРб инертно и их проникновение не имеет побочных эффектов. В настоящее время, установлено, что они проникают в большинство эукариотических клеток, проникновение происходит быстро (полупериод от 5 до 20 минут), и размер груза существенно не влияет на скорость проникновения. Можно предположить, что аминокислотные последовательности, ответственные за интернализацию, были созданы природой с целью содействия транспорту определённых белков и пептидов. В пользу этой теории говорит открытие антимикробных пептидов, таких как буфорин, которые, как оказалось, обладают способностью быстро проникать сквозь биологические мембраны [10, 11].
Учёные различных лабораторий, работающие по данной тематике, до сих пор обсуждают, что лежит в основе процесса интернализации СРРб через биологические мембраны [12, 13]. Во многих работах было показано, что эндоцитоз не участвует в процессе
транспорта, однако некоторые авторы утверждают обратное. Например, что проникновение пенетратина и Tat носит в основном эндоцитозный характер [14], встречаются даже работы авторы которых расценивают явление наблюдаемой интернализации как артефакт [15] .
Так как механизмы проникновения в настоящее время до конца не известны и активно изучаются, разные авторы используют разные термины для описания внутриклеточного накопления этих пептидов, например, интернализация, трансдукция, транслокация. Мы предлагаем в дальнейшем использовать термин «интернализация» и аббревиатуру CPP (CPPs) для обозначения класса пептидов.
1. Характеристика основных классов CPPs Интернализуемые пептиды, полученные из белков Пенетратины, или пептиды, полученные из гомеодомена
Гомеопротеины - класс транскрипционных факторов, связывающихся c ДНК, определённой АКП (60 а.к.), несущей название гомеодомен. Было обнаружено, что свойство некоторых транскрипционных факторов переходить из клетки в клетку, т.е. секретироваться и проникать внутрь живой клетки, связано с интернализацией гомеодомена. С целью более ясного представления механизма интернализации, гомеодомен был подвергнут модификации путём сайт-специфического мутагенеза. Было показано, что необходимым и достаточным условием для транслокации является наличие аминокислотной последовательности (АКП) (43-58), расположенной в третьей по счёту а-спирали. Так был открыт пептид пенетратин из гомеодомена белка Antennapedia организма Drosofila melanogaster [16]. Пептиды, полученные из транскрипционного фактора (Тat-пептиды)
Tat - транскрипционный фактор, участвующий в репликации вируса СПИДа. В зависимости от штамма вируса количество аминокислотных остатков (АКО) колеблется от 86 до 102. В структуре молекулы выделяют три функционально-различимых домена: 1 - N-
концевой - ответственный за трансактивацию; 2 - ДНК-связывающий регион - богатый цистеином (22-37), представляющий собой мотив «цинковых пальцев»; 3 - домен, ответственный за ядерный транспорт - (49-58). Также как и некоторые другие трансактиваторы (например, белок VP-22 полученный из вируса простого герпеса тип I [17]), Tat выходит из клеток, в которых реплицируется вирус, и интернализуется соседними клетками. Показано, что Tat-белок (нативный 86 АКО), а также фрагмент (37-72) при интернализации локализуются и в цитозоле, и в ядре [18]. Наиболее эффективным фрагментом, с точки зрения проникновения в клетку, является Tat (48-60), который включает весь основной регион белка и область NLS - область сигнала ядерной локализации [19]. Однако наличие области NLS не является достаточным условием интернализации, т.к. фрагмент Тат (37-53), включающий только эту область, не способен к самостоятельному проникновению в клетки. Кроме того, N-концевой фрагмент (48-60) способен проникать в клетки и локализуется и в ядре, и в цитоплазме. На сегодняшний день выделено более 10 производных Tat-пептидов, которые проникают в клетки различных типов [19]. Пептиды, основанные на сигнальных последовательностях
Сигнальные последовательности пептидов или последовательности транслокации через мембрану (membrane translocating sequence - MTSs), узнаются акцепторными белками, способствуя тем самым пост-трансляционной адресации про-белков к соответствующей мембране внутриклеточной оргнанеллы. MTSs, которые направляют белки к соответствующим внутриклеточным органеллам (например, эндоплазматическому ретикулуму (ЭР) или митохондрям) имеют частичную структурную гомологию. MTS эндоплазматического ретикулума состоит из 17-52 АКО, включающих N-концевой положительно заряженный домен, внутреннюю гидрофобную часть и полярный С-концевой
домен, несущий сайты узнавания для пептидазы. Было показано, что MTS, связанный с NLS, может проникать в различные типы клеток и накапливаться в ядре [20]. Синтетические или химерные проникающие пептиды
Транспортан
В ходе программы поиска антагониста рецептора галанина был получен химерный пептид - галпаран, состоящий из 13 аминокислот нейропептида галанина (1-13) и пептида яда ос - мастопарана. Данный химерный пептид обладает способностью к интернализации; показано, что биотинилированный галпаран обнаруживается и в ядре, и в цитоплазме. Данному пептиду было присвоено название транспортан.
