CC BY
14
3. Богуш, А. А. Мероприятия по профилактике, диагностике и лечению мастита у коров / А.А. Богуш, В.Е. Иванов, Л.М. Бородич // Эпизоотология, иммунобиология, фармакология, санитария. - 2008. - № 4. - С. б1-70.
4. Елесин, А.В. Заболевания сосков вымени / А.В. Елесин, А.С. Баркова // Животноводство России. - 2008. - № 8. - С. 47-48.
5. Касянчук, В. Профилактика мастита у коров / В. Касянчук // Молочное и мясное скотоводство. - 1992. - № 3. - С. 31-32.
6. Ковальчук, С.Н. Распространение и этиология маститов у коров в ряде регионов Республики Беларусь: сб. науч. тр. I С.Н. Ковальчук, В.В. Петров, Н.В. Баркалова // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. - Горки: БГСХА, 2008. -Вып. 11. - Ч. 2. - С. 255-2б1.
7. Кузьмич, Р.Г. Проблемы маститов у коров в хозяйствах Республики Беларусь и пути их решения / Р.Г. Кузьмич, О.В. Кузьмич // Ученые записки УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины». - 2005. - Т. 41. -Вып. 2. - Ч. 3. - С. 29-31.
8. Олейник, А. Мастит, мастит, мастит / А. Олейник // Молочное и мясное скотоводство. - 200б. - № 7. - С. 2б-29.
9. Пониткин, Д.М. Предупреждение мастита у коров - основа повышения продуктивности и качества молока / Д.М. Пониткин, Н.Т. Климов, Н.В. Приткин // Зоотехния. - 2007. - № 7. - С. 21-22.
10. Шахов, А.Г. Неотложные задачи профилактики мастита у коров / А.Г. Шахов, В.Д. Мисайлов [и др.] // Ветеринария. - 2005. - № 8. - С. 3-7.
11. Evaluation of bovine teat condition in commercial dairy herds: non- infectious factors I J. Eric Hillerton, W.F. Morgan, R. Farnsworth, D.J. Reinemann [at al.] II Proceedings of the 2nd International Symposium on Mastitis and Milk Quality. - 2001. - P. 347-351.
12. The role of machine-induced changes in teat tissue conditions in the development of subclinical mastitis I A. Zecconi, L. Bava, A. Sandrucci, A. Tamburini, M. Zucali, R. Pic-cinini II European Buiatrics Forum, Palais du Pharo, Marseille, 1-3 December 2009; Labastide St Pierre: Société Française de Buiatrie. - 2009. - P. 21.
УДК 636.4:09/616.15/577.115.3
ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ
И ЖИРНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПОРОСЯТ, БОЛЬНЫХ КОЛИЭНТЕРОТОКСЕМИЕЙ
М.И. РАЦКИЙ, О.И. ВИЩУР, Н.А. БРОДА, Д.И. МУДРАК Институт биологии животных НААН г. Львов, Украина, 79034
(Поступила в редакцию 31.01.2012)
Введение. Отечная болезнь (колиэнтеротоксемия) - одно из наиболее распространенных заболеваний свиней. В настоящее время не существует однозначного мнения ученых относительно этиопатогенеза этого заболевания. Ряд отечественных и зарубежных ученых считают, что основным этиологическим фактором являются патогенные микроорганизмы, в частности гемолитическая кишечная палочка. Однако есть данные, свидетельствующие о неинфекционной этиологии заболевания [1]. Так как соответствующие биопрепараты (вакцины, сыворотки, бактериофаги), предложенные для профилактики и лечения ко-лиэнтеротоксемии поросят, оказались мало или совсем не эффективными [2].
При нормальных физиологических условиях активные формы кислорода и продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) участвуют в метаболизме клетки, как инициаторы и промежуточные продукты при синтезе биологически активных соединений, в частности лейко-триенов, тромбоксанов, стероидных гормонов и др. Повышенное содержание продуктов ПОЛ обнаруживается в крови и тканях новорожденных животных при гипотрофии и иммунодефиците. Доказана корреляционная связь между динамикой свободнорадикальных процессов в лимфоцитах и динамикой иммунного ответа на антигены. Установлено также участие свободнорадикальных продуктов в реализации киллерной функции лимфоцитов, антимикробной защиты фагоцитов, а также в развитии иммуносупрессии при их гиперактивации [3, 4].
