CC BY
44
УДК 581.143.6:631.53.027.34
интеграция световой обработки в технологию получения дигаплоидов озимой пшеницы
С.В. КЛИЦОВ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: bivalent@yandex.ru) О.В. ПОПОВА, младший научный сотрудник Ю.В. ТРУСОВ, младший научный сотрудник Московский научно-исследовательский институт сельского хозяйства «Немчиновка», ул. Калинина, 1, пос. Новоивановское, Одинцовский р-н, Московская обл., 143026, Российская Федерация
Резюме. Целью работы было исследование действия комплексной световой обработки при 24 ч световом дне и 25°С на индукцию эмбриогенеза в культуре пыльников гибридов F1 озимой пшеницы и на гиногенез при методе гаплопродюсера. Для комплексного освещения брали лампы Gro-lux и Coralstar. Через 30 дн. при комплексном освещении растения переносили на 16 ч световой день. Пыльники с одноядерной пыльцой вычленяли, переносили на среду NPB-99 под комплексное освещение до появления эмбриоидов. Их пересевали на среду 190-2 и выращивали при 16 ч световом дне, затем регенеранты пересевали на ростовую среду при техже условиях. Развитые регенеранты обрабатывали 6 ч 0,3% раствором колхицина. При использовании метода гаплопродюсера через 2 дн. после кастрации цветки опыляли кукурузой, обрабатывали 2,4-Д (100 мг/л) и помещали под комплексное освещение. На 16-й день вычленяли зародыши и переносили на среду 190-2. Регенеранты высаживали в сосуды и помещали на 20 дн. в такие же условия, затем на 16 ч световой день до получения зерновок. В контроле обоих опытов был 16 ч световой день. Методом культуры пыльников получено 69 дигаплоидов при комплексной световой обработке и 22 дигаплоида в контроле: число дигаплоидов в тестовом варианте в 3,1 раза больше. Методом гаплопродюсера получено 43 дигаплоида при комплексной световой обработке и 13 дигаплоидов в контроле. При эмбриогенезе в культуре пыльников со световой обработкой получено 563 эмбриоида, в контроле - 352. Методом гаплопродюсера получено 128 и 120 эмбриоидов соответственно. Световая обработка повышает выход дигаплоидов при обоих методах в 3 раза, максимальный эффект отмечен при индукции эмбриогенеза в культуре пыльников. Ключевые слова: дигаплоиды, свет, гаплоидный эмбриогенез, яровизация.
Для цитирования: Клицов С.В., Попова О.В., Трусов Ю.В. Интеграция световой обработки в технологию получения дигаплоидов озимой пшеницы //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 12. С. 27-29.
Дигаплоиды озимой пшеницы получают методом культуры изолированных пыльников, микроспор и методом гаплопродюсера на основе гибридов F1. В первом случае используют андрогенез изолированных пыльников и микроспор на индукционной питательной среде. Во втором методе уже при первом делении зиготы происходит полная элиминация всех хромосом гаплопродюсера, а его ядерный материал находится в клетках зародыша в виде микроядер [1 -3]. Установлено, что это происходит из-за отсутствия контакта кинетохоров с микротрубочками веретена деления [4]. В обоих методах для индукции развития гаплоидных зародышей пшеницы и других злаков используют «холодовую предобработку»: колосья в сосуде ставят в холодильник на 5-26 дн. при температуре 4-6°С [5]. Такой предобработке отдает предпочтение большинство исследователей, однако используют и другие стрессовые воздействия. Общеизвестно, что пониженная плюсовая температура обеспечивает яровизацию озимых растений, после которой они переходят к генеративному развитию.
Целью работы было исследовать действие комплексной световой обработки при 24 ч световом дне и 25°С на индукцию эмбриогенеза в культуре пыльников
гибридов F1 озимой пшеницы и на гиногенез при методе гаплопродюсера.
Условия, материалы и методы. Работу проводили в 2014-2015 гг. в Московском НИИСХ «Немчиновка». Для активации эмбриогенеза и яровизации ослабленных растений дигаплоидных регенерантов озимой пшеницы Я1 стрессовое воздействие пониженной положительной температурой было заменено на световое. Учитывая, что даже 15-минутное ультрафиолетовое облучение воздействует на перекисное окисление липидов и на антиоксидантную си-стемуу злаков и приводит к резкому повышению активности оксидоредуктаз в зародыше и щитке [6], для стрессовой световой обработки выбран менее жесткий синий свет.
