CC BY
91
УДК 633.491:631.527 + 573
индукция эмбриоидогенеза в культуре изолированных микроспор тетраплоидного
сорта картофеля (зоьлыии тивЕкозии ь.) невский
Л.И. ТИХОМИРОВА, кандидат биологических наук, зав. отделом (e-mail: L-tichomirova@yandex.ru)
Алтайский государственный университет, просп. Ленина, 61, Барнаул, 656049, Российская Федерация
Резюме. Широкие перспективы использования форм картофеля с редуцированным числом хромосом (дигаплоидов и моноплои-дов) связывают с развитием селекции на основе отдалённой гибридизации, а также с возможностью отбора селекционно ценньх генотипов с помощью молекулярных маркеров. Метод культуры микроспор in vitro - один из способов получения удвоенных гаплоидов (DH (double haploid)-линий). Он основан на использовании биологического феномена андроклинии или андрогенеза in vitro, при котором гаплоидные клетки микроспор развиваются по спорофитному пути в зародышеподобные структуры - эмбриоиды и далее в растения-регенеранты, содержащие половинный набор хромосом. Цель наших исследований - разработка методики введения в культуру микроспор и определение эффективности индукции эмбриоидогенеза у сорта картофеля (Solanum tuberosum L.) Невский. За основу при разработке методики был взят протокол культивирования пшеницы. Проведена предобработка холодом нераскрывшихся бутонов. В нашем эксперименте использование бытового блендера позволяло высвободить и сохранить жизнеспособными до 95% микроспор. На момент изоляции обнаружены 2-4% двуядерных микроспор с равными ядрами. Также наблюдали атипичное развитие микроспор на стадии тетрад, где происходило деление ядер. Интенсивный рост многоклеточных новообразований вызывал растяжение и разрыв оболочки микроспоры. К11 суткам появлялись эмбриоиды. Помимо одиночных зародышеподобных структур, в суспензии микроспор картофеля на 11-12 сутки, наблюдали конгломераты эмбриоидов. По аналогии с пшеницей их называли полиэмбриоиды. Частота формирования эмбриоидов (одиночных зародышеподобных структур) и частота образования полиэмбриоидов в опыте составила 1-0,5%. Процессов каллусообразования при формировании эмбиоидных структур не наблюдали. Успех при культивировании микроспор картофеля сорта Невский указывает на необходимость продолжения работы по оптимизации технологии и получению зелёных растений-регенерантов.
Ключевые слова: картофель, культура изолированных микроспор, эмбриоидогенез, дигаплоиды, проэмбрио. Для цитирования: Тихомирова Л.И. Индукция эмбриоидогенеза в культуре изолированных микроспор тетраплоидного сорта картофеля (Solanum tuberosum L.) Невский //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т.30. №10. С. 9-11.
Важный метод хромосомной инженерии, повышающий эффективность селекции растений, - гаплоидия -получение особей с одинарным набором хромосом. Культурный картофель Solanum tuberosum L. (2n = 4x = 48) - автотетраплоид, в котором представлены четыре гомологичных генома с 12 хромосомами каждый. В отношении большинства таксонов растений гаплоидами принято называть спорофиты с гаметическим числом хромосом. Однако гаплоиды, полученные на основе тетраплоидного картофеля, имеют двойной набор гомологичных хромосом (2n = 2х = 24), поэтому их называют дигаплоидами [1].
Первый в мире полигаплоид (дигаплоид S. tuberosum, 2n = 24) был получен в Советском Союзе Е.В. Ивановской в 1939 г. при опылении S. tuberosum (2n=48) пыльцой S. rybinii (2n = 2А) [2]. Сегодня для редукции числа хромосом картофеля применяют два подхода, в основе которых лежит использование явления развития спорофита из половых клеток. Первый способ - развитие спорофита из неоплодотворенных яйцеклеток (гиногенез) при
опылении S. tuberosum пыльцой других видов картофеля (как правило, S. phureja). Значительный прорыв в создании эффективных клонов-гаплопродюсеров S. phureja произошел, когда были выведены формы, сочетающие высокую гаплопродуцирующую способность с гомозиготным состоянием гена (BdBd). Второй имеет целью получение андрогенетических растений-регенерантов путем индукции морфогенеза в культуре in vitro изолированных пыльников или микроспор [1, 3].