В последние годы в опытах на различных животных установлена связь между уровнем иммунного ответа и жирнокислотного состава липидов плазматических мембран иммунокомпетентных клеток при норме и патологии [5, 6]. Эта связь обусловлена тем, что мембранные комплексы на поверхности лимфоцитов участвуют в распознавании антигенов, в индукции клонов, в процессах активации и кооперации клеток, в регуляции иммунного ответа. Состав липидов, степень ненасыщенности жирных кислот, входящих в их состав, в значительной степени влияют на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Именно липиды считаются соединениями, которые детерминируют ультраструктурную организацию и функциональную активность мембранных структур. Об этом свидетельствует специфический состав структурных липидов и их жирнокислотный спектр в различных видах клеточных мембран и связанная с ним функциональная специализация мембранных органелл и плазмолемы лимфоцитов [7].
Липиды в лимфоцитах входят в состав двух клеточных структур -мембран и цитоплазматических жировых включений [7]. Жировые включения представляют собой окруженные монослоем фосфолипи-дов вакуоли, содержащие триацилглицеролы и эфиры холестерола [8]. Особенностью липидов жировых включений в лейкоцитах является высокое содержание в них полиненасыщенных жирных кислот. Установлено, что количество жировых включений и количество полиненасыщенных жирных кислот в липидах лимфоцитов увеличивается при стимуляции иммунной функции в организме [7]. При этом в их составе увеличивается содержание полиненасыщенных жирных кислот, особенно арахидоновой (20:4, п=6), эйкозапентаеновой (20:5, п=3) и доко-загексаеновой (22:6, п=3). Жировые включения в лейкоцитах, в отличие от жировых включений в других клетках, в частности адипоцитах, не выполняют функции энергетического депо (или же она является не основной), а депонируют полиненасыщенные жирные кислоты. Кроме того, они содержат ферменты, обеспечивающие синтез эйкозаноидов, жирных кислот (ацетил-КоА-карбоксилаза), холестерола (сквален-
епоксидаза, 17-в-гидроксистероилдегидрогеназа, ланостеринсинтаза) [7].
Полиненасыщенные жирные кислоты влияют на формирование иммунного ответа организма, действуя как внутриклеточные и межклеточные медиаторы [9-11]. Концентрация свободных жирных кислот в мембранах лимфоцитов в 10 раз больше, чем в эритроцитах, что свидетельствует о высоком уровне их метаболизма в иммунокомпе-тентных клетках и важной роли в реализации иммунных реакций [5].
Из арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот, которые являются производными соответственно линолевой и линоленовой кислот, в организме синтезируются биологически активные соединения, часть из которых связана с воспалительными процессами и иммунной функцией [12, 13]. В частности, установлено, что уменьшение содержания линолевой и арахидоновой и увеличение содержания стеариновой и олеиновой жирных кислот в фосфолипидах мембран клеток слизистой двенадцатиперстной кишки поросят при воспалении приводит к повышению текучести мембран и к резкому увеличению их проницаемости при диарейном синдроме [14]. Выявленные нарушения текучести мембран лимфоцитов обусловлены увеличением содержания насыщенных жирных кислот в липидном комплексе мембран в условиях стафилококковой инфекции.
Цель работы - исследовать содержание продуктов ПОЛ в плазме крови клинически здоровых и больных колиэнтеротоксемией поросят, а также жирнокислотный состав общих липидов лимфоцитов крови и содержание свободного холестерола в организме поросят.
Материал и методика исследований. Опыт проведен в фермерском хозяйстве Львовской области на клинически здоровых и больных колиэнтеротоксемией поросятах крупной белой породы 28-суточного возраста. Для проведения исследований у поросят брали кровь из краниальной полой вены, одновременно от клинически здоровых и больных колиэнтеротоксемией поросят.
В плазме крови определяли: содержание гидроперекисей липидов (А.К. Мирончик, 1982) и концентрацию ТБК-активных продуктов (Э.Н. Коробейников, 1989). Лимфоциты получали из стабилизированной гепарином крови путем центрифугирования в градиенте плотности фикол-верографина. Липиды лимфоцитов экстрагировали по методу Блая и Дайера [15]. Жирные кислоты метилировали метилатом натрия при комнатной температуре с последующим подкислением серной кислотой и продолжением метилирования при температуре 70 оС [16, 17]. Жирнокислотный состав общих липидов лимфоцитов определяли методом газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе Hewlett Packard HP-6890 с пламенно-ионизационным детектором, оборудованном капиллярной колонкой SP-2380 длиной 100 м (Supelco). Программировали температуру термостата колонок от 40 до 260 оС. Температура дозатора - 280 оС. Температура детектора -
241
290 оС. Газ-носитель - гелий. Для идентификации хроматографических пиков и расчета хроматограмм использовали стандарты метиловых эфиров жирных кислот (Supelco).