Исходным материалом служили зерновки 10 гибридных комбинаций F1 озимой пшеницы: 1) КП689 х Памяти Федина; 2) КП616 х Немчиновская 57; 3) КП599 х Памяти Федина; 4) КП592 х Московская 39; 5) КС28 х Московская 56; 6) КС30 х Московская 56; 7) КС 98 х Московская 56; 8) КС178 х Памяти Федина; 9) КС273 х Памяти Федина; 10) КП595 х Памяти Федина; предоставленные лабораторией селекции озимой пшеницы Московского НИИСХ «Немчиновка». Зерновки гибридов озимой пшеницы F1 проращивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при 20°С в термостате 2 сут. Наклюнувшиеся зерновки высаживали по 2 шт. в сосуд. Для варианта опыта использовали по 5 сосудов. Зерновки высаживали в вегетационные сосуды с проавтоклавированной почвой и помещали на световой стол с 24 ч комплексным освещением лампами Сильвания: половиналамп Ого-1их, половина - Сога^аг (пики излучения в диапазоне 380-470 нм - около 93% и 365 нм - около 7% мощности ламп) при 25°С. Через 30 дн. использовали только лампы ОгсНих при 16 ч световом дне до выхода в трубку. Затем растения, используемые для андрогенного эмбриогенеза, снова ставили на световой стол с 24 ч комплексным освещением и при выходе колоса из трубки делали временные давленые препараты пыльников в 45% уксусной кислоте, окрашенных ацетокармином. Стадию развития микроспор в центральном цветке колоска, расположенного посередине колоса, определяли на световом микроскопе МБИ с использованием фазового контраста. Отмечали микроспоры с сочетанием трех признаков: одно ядро, ярко выраженная пора, структурированные утолщения экзины. Колосья с пыльниками на стадии одноядерной пыльцы в ламинарном боксе стерилизовали 96%-ным этанолом, препарировали бутоны, вычленяли пыльники и помещали в пробирки с модифицированной индукционной средой NPB-99 [7] (табл. 1). Пробирки с пыльниками ставили на световой стол с комплексным освещением до появления эмбриоидов. Их пересевали на модифицированную реге-нерационную среду 190-2 (см. табл. 1) и выращивали при 16 ч световом дне, лампы ОгсНих, до появления развитой корневой системы более 1 см. Затем пересевали регене-ранты на ростовую среду N6 (см. табл. 1), 16 ч световой день, лампы ОгсНих. Хорошо развитые гаплоидные регенеранты для восстановления диплоидного набора извлекали из пробирок, тщательно отмывали корневую систему от агар-агара и погружали корни с точкой роста на 6 ч в водный раствор колхицина 0,3% в 2% растворе диметилсульфоксида с добавлением 0,03% папаина. Обработанные регенеранты отмывали 16 ч в проточной воде, затем высаживали в вегетационные сосуды с проавтоклавированной почвой и помещали под комплексное освещение синим светом 24 ч
Таблица 1. Модифицированные среды для культивирования пыльников, регенерантов и гаплоидных зародышей
Реактив
Индукционная NPB-99, мг/л
Регенераци-онная 190-2, мг/л
Ростовая N6, мг/л
3/2 "4H2°
(NH4)2SO4 KNO3 KHPO4 MgSO'7H2O CaCl-2H„ O Ca(NQ KCl MnSO4H2O MnSO'4H,O CoCl26H2O KI
ZnSO47H2O H3BO3
Na2Mo 0/2H2D CuSO'5H2O FeNa2EDTA2H2O Na2EDTA2H2O FeS047H20 Глицин Глутамин Тиамин HCl Пиридоксин Никотинамид Никотиновая кислота 2,4-Д Кинетин Сахароза Мальтоза Мио-инозитол НУК
Фитогель
Агар-агар
Активированный
уголь
Биотин
Пантотенат кальция
Убихинон Цианокобаламин Тетрагидрофо-лиевая кислота
232 1415 200 93 83
5 5
0,0125 0,4 5 5
0,0125 0,0125
37,3 27,8 2
1500 5
0,5
0,5 0,2 0,2
60 100 1
5000
0,2
0,2 0,5 10
2
200 1000 300 200
70 40
0,5 3 3
0,5
37,3 27,8 2
1000 1
0,5 0,5
0,5 30000
100 0,5 4000
0,5
463 2830 400 185 166
4.4
0,8
1.5
1.6
40
2 160 1
0,5 0,5
20000
7000 2000
0,5
стол с комплексным освещением синим светом 24 ч при 25°С для получения прояровизированных регенерантов. Образцы с хорошо развитой корневой системой высаживали в вегетационные сосуды с проавтоклавированной почвой и помещали на 20 дн. на световой стол с комплексным освещением с синим светом при 25°С. После этого выращивали регенеранты при 16 ч световом дне, лампы ОгсНих, до получения зрелых зерновок. Для контроля использовали только 16 ч световой день, лампы ОгсНих.