После инкубации в течение 1 мин при 37 °С, транспортан обнаруживается в плазматической мембране, далее следует быстрое его распределение в ядро и другие внутриклеточные компартменты. На интернализацию не влияет добавление галанина, инкубация при 4 °С или в гипотоническом растворе сахарозы. Кинетика накопления пептида выражается быстрым насыщением, с последующим медленным выходом пептида обратно в среду. Более того, при насыщении внутриклеточная концентрация выше внеклеточной не менее, чем в 2 раза. При концентрациях менее 20 мкМ не обнаружено признаков токсичности [10].
Было показано, что транспортан успешно доставляет пептиды, пептид-нуклеиновые кислоты и белки в различные типы клеток [21]. Интернализация транспортана является белок-независимой и проходит, не затрагивая эндоцитозный путь. Из ряда синтезированных аналогов транспонтана, транспортан 10 обладает наилучшей проникающей способностью [21].
Модельные амфифильные пептиды
При исследовании взаимодействия ряда пептидов с G-белками был сконструирован модельный амфифильный пептид длиной 18 АКО. Этот пептид проникает в тучные и эндотелиальные клетки по энергозависимому и энерго-независимому механизму и может быть эффективным транспортером для других пептидов. Несмотря на то, что прохождение через мембрану модельного пептида наблюдается, начиная с 4 мкМ концентрации, был синтезирован ряд аналогов, показывающих меньшую токсичность и большую степень интернализации [22].
2. Свойства пептидов, необходимые для интернализации
По физико-химическим свойствам пептиды можно разделить на две группы -гидрофобные и амфифильные. Длина пептидов колеблется от 11 до 30 аминокислот. Единственным найденным на сегодняшний день свойством, объединяющим все СРР, является высокое содержание основных аминокислот, наличие которых придаёт CPPs положительный заряд. Однако было установлено, что наличие положительного заряда не является достаточным условием для протекания явления интернализации. Было показано, что октамер аргинина (Arg)8 проникает в клетки, в то время как (Arg)i6, нет [23].
Также была исследована важность типа вторичной структуры. Предположительно, для большого количества СРР характерна а-спираль. Однако, например, для пенетратина было установлено, что характерная для него а-спиральная вторичная структура может переходить в ß-складчатую структуру в присутствии заряженного липидного монослоя. Более того, было показано, что амфифильный пептид, имеющий ß -складчатую структуру, способен к интернализации [24].
3. СРР - векторы доставки
Метод доставки, основанный на СРР считается единственным методом, не нарушающим плазматическую мембрану и обладающим такими важными свойствами как:
эффективная доставка in vivo, внутриядерный транспорт, возможность применения ко всем типам клеток, малозначительность размера и природы переносимых молекул. Также важным свойством является низкая иммуногенность СРР. Доставка посредством СРР применяется не только по отношению к эукариотическим клеткам, также описан метод доставки агентов, таких как RNA, в бактерии [25]. В настоящее время актуальной является возможность внутриядерного транспорта макромолекул с помощью СРР, с его помощью изучаются новые возможности использования молекул - регуляторов клеточного цикла, индукторов апоптоза и других потенциальных противоопухолевых агентов. За последние несколько лет появилось большое количество работ посвященных использованию СРР для доставки различных веществ в клетки [26-28]. В настоящее время экспериментально исследована возможность доставки внутрь клетки с помощью СРР самых различных молекул. Применение интернализуемых пептидов для регуляции клеточных функций.