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.
Результаты исследований и их обсуждение. Из приведенных в табл. 1 данных видно, что концентрация гидроперекисей липидов (ГПЛ), продуктов промежуточной стадии пероксидного окисления липидов в плазме крови больных колиэнтеротоксемией поросят была в 1,7 раза больше (Р<0,001), чем у клинически здоровых животных. При этом концентрация ТБК-активных продуктов, конечного продукта ПОЛ в плазме крови поросят, больных колиэнтеротоксемией, была в 1,3 раза больше (Р<0,01) по сравнению с их содержанием в плазме крови клинически здоровых поросят.
Таблица 1. Содержание ГПЛ и ТБК-активных продуктов в плазме крови поросят (M±m, n=8)
Показатели Группы животных
клинически здоровые больные
ТБК-активные продукты, нмоль/мл 4,549±0,15 5,760±0,09**
ГПЛ, Од.Е/мл 0,540±0,03 0,925±0,04***
**Р<0,01; ***Р<0,001.
На основании полученных результатов исследований можно сделать вывод, что заболевание поросят колиэнтеротоксемией приводит к увеличению как конечных, так и промежуточных продуктов пероксидного окисления липидов, что может рассматриваться как реакция организма на действие стрессовых факторов и патогенных микроорганизмов. Повышение содержания продуктов ПОЛ в мембранах приводит к ослаблению их барьерной функции и росту проницаемости для вредных веществ и токсинов. Это соответствует результатам исследований других авторов [5, 9].
Из приведенных в табл. 2 данных исследований видно, что у поросят, больных колиэнтеротоксемией, содержание свободного холестерина в лимфоцитах крови было в 1,6 раза больше (Р<0,05), чем в крови клинически здоровых животных. Полученные результаты представляют значительный интерес в связи с тем, что холестерол входит в состав клеточных мембран, а увеличение его содержания в мембранах приводит к их уплотнению и снижению функциональной активности.
Существенные изменения выявлены также при исследовании жир-нокислотного спектра общих липидов лимфоцитов крови поросят при заболевании колиэнтеротоксемией. Так, содержание арахидоновой кислоты в общих липидах лимфоцитов крови поросят, больных колиэнтеротоксемией, было меньше на 23,4 % (Р<0,05) по сравнению с ее содержанием в общих липидах лимфоцитов крови клинически здоро-
242
вых поросят (табл. 2). Это объясняется повышением использования арахидоновой кислоты в организме поросят для синтеза простагланди-нов в связи с воспалительным процессом, обусловленным патогенным действием р-гемолитических колибактерий. Вместе с тем содержание арахидоновой кислоты в липидах клеточных мембран во многом зависит от активности десатураз, катализирующих их синтез из линолевой кислоты путем десатурации и элонгации жирных кислот [18].
Таблица 2. Содержание свободного холестерола и жирнокислотный состав общих липидов лимфоцитов поросят (M±m, %, п=8)
Показатели Группы животных
клинически здоровые больные
ВХ, нмоль/10 - клеток 2,34±0,24 3,89±0,11*
Каприновая 10:0 - 0,57±0,13
Лауриновая 12:0 3,74±0,51 7,98±1,37*
Миристиновая 14:0 5,30±0,38 7,80±0,81*
Миристоолейновая 14:1 - 0,66±0,08
Пентадекановая 15:0 - 1,01±0,04
Пальмитиновая 16:0 24,36±0,62 26,25±1,10
Пальмитоолейновая 16:1 2,91±0,53 1,39±0,40*
Гептодекановая 17:0 0,33±0,04 0,41±0,05
Стеариновая 18:0 8,06±0,54 7,56±0,37
Олейновая 18:1 21,4±1,45 25,33±0,61
Линолевая 18:2 9,34±0,98 9,00±0,49
Линоленовая 18:3 0,28±0,09 0,31±0,11
Нонандекановая 19:0 1,18±0,55 0,74±0,31
Эйкозадиеновая 20:2 1,17±0,30 0,78±0,24
Арахидоновая 20:4 12,52±0,92 9,59±0,51*
Эйкозапентаеновая 20:5 - 0,52±0,11
Докозадиеновая 22:2 5,82±1,81 4,12±0,94
Докозагексаеновая 22:6 1,45±0,23 1,14±0,32
*Р<0,05.