Все питательные среды готовили на воде высокой степени очистки. Кислотность среды проверяли перед соединением с фитогелем или агар-агаром лакмусовой бумагой и автоклавировали 20 мин. при 0,7-0,9 атм.
результаты и обсуждение. Сравнение результатов комплексной световой обработки гибридных растений перед культивированием пыльников и в течение их выращивания на индукционной среде с контрольными образцами показало, что разные генотипы с хорошо выраженными отличиями по эмбриогенному потенциалу в культуре пыльников проявили их и в опыте, и в контроле (табл. 2). В то же время комплексная световая обработка значительно повысила выход эмбриоидов и регенерантов у всех образцов с отзывчивыми генотипами [8], которые дали гаплоидные эмбриоиды в культуре пыльников. Потери при получении регенерантов из эмбриоидов на регенерационной среде обусловлены неизбежными механическими травмами, термическим и токсическим воздействием при стерилизации и пересадке эмбриоидов. Значительная доля регенерантов погибает при удвоении гаплоидного набора хромосом и при обработке колхицином. При этом соотношение полученных в опыте и контроле эмбриоидов, регенерантов и дигаплоидов точно отражает разницу между отзывчивыми генотипами разного происхождения и эффективность комплексной световой обработки с синим светом при 24 ч освещении.
Таблица 2. Гаплоидные зародыши, регенеранты и дигаплоиды по гибридным комбинациям F1 озимой пшеницы, полученные методом культуры пыльников, шт.
при 25°С. Через 30 дн. освещение меняли на 16 ч световой день только лампами ОгсНих до колошения и получения семян. В качестве контроля использовали 16 ч световой день, лампы ОгсНих и холодовую предобработку колосьев при 6°С в течение 7 дн. в 0,5 М растворе маннитола.
Для метода гаплопродюсера в колосьях, вышедших из трубки, проверяли стадию развития цветков, цветки с несозревшими пыльниками кастрировали и закрывали изоляторами. Через 2 дн. опыляли кастрированные цветки пыльцой кукурузы линии 935/86 селекции Краснодарского НИИСХ. После опыления проводили трехкратную обработку колосьев водным раствором 2,4-Д (100 мг/л). Сосуды с обработанными колосьями помещали на световой стол с комплексным освещением с синим светом 24 ч при 25°С. На 16-й день после опыления полученные завязи с гаплоидными зародышами и без эндосперма вынимали из колоса, помещали в марлевые мешочки и дважды стерилизовали. Сначала в 70%-ном этаноле в течение 30 с с последующей трехкратной промывкой в стерильной воде, затем 30 с в растворе «Белизна» с последующей пятикратной промывкой в стерильной воде. Завязи препарировали в ламинаре, извлекали гаплоидные зародыши и переносили их на модифицированную среду 190-2 (см. табл. 1). Пробирки с зародышами помещали на световой
Гибрид- Эмбриоиды Регенеранты Дигаплоиды
ная ком- кон- кон- кон-
бинация опыт троль опыт троль опыт троль
1 234 150 110 76 28 6
2 38 21 27 9 5 2
3 29 19 12 5 3 0
4 57 32 45 14 7 3
5 69 48 51 19 9 5
8 92 60 63 35 10 5
10 44 22 27 6 7 1
Всего 563 352 335 164 69 22
Результаты при эмбриогенезе методом гаплопро-дюсера (табл. 3) показывают, что заметного эффекта как на активацию первоначальных делений яйцеклетки, приводящих к образованию эмбриоида, так и на дальнейшее развитие эмбриокультуры и формирование гаплоидного зародыша, а затем регенеранта, комплексная световая обработка не оказывает. Число эмбриоидов и регенерантов, их соотношение у комбинаций с разными генотипами прямо указывает на меньшую зависимость эмбриогенеза при данном способе от отзывчивости генотипа [8], по сравнению с методом культуры изолированных пыльников. Также эти результаты показывают, что эмбриоиды, полученные методом гаплопродюсера, значительно превосходят формы андрогенного происхождения по жизнеспособности и по морфогенетиче-скому потенциалу, но уступают по численности.