Использование свойства СРР проникать в клетку и клеточные органеллы интересно возможностью доставки с их помощью различных физиологически активных молекул, в частности, пептидных цепей. Эти данные получены при исследовании свойств таких важных белков - регуляторов клеточных функций, как р53, р16, р21, bcl-2, bax и др. [28]. Эти белки относятся к группе продуктов генов, с нарушением функции которых часто связывают возникновение опухоли. Для большинства из них свойственны взаимодействия, приводящие к ингибированию или активированию соответствующих белков (генов) и функций, опосредуемых ими. Одним из современных направлений в исследовании свойств этих белков стало выявление минимальной пептидной последовательности, способной выполнять ту или иную функцию полноразмерного белка [29]. Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в ключевых белках-регуляторах создали предпосылки для конструирования молекул, позволяющих направленно
манипулировать клеточными функциями. На сегодняшний день основное количество работ посвящено возможности использования СРР в онкологии в качестве векторов доставки определённых молекул с целью получения цитостатического и цитотоксического эффектов на опухолевых клетках [7, 19]. Активное изучение CPPs обусловлено, прежде всего, относительной простотой их получения. Существуют два основных способа: твердофазный синтез и генно-инженерные технологии. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Твердофазный синтез - это относительно дешевый и быстрый способ. Однако с его помощью можно получать последовательности, ограниченные максимальной длиной до 40-50 АКО, а получаемые количества ограничены десятками - сотнями миллиграмм. Генно-инженерные методы, наоборот, имеют ограничение по минимальной длине (как правило, не менее 50 АКО), но позволяют получить большие количества продукта. Кроме того, они более длительны и трудоемки.
4. Возможные механизмы интернализации. Модели проникновения CPPs
Подробно модели проникновения представлены в работах Ruseska I. и Zimmer, A. (2020) [30] и Dougherty P.G. с соавт., (2019) [8]. В частности, Dougherty P.G с соавт. описывает 4 механизма проникновения циклических пептидов: пассивная диффузия, активный транспорт, эндоцитоз и прямое проникновение [8]. На сегодняшний день в качестве основных моделей проникновения рассматривают эндоцитоз и прямое проникновение. Эндоцитоз - это активный энергозависимый процесс, включающий этапы эндоцитарного захвата и высвобождения из эндосом. Эндоцитоз подразделяется на фагоцитоз крупных частиц специализированными клетками (макрофаги, моноциты и нейтрофилы) и пиноцитоз для захвата растворенных веществ всеми видами клеток. Для пиноцитоза предложены 4 различных механизма: макропиноцитоз, клатрин-опосредованный эндоцитоз (КОЭ), кавеоло-опосредованный эндоцитоз (КвОЭ) и кларитин- и кавеоло-независимый эндоцитоз.
Макропиноцитоз считается главным путем проникновения ИП в клетки. Он включает ремоделирование цитоскелета клетки, формирование актин-опосредованного выступа мембраны и образование большого пузырька (до 1 мкМ в диаметре) - макропиносомы. При физиологических условиях макропиноцитоз активируется стимулирующими рост факторами. Он характерен для аргинин-богатых ИП, таких как ТАТ и окта-аргинин. Высказано предположение, что протеогликаны мембран выступают в качестве своеобразных рецепторов, запускающих механизм захвата ИП: гепарансульфат протеогликаны и синдеканы для R8, скавенджер-рецептор для NickFect51, аналога транспортана 10 [33, 34].
Клатрин-опосредованный эндоцитоз - рецептор-опосредованный процесс, обеспечивающий захват питательных веществ, таких как холестерол и трансферрин, поступление в клетку трансмембранных рецепторов и транспортеров, реконструкцию плазматических мембран в ответ на изменение внешней среды. Он подразумевает тесное взаимодействие лиганда со специфическим рецептором, инвагинацию мембраны в сторону цитоплазмы и формирование сферической структуры диаметром 100-150 нм. Такой механизм проникновения предположительно используют следующие пептиды: ТАТ, R8, MPG и даже анионные ИП [14].
Кавеоло-опосредованный эндоцитоз сопровождается появлением кавеолосомы -колбовидной инвагинации мембраны в форме пещеры, диаметром 50-100 нм, нейтральным pH, гетерогенной морфологией и нечетко определенной судьбой. Этот механизм обеспечивает транспорт белков сыворотки через эндотелий, играет важную роль в сигнальных механизмах и регуляции липидного обмена [35].
Посредством рецепторов обеспечивается захват альбумина, фолиевой кислоты, щелочной фосфатазы, патогенов (токсин холеры, SV40 вирус, вирус полиомы, HIV вирус). Вирусы могут использовать этот путь, не подвергаясь лизосомальной деградации. Кавеоло-
опосредованный эндоцитоз описан для ТАТ, пролин-богатых ИП, транспортана и TP10, азурина и р28. Для ТАТ- и транспортан-белковых комплексов он более вероятен при увеличении размеров соединений [35].