О снижении десатурации линолевой кислоты в организме поросят, больных колиэнтеротоксемией свидетельствует меньший в 1,3 раза индекс десатурации ненасыщенных жирных кислот, который характеризует соотношение количества арахидоновой и линолевой кислот в липидах лимфоцитов по сравнению с индексом десатурации у клинически здоровых животных. Эти данные свидетельствуют о супрессии образования арахидоновой кислоты, предшественником которой является линолевая кислота в лимфоцитах крови больных колиэнтероток-семией поросят. Такие изменения характерны для клеток с уплотненной плазмолемой и пониженной чувствительностью рецепторов лим-фоцитарных мембран к соответствующим антигенам.
Из данных, приведенных в табл. 2, видно, что в общих липидах лимфоцитов крови больных поросят относительное количество лаури-новой и миристиновой жирных кислот было соответственно в
243
2,1 (Р<0,05) и 1,5 раза (Р<0,05) больше, а количество пальмитоолеино-вой в 2 раза (Р<0,05) меньше, чем в лимфоцитах крови клинически здоровых животных. Рост относительного количества лауриновой (12:0) и миристиновой (14:0) жирных кислот в общих липидах лимфоцитов крови поросят, больных колиэнтеротоксемией, можно объяснить их стимулирующим влиянием на активность макрофагов и лимфоцитов и на образование воспалительных цитокинов в условиях патологии [19, 20].
Полученные результаты свидетельствуют о том, что заболевание поросят колиэнтеротоксемией вызывает снижение относительного содержания полиненасыщенных жирных кислот, в частности арахидоновой, и увеличение насыщенных - лауриновой и миристиновой жирных кислот в составе общих липидов лимфоцитов крови. Результаты этих исследований показывают, что при колиэнтеротоксемии в лимфоцитах поросят происходит угнетение элонгации полиненасыщенных жирных кислот и значительное повышение содержания свободного холестерола.
Указанные изменения показателей состояния липидного комплекса лимфоцитов крови поросят при заболевании колиэнтеротоксемией позволяют объяснить выявленное нами снижение функциональной активности лимфоцитов [21]. Исходя из этого логично предположить, что жирнокислотный состав фосфолипидов мембран лимфоцитов, как основного матричного компонента, в которых происходит большинство иммунологических реакций, может определять индивидуальную реактивность клеток.
В целом полученные результаты исследований свидетельствуют о наличии связи между жирнокислотным составом лимфоцитов и их функциональной активностью при заболевании поросят колиэнтеро-токсемией. Установленые закономерности обосновывают необходимость коррегирующего влияния на липидный состав иммунокомпе-тентных клеток у больных колиэнтеротоксемией поросят в целях обеспечения условий для клеточной авторегенерации и дальнейшей реабилитации иммунной системы в целом.
Заключение. При заболевании поросят колиэнтеротоксемией в липидах лимфоцитов крови достоверно уменьшается количество арахидо-новой кислоты и свободного холестерола и увеличивается содержание лауриновой и миристиновой кислот, гидроперекисей липидов и ТБК-активных продуктов, что свидетельствует о ингибирующем влиянии токсинов эшерихий на активность антиоксидантной системы в их организме.
ЛИТЕРАТУРА
1. Петров, М. Ветеринарна медицина Укра1ни / М. Петров. - Ки1в, 2003. - № 5. -С. 35-36.
2. Каришева, А.Ф. Спещальна ешзоотолопя / А.Ф. Каришева. - Ки1в, Вища освгта, 2002. - С. 392-400.
3. Чумаченко, В.В. Показники перекисного окиснення лiпiдiв i системи антиок-сидантного захисту в свиней при стреа / В.В. Чумаченко // Ветеринарна медицина Украни. - 2004. - № 11. - С. 16-18.
4. Данчук, В.В. Пероксидне окиснення у сшьськогосподарських тварин i птищ / В.В. Данчук. - Кам'янець-Подшьський, 2006. - 191 с.
5. Извекова, В.А. Липиды мембран и функции иммунокомпонентных клеток в патологии / В.А. Извекова // Успехи соврем. биолог. - 1991. - Т. 3. - Вып. 4. - С. 577-591.