Стрессовые обработки температурой, прежде всего, холодовая предобработка в сочетании с выдерживанием
Таблица 3. Гаплоидные зародыши, регенеранты и дигаплоиды по гибридным комбинациям F1 озимой пшеницы, полученные методом гаплопродюсера, шт.
Гибрид- Эмбриоиды Регене ранты Дигаплоиды
ная ком- опыт кон- опыт кон- опыт кон-
бинация троль троль троль
1 19 15 11 5 4 1
2 14 16 13 9 5 2
3 20 18 10 6 6 2
4 19 20 12 14 7 3
5 15 14 11 8 6 0
8 29 27 21 20 11 5
10 12 10 8 5 4 0
Всего 128 120 86 67 43 13
в растворе маннитола для осмотического шока широко используется для индукции эмбриогенеза при получении дигаплоидов злаков, мягкой пшеницы в частности, методом культуры изолированных пыльников или микроспор [5]. Однако часто положительного эффекта нет. В таких случаях получают лучший выход эмбриоидов и морфогенных каллусов без всякой предобработки [9]. Первоначально комплексная световая обработка синим светом в течение 24 ч использовалась как недорогой, круглогодично доступный альтернативный метод стандартной процедуры яровизации пониженной плюсовой температурой; потерь дигаплоидов при этом практически не было. Затем с успехом использовали его для яровизации созревающих зерновок в колосе и предобработки колосьев при гаплоидном эмбриогенезе -как альтернативу холодовой предобработки. Хотя точный
механизм всего процесса яровизации, как и активации эмбриогенеза, не известен, появились данные прямо указывающие на то, что в случае светового воздействия на зеленые растения оно регулирует альтернативный сплайсинг многих ядерных генов путем обратной регуляции. Эта регуляция происходит с помощью окисленных и восстановленных форм пластохинона, которые выходят через мембрану тилакоидов [10]. Если ранее считали, что у растений альтернативный сплайсинг практически отсутствует [11], то сейчас признано, что пластохинон регулирует альтернативный сплайсинг многих ядерных генов и этим обеспечивает пластичность и быструю приспособляемость растений к меняющимся условиям окружающей среды [12].
выводы. Комплексная световая обработка синим светом 24 ч в технологии получения дигаплоидов мягкой пшеницы, как методом андрогенеза, так и методом гаплопродюсера, позволяет успешно проводить яровизацию регенерантов, ослабленных токсичным воздействием колхицина при удвоении хромосомного набора практически без потерь. При андрогенном эмбриогенезе данная обработка значительно повышает выход эмбриоидов, морфогенных каллусов, регенерантов и дигаплоидов. Заметной активации гиногенеза при методе гаплопродюсера комплексная световая обработка не вызывает. Наиболее вероятным механизмом действия использованной световой обработки является альтернативный сплайсинг ядерных генов путем обратной регуляции через окисленные и восстановленные формы пластохинона.
Литература.
1. Wedzony M., Lammeren van, A.A.M. Pollen Tube Growth and early embryogenesis in wheatx maize crosses influenced by 2.4-D// Annals of Botany. 1996. No 77. Pp. 639-647.
2. Laurie D.A., Bennet M.D. The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses // Theoretical and applied genetics. 1988. No 76. Pp. 393-397.
3. Laurie D.A., Bennet M.D. The timing of chromosome elimination in hexaploid wheat x maize crosses// Genome. 1989. No 32. Pp. 953-961.