Клатрин-кавело-независимый эндоцитоз - более быстрый процесс, связанный с функциональными участками мембраны в виде "липидных плотов" (rafts), маленьких структур диаметром 40-50 нм, диффузно рассеянных по поверхности клеток. Данный процесс специфичен для липидов и жидкостей, задействован при интернализации р28, транспортана и транспортана-10.
Без выхода из эндосом ИП не могут достигнуть мишеней, поскольку остаются окруженными мембраной и в дальнейшем деградируют в лизосомах из-за высокого pH и гидролиза. Показано, что высвобождение происходит при высоких концентрациях пептида [13] и сопровождается разрывом эндосомальной мембраны, что может привести к токсическому эффекту. Таким образом, эндоцитоз представляет собой процесс поддержания жизнеспособности клетки, включая доставку питательных веществ и обеспечение сигнальных взаимодействий. При этом часть захваченных веществ попадает в цитозоль, а другие подвергаются деградации в эндо-лизосомальной сиситеме. Эндоцитоз задействован в борьбе с внешними патогенами, хотя и неэффективен при определенных вирусах и бактериальных токсинах. Для высвобождения ИП дополнительно требуется дестабилизация эндосомальных мембран, а при высоких концентрациях ИП возможен их разрыв и токсические реакции.
Прямое проникновение (транслокация, трансдукция) - энергонезависимый процесс, сопровождающийся дестабилизацией клеточной мембраны с формированием: 1) инвертированных мицелл, 2) пор и 3) модель «ковра» ("carpet") [36]. Описан как альтернативный эндоцитозу процесс, наблюдаемый при низких температурах, при высоких
концентрациях пептидов, и наиболее вероятен для первичных амфипатических ИП [37]. Первоначально модель инвертированной мицеллы была предложена для пенетратина. Взаимодействии ИП и липидного бислоя может вызвать конформационное повреждение пептида и изменение физических свойств мембраны [95]. Модель порообразования [37] предложена для амфипатических альфа-спиральных пептидов (Barrel-stave модель, [36]) и пептидов, способных принимать альфа-спиральную форму при контакте с клеточной мембраной (Toroidal модель).
При втором варианте ИП накапливается на поверхности фосфолипидного слоя, вызывая деформацию мембраны и формирование временных пор. Предполагается, что проникновение опосредовано взаимодействием гуанидиновых групп и жирных кислот при наличии pH градиента плазматической мембраны.
Для модели «ковра», предложенной для антимикробного амфипатического пептида дермасептина, характерно гидрофобное взаимодействие [38]. При этом высокая локальная концентрация пептида является ключевым фактором проникновения через мембрану. Как альтернатива предложена модель "мембранного истончения" для маганина, обладающего широким спектром противомикробной активности.
Комплексная модель проникновения аргинин-богатых пептидов разработана Futaki S. и Nakase I. (2017) [39]. При малых концентрациях ИП взаимодействуют с протеогликанами, которые выступают в качестве рецепторов макропиноцитоза. При этом активация Ras-белка приводит к индукции актина и формированию макропиносом. При больших концентрациях избыточное накопление пептида на мембране приводит к временной ее дестабилизации без образования стабильных пор, как при антимикробных пептидах и, следовательно, без явного повреждения. Возможно, что прямое проникновение одного ИП или ИП с прикрепленным веществом небольших размеров (не более 10-20 кДа) возникает на фоне эдоцитарного
насыщения. Проникновение более крупных соединений возможно только путем эндоцитоза. Степень высвобождения ИП в цитозоль невелика из-за небольшой дестабилизационной способности аргинин-богатых пептидов, что объясняет и отсутствие значительных токсических эффектов.
Для многих ИП и их соединений возможно имеют место различные механизмы проникновения в зависимости от свойств пептида, клеточной мембраны, а также экспериментальных условий [39].
Большое число факторов, влияющих на проникновение, а также отсутствие стандартизованных протоколов, приводит к тому, что каждое экспериментальное исследование уникально и трудно воспроизводимо. Результаты исследований сложно сравнивать, а выводы их часто противоречивы. Заключение
При использовании СРР в онкологии необходим тщательный подбор функциональной группы. На сегодняшний день достижения в исследовании генома существенно расширили список клеточных мишеней, возможных «точек воздействия» для применения СРР, это - и опухолевые супрессоры, и индукторы апоптоза, и регуляторы клеточного цикла. Кроме того, этот подход может быть использован и для исследования внутриклеточных функций различных макромолекул. Как известно, в опухолевых клетках нарушено соотношение процессов дифференцировки и программированной клеточной гибели, поэтому детальное изучение данных механизмов может помочь в поиске новых возможностей применения технологии СРР.