6. Стан лшщного комплексу мембран лiмфоцитiв при запальному процес у свиней / В.Г. Квачов, Т.О. Сокирко, В. Герега, О.1. Вщур / Наук. вюник Львiвськоl держ. акад. вет. медицини. - 2000. - Т. 2. - № 2. - Ч. 1. - С. 76-78.
7. Bozza, P.T. Mechanisms of leukocyte lipid body formation and function in inflammation / P. Bozza, C.B. Melo // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. - Rio de Janeiro, 2005. -Vol. 100. - P. 113-120.
8. The surface of lipid droplets is a phospholipid monolayer with a unique fatty acid composition / K. Tauchi-Sato, S. Ozeki, T. Houjou [et al.] // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. -№ 46. - P. 44507-44512.
9. Yaqoob, P. Lipids and the immune response: from molecular mechanisms to clinical applications / P. Yaqoob // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. - 2003. - Vol. 6. - P. 133-150.
10. Horrocks, L.A. Docosahexaenoic acid in the diet: its importance in maintenance and restoration of neural membrane function / L.A. Horrocks, A.A. Farooqui // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. - 2004. - Vol. 70. - P. 361-372.
11. Effect of dietary enrichment with n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) or n-9 PUFA on arachidonate metabolism in vivo and experimentally induced inflammation in mice / M. Doshi, S. Watanabe, T. Niimoto [et al.] // Biol. Pharm. Bull. - 2004. - Vol. 27. - № 3. -P. 319-323.
12. Das, U.N. Essential fatty acids and their metabolites could function as endogenous HMG-CoA reductase and ACE enzyme inhibitors, anti-arrhythmic, anti-hypertensive, anti-atherosclerotic, anti-inflammatory, cytoprotective, and cardioprotective molecules / U.N. Das // Lipids in Health and Disease. - 2008. - Vol. 7. - P. 37-54.
13. Calder, P.C. Long-chain polyunsaturated fatty acids and inflammation / P.C. Cal-der // Scandinavian J. Food Nutr. - 2006. - Vol. 50. - P. 54-61.
14. Das, U.N. Essential fatty acids and their metabolites could function as endogenous HMG-CoA reductase and ACE enzyme inhibitors, anti-arrhythmic, anti-hypertensive, anti-atherosclerotic, anti-inflammatory, cytoprotective, and cardioprotective molecules / U.N. Das // Lipids in Health and Disease. - 2008. - Vol. 7. - P. 37-54.
15. Afonina , G.B. Intern. Symp. on Chromatography, 17-th. Abstract / V.G. Bordonos , T.S. Bryuzgina. - 1988. - Vol. 1. - P. 125.
16. Ichihara, K. An improved method for rapid analysis of the fatty acids of glycer-olipids / K. Ichihara, A. Shibahara, K. Yamamoto [et al.] // Lipids. - 1996. - Vol. 31. - № 5. -P. 535-539.
17. Cert, A. Methods of preparation of fatty acid methyl esters (FAME). Statistical assesment of the precision characteristics from a collaborative trial / A. Cert, W. Moreda, M. C. Pérez-Camino // Grasas y Aceites. - 2000. - Vol. 51. - № 6. - P. 447-456.
18. Shaikh, S.R. Immunosuppressive effects of polyunsaturated fatty acids on antigen presentation by human leukocyte antigen class I molecules / S.R. Shaikh, M. Edidin // J. Lipid Res. - 2007. - Vol. 48. - P. 127-138.
19. Smith, C.W. Diet and leukocytes / C.W. Smith // Am. J. Clin. Nutr. - 2007. -Vol. 86. - P. 1257-1258.
20. Цитокины как средства ранней патогенетической терапии радиационных поражений. Эффективность и механизм действия / В.И. Легеза, Н.Г. Чигарева, Ю.А. Абдуль, И.Ш. Галеев // Радиац. биол., радиоэкол. - 2000. - Т. 40. - № 4. - С. 420-424.
21. Рацький, М.1. Формування клггинного iмунiтету у поросят за умов колiенте-ротоксемп / М.1. Рацький // Наук.-техн. бюл. 1н-ту бюлогл тварин i ДНДК1 ветпрепара-пв та кормових добавок. - Львiв, 2009. - Вип. 10. - № 1-2. - С. 408-411.