4. Mochida K., Tsujimoto H., Sasakuma T. Confocal analysis of chromosome behavior in wheat x maize zygotes // Genome. 2004. No 47. Pp. 199-205.
5. Jauhar Prem P, Xu S.S., Baenziger P.S. Haploidy in cultivated wheats: induction and utility in basic and applied research // Crop Science. 2009. No 49. Pp. 737-755.
6. Верхотуров В.В. Физиолого-биохимические процессы в зерновках ячменя и пшеницы при их хранении, прорастании и переработке: дис.... докт. биол. наук. Москва, 2008. 361 с.
7. Doubled haploid production in crop plants: a manual / M. Maluszynski, K.J. Kasha, B.P. Forster, I. Szarejko. Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 2003. 427 p.
8. Орлов П.А. Клеточные и генно-инженерные технологии модификации растений. Минск: Тонпик, 2006. 248 с.
9. Efficient embryogenesis and regeneration in freshly isolated and cultured wheat (Triticum aestivum L.) microspores without stress pretreatment / Shariatpanahi M.E., Belogradova K., Hessamvaziri L., Heberle-Bors E., TouraevA. // Plant Cell Report. 2006. No 25. Pp. 1294-1299.
10. A chloroplast retrograde signal regulates nuclear alternative splicing / Petrillo E., Herz M.A.G., Fuchs A., et al. // Science. 2014. Vol. 25. No 344. Pp. 427-430.
11. Keren H., Lev-Maor G., Ast G. Alternative splicing and evolution: diversification, exon definition and function//Nature Reviews Genetics. 2010. No 11. Pp. 345-355.
12. Jung H.-S., Mockler T.C. A new alternative in plant retrograde signaling // Genome Biology. 2014. No 15:117. P. 3.
INTEGRATION OF LIGHT TREATMENT IN PRODuCTION TECHNOLOGY OF DIHAPLOIDS
OF WINTER WHEAT
S.V. Klitsov, O.V. Popova, Yu.V. Trusov
Moscow Research Institute of Agriculture "Nemchinovka", ul. Kalinina, 1, pos. Novoivanovskoe, Odintsovsky r-n, Moskovskaya obl., 143026, Russian Federation
Summary. The aim of this study was to investigate the effect of the integrated light treatment at 24 h photoperiod and 25 degrees on the induction of embryogenesis in anther culture of F1 hybrids of winter wheat and on gynogenesis at chromosome elimination method. For complex lighting we use Gro-lux and Coralstar lamps. In 30 d ays at complex lighting plants were transferred to 16-hour daylight. Anthers with mononuclear pollen were transferred on NPB- 99 medium with complex lighting until embryogenesis. We reseeded embryoids on a medium 190-2 and grew them at 16-hour photoperiod, and then regenerants were reseeded onto growth medium under the same conditions. Developed regenerants were treated during 6 h by solution of 0.3% colchicine. In the chromosome elimination method 2 days after castration of the flowers, they were pollinated by maize and treated with 2.4-D (100 mg/l) and placed under illumination systems. On the l6th day embryoids were isolated and transferred to 190-2 medium under complex lighting. Regenerants were planted in containers and placed for 20 days under lighting systems, then for 16-hour daylight to obtain grains. In control experiments, it was 16-hour daylight. In anther culture method with integrated light treatment we received 69 dihaploids and 22 dihaploids in the control; the number of dihaploids was 3.1 times more. Bythe integrated light treatment chromosome elimination method we received 43 dihaploids and 13 dihaploids in the control. During embryogenesis in anther culture with the light treatment we received 563 embryoids, in the control-352 ones. Bythe chromosome elimination method we obtained 128 and 120 embryoids, respectively. Lighttreatment increases the dihaploid yield in both methods 3 times, the maximum effect was observed in the induction of embryogenesis in the anther culture . Keywords: dihaploids, light, haploid embryogenesis, vernalization.
Author Details: S.V. Klitsov, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: bivalent@yandex.ru); O.V. Popova, junior research fellow; Yu.V. Trusov, junior research fellow.
For citation: Klitsov S.V., Popova O.V., Trusov Yu.V. Integration of Light Treatment in Production Technology of Dihaploids of Winter Wheat. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. Vol. 29. No 12. Pp. 27-29 (in Russ.).