Достижение конечной цели использования ИП в качестве системы целевой доставки макромолекул невозможно без понимания механизма взаимодействия ИП с живыми клетками, как системами, поддерживающими свой гомеостаз. Определение проникновения
(накопления, деградации) ИП в клетку, взаимодействия ИП с внутриклеточными мишенями и другими структурами клетки, разделение целевого и побочных (токсических) эффектов -компоненты единого процесса изучения ИП. Создание стандартизированной методологии позволит определять истинную принадлежность того или иного пептида к классу ИП, соответственно принятому определению. При этом только воспроизводимые и надежные экспериментальные данные смогут обеспечить результативность методов компьютерного моделирования системы интернализации и предсказания новых последовательностей. ^исок литературы
1. Игнатович И.А., Диже Э.Б., Павлоцкая А.В. и др. Перевозчиков А. П. Механизм переноса комплексов ДНК/Tat в клетки млекопитающих. 11-ая Международная конференция. 2003.
2. YangN.J., HinnerM.J. Getting Across the Cell Membrane: An Overview for Small Molecules, Peptides, and Proteins. Methods Mol Biol. 2015. V. 1266. V. 29-53.
3. Avci F.G., Akbulut B.S., Ozkirimli E. Membrane Active Peptides and Their Biophysical Characterization. Biomolecules. 2018. V. 8. No. 3. Article ID 77.
4. Vasconcelos L., Parn K., Langel Ü. Therapeutic potential of cell-penetrating peptides. Therapeutic Delivery. 2013. V. 4. No. 5. P. 573-591.
5. Cell-Penetrating Peptides: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) 2nd ed. Langel Ü. (ed.). 2015. ISBN: 978-1-4939-2805-7.
6. Deshayes S., Gerbal-Chaloin S., MorrisM.C., et al. On the mechanism of non-endosomial peptide-mediated cellular delivery of nucleic acids. Biochim Biophys Acta. 2004. V. 15. No. 1667. No. 2. P. 141-147.
7. Eiden L.E. Fusion polypeptides that inhibit exocytosis: fusing aptamer and cell-penetrating Peptide technologies and pharmacologies. Mol Pharmacol. 2005. V. 67. No.4. P. 980-982.
8. Dougherty P. G., Sahni A., Pei D. Understanding Cell Penetration of Cyclic Peptides..Chem Rev. 2019. V. 119. No. 17. P. 10241-10287.
9. Jones S. W., Christison R, BundellK., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br J Pharmacol. 2005. V. 145. No. 8. P. 1093-1102.
10. LindgrenM.E., HallbrinkM.M., Elmquist A.M., Langel U. Passage of cell-penetrating peptides across a human epithelial cell layer in vitro. Biochem J. 2004. V. 377. Pt. 1. P. 69-76.
11. Takeshima K., Chikusha A., Lee K., et al. Translocation of analogues of the antimicrobial peptides magainin and buforin across human cell membranes. J Biol Chem. 2003. V. 278. No. 2. P. 1310-1315.
12. Agrawal P., Bhalla S., Usmani S.S., et al. CPPsite 2.0: a repository of experimentally validated cell-penetrating peptides. Nucleic Acids Res. 2015. V. 44. D.1. P. D1098-D1103.
13. Qian Z., Martyna A., HardR.L., et al. Discovery and mechanism of highly efficient cyclic cell-penetrating peptides. Biochemistry. 2016. V. 55. No. 18. P. 2601-2612.
14. Richard J.P., Melikov K., Brooks H., et al. Cellular Uptake of Unconjugated TAT Peptide Involves Clathrin-dependent Endocytosis and Heparan Sulfate Receptors. J Biol Chem. 2005. V. 280. No. 15. P. 15300-15306.
15. Richard J.P., Melikov K., Vives E., et al. Cell-penetrating peptides: A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J Biol Chem. 2003. V. 278. No. 1. P. 585-590.
16. Joliot A., Pernelle C., Deagostini-Bazin H., Prochiantz A. Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 1991. V. 88. No. 5. P.1864-1868.
17. Elliott G., O 'Hare P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpes virus structural protein. Cell. 1997. V. 88. No. 2. P. 223-233.
18. FordK.G., Souberbielle B.E., DarlingD., Farzaneh F. Protein transduction: an alternative to genetic intervention? Gene Ther. 2001. V. 8. No. 1. P. 1-4.