Широкие перспективы использования форм картофеля с редуцированным числом хромосом (дигаплоидов и моноплоидов) связывают с развитием селекции, основанной на возможности отбора ценных генотипов с помощью молекулярных маркеров [4].
Получение DH-линий (double haploid) сельскохозяйственных растений с помощью таких биотехнологических методов, как культура микроспор, широко востребовано селекционными компаниями развитых стран. Для распространения DH-технологий в селекции необходимы надежные и недорогие протоколы культуры клеток. Несмотря на то, что в получении гаплоидов некоторых видов растений достигнуты большие успехи, тем не менее, существует множество факторов, которые могут способствовать улучшению и оптимизации DH-технологий. Необходимо более глубокое фундаментальное понимание процессов индукции эмбриогенеза микроспор и развития гаплоидных растений, которое будет обеспечивать высокую эффективность получения DH-линий у высокоотзывчивых генотипов и сокращать число неотзывчивых сортообраз-цов. Чем больше микроспор будет вовлечено в эмбриогенез, тем большее разнообразие новых генотипов станет доступно селекционеру [5].
Цель наших исследований - разработка методики введения в культуру микроспор и определение эффективности индукции эмбриоидогенеза у сорта картофеля (Solanum tuberosum L.) Невский.
Условия, материалы и методы. Работу проводили в Отделе биотехнологии растений Южно-Сибирского ботанического сада ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный университет». Объектом исследования служил отечественный сорт картофеля Невский.
В исследованиях использовали метод культуры изолированных микроспор, основанный на применении биологического феномена андроклинии или андрогенеза in vitro, при котором гаплоидные клетки микроспор развиваются по спорофитному пути в зародышеподобные структуры - эмбриоиды и далее в растения-регенеранты, содержащие половинный набор хромосом.
Цветки собирали в поле в фазе бутонизации и для предварительной обработки низкими температурами помещали на 4 суток в холодильник при 4-50 С. Растительный материал стерилизовали 1%-ным раствором сульфохлорантина в течение 10 мин, далее трёхкратно промывали стерильной дистиллированной водой. Для выделения пыльников использовали бутоны длиной 5,07,0 мм. В литературе по культуре микроспор пшеницы описано, по крайней мере, четыре различных подхода для осуществления изоляции микроспор: естественный выход из пыльников, с помощью магнитной мешалки, мацерация и смешивание [6]. Для картофеля использование этих
методов также возможно. Мы высвобождали микроспоры из пыльников бытовым блендером в жидкой питательной среде в течение 1,5 мин. Выделяли 100 пыльников и разбивали в 100 мл жидкой питательной среды.
В литературных источниках для культуры пшеницы указывают, что для достижения наилучших результатов, после освобождения микроспоры должны быть отделены от нежизнеспособных клеток, отмерших тканей и клеточных обломков путем фильтрации и / или центрифугирования [7]. В нашем эксперименте суспензию микроспор фильтровали и в объёме 20,0 мл наслаивали на твёрдые агаровые среды во флаконы и пластиковые контейнеры. В жидкую питательную среду на основе прописи Мурасиге-Скуга (MS) добавляли 500 мг/л L-глютмина, 1 мкМ кинетина, 1 мкМ 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота). Твёрдые среды готовили также на основе MS с 1-4 мкМ БПА (6-бензиламинопурин).
Осмотическое давление в среде - критический фактор для развития эмбриоида in vitro. Сахарозу используют в культуре растительных клеток in vitro как источник углеводов и регулятор осмотического давления. Обычно высокое осмотическое давление требуется для эмбриоида на ранних стадиях развития (48 ч), а на поздних стадиях оно должно быть более низким. Сахароза в высоких концентрациях может действовать как осмотический стрессор, с другой стороны, она необходима для формирования эмбриоидов. В нашем эксперименте жидкие среды содержали 9% сахарозы. В агаровые среды её добавляли в количестве 3%.