19. Turner J. J., Ivanova G. D., Verbeure B., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. No. 21. P. 6837-6849; doi:10.1093/nar/gki991.
20. Ben-Saadon R., Fajerman I., Ziv T., et al. The Tumor Suppressor Protein p16INK4a and the Human Papillomavirus Oncoprotein-58 E7 Are Naturally Occurring Lysine-less Proteins That Are Degraded by the Ubiquitin System. Direct evidence for ubiquitination at the N-terminal residue.
J Biol Chem. 2002. V. 279. No. 40. P. 41414-41421.
21. PoogaM., KihlmarkM., HallbrinkM., et al. Cellurar translocation of proteins by transportan. FASEB J. 2001. V. 15. No. 8. P.1451-1453.
22. LindgrenM.E., HallbrinkM.M., Prochiantz A., Langel U. Cell penetrating peptides. Tips. 2000. V. 21. No. 3. P.99-102.
23. Futaki S., Suzuki T., Ohashi W., et al. Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem. 2001. V. 276. No. 8. P. 5836-5840.
24. Fischer P.M., Krausz E., Lane D.P. Cellular delivery of impermeable effector molecules in the form of conjugates with peptides capable of mediating membrane translocation. Bioconjug Chem. 2001. V. 12. No. 6. P. 825-841.
25. Veldhoen S., Laufer S. D., Trampe A., Restle T. Cellular delivery of small interfering RNA by a non-covalently attached cell-penetrating peptide: quantitative analysis of uptake and biological effect. Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. No. 22. P. 6561-6573.
26. Ruseska I., Zimmer A. Internalization mechanisms of cell-penetrating peptides. Beilstein J Nanotechnol. 2020. V. 11. P. 101-123.
27. Pei D., Buyanova M. Overcoming Endosomal Entrapment in Drug Delivery. Bioconjug Chem. 2019. V. 30. No. 2. P. 273-283.
28. Ramaker K., HenkelM., Krause T., et al. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Deliv. 2018. V. 25. No. 1. P. 928-937.
29. УхановаЕ.М., Кулинич Т.М., КудиноваЕ.А.и др. Терапевтические дозовые характеристики химерного пептида MM-D37K при парентеральном введении мышам BALB/С nude с колоректальным раком человека НСТ-116. Российский биотерапевтический журнал. 2017. Т. 16. № 2. С. 36-41. doi: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-36-41.
30. Ruseska I., Zimmer A. Internalization mechanisms of cell-penetrating peptides. Beilstein Journal of Nanotechnology. 2020. V. 11. P. 101-123.
31. JonesA.T. Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. J Cel Mol Med. 2007. V. 11. No. 4. P. 670-684.
32. Lim J. P., Gleeson P. A. Macropinocytosis: an endocytic pathway for internalising large gulps. Immunol Cell Biol. 2011. V. 89. No. 8. P. 836-843.
33. Nakase I., Noguchi K., Aoki A., et al. Arginine-rich cell-penetrating peptide-modified extracellular vesicles for active macropinocytosis induction and efficient intracellular delivery. Sci Rep. 2017. V. 7. No. 1. Article ID 1991.
34. ArukuuskP., Pärnaste L., Margus H., et al. Differential Endosomal Pathways for Radically Modified Peptide Vectors. Bioconjug Chem. 2013. V. 24. No. 10. P. 1721-1732.
35. Branza-NichitaN., Macovei A., Lazar C. Caveolae-dependent endocytosis in viral infection. In Molecular Regulation of Endocytosis, B. Ceresa, Ed., 2012. InTech. 32 p.
36. Copolovici D. M., LangelK., Eriste E., Langel Ü. Cell-Penetrating Peptides: Design, Synthesis, and Applications. ACS Nano. 2014. V. 8. No. 3. P. 1972-1994.
37. Madani F., Lindberg S., Langel Ü., et al. Mechanisms of Cellular Uptake of Cell-Penetrating Peptides. J Biophys. 2011. V. 2011. Article ID 414729. doi: 10.1155/2011/414729.
38. Pouny Y., Rapaport D., Mor A., et al. Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogs with phospholipid membranes. Biochemistry. 1992. V. 31. No. 49. P. 12416-12423. doi: 10.1021/bi00164a017.
39. Futaki S., Nakase I. Cell-Surface Interactions on Arginine-Rich Cell-Penetrating Peptides Allow for Multiplex Modes of Internalization. Acc Chem Res. 2017. V. 50. No. 10. P. 2449-2456. doi: 10.1021/acs.accounts .7b00221.