Культивировали в термостате при температуре 26-270 С, в темноте.
Цитологические исследования проводили каждые 3 суток культивирования. Для этого брали 100 мкл суспензии микроспор, препараты окрашивали ацетокармином, изучали 200 микроспор с одного стекла.
Результаты и обсуждение. Использование блендера для изолирования микроспор позволяло высвободить и сохранить жизнеспособными до 95% микроспор. Следует иметь ввиду, что процедура их выделения должна быть максимально короткой по времени, так как любая задержка или хранение бутонов, следующая за предварительной обработкой, приводит к быстрому снижению жизнеспособности микроспор, независимо от температуры, использованной для хранения. Микроспоры, выделенные с помощью блендера, как правило, имеют меньше травм, более высокий эмбрио-генетический потенциал и воспроизводимость, чем те, которые получены путем мацерации. Однако изоляция с помощью блендера может также привести к повреждению микроспор, особенно когда скорость смешивания и время не оптимизированы. Параметры смешивания зависят от количества пыльников в блендер-чашке, прочности ткани, окружающей пыльники, и соотношения объёма жидкой среды и твёрдых тканей.
На момент изоляции микроспор отмечали следующие стадии развития: тетрады, распавшиеся тетрады на монады, ранние, средние и поздние (сильно вакуолизи-рованные) микроспоры. Двух и трёх клеточную пыльцу не обнаруживали. В поле зрения микроскопа 2-4% микроспор
имели атипичное строение. Среди средних и поздних микроспор обнаружены двуядерные. В результате серии делений формировались многоклеточные структуры, которые находились внутри оболочки микроспоры (рис. 1).
Рис. 1. Формирование атипичных микроспор на разных этапах развития.
По мнению J.M. Dunwell и N. БипсЫапс! для реализации андрогенетического потенциала растений картофеля не менее важен, чем факторы питательной среды, правильный выбор стадии развития микроспор при эксплантации. Учёные считают, что для картофеля оптимальная фаза эксплантации приходится на период между выходом микроспор из тетрад и первым пыльцевым митозом (стадия поздней сильно вакуолизированной микроспоры) [8].
Мы в своих опытах также наблюдали атипичное развитие микроспор на стадии тетрад, когда происходило деление ядер (рис. 2).
Рис. 2. Атипичное развитие микроспор картофеля на стадии тетрад.
У пшеницы деления в микроспоре начинаются в первые 14-20 ч, а многоклеточные структуры появляются в течение 1 недели. Проэмбрио начинают выходить из оболочки микроспоры на 10-14 день. Зрелые эмбриои-ды (>2 мм) можно наблюдать через 28 дней [9, 10].
Интенсивный рост многоклеточных новообразований картофеля в наших исследованиях вызывал растяжение и разрыв оболочки микроспоры. К 11 суткам появлялись эмбриоиды.
Как было показано рядом исследователей, в изолированных микроспорах основные морфогенетические процессы затухают очень скоро после распада тетрады [11]. По нашему мнению, в искусственных условиях под действием внешних факторов очень велика вероятность переключения программы развития микроспоры на стадии монады на прямое формирование из неё нового растения. Мы склоняемся к гипотезе о том, что инициальными клетками эмбриоидов тетраплоидного сорта картофеля Невский в период до 11-12 суток послужили монады (рис. 3).
Рис. 3. Этапы развития микроспоры картофеля при формировании эмбриоидов и полиэмбриоидов: а) тетрада микроспор картофеля с делящимися монадами, б) многоклеточная монада, в) ргеетЬгуо^в на 7 сутки культивирования, г, д) эмбриоиды на 11 сутки культивирования, ж) полиэмбриоид на 11-12 сутки культивирования.
Помимо одиночных зародышеподобных структур, в суспензии микроспор картофеля на 11-12 сутки были отмечены конгломераты эмбриоидов. По аналогии с пшеницей мы называли их полиэмбриоиды [12].
Объяснением появления полиэмбриоидов могут быть следующие гипотезы:
гаплоидные монады не разошлись, и из каждой развивался эмбриоид;
материнская клетка микроспор в результате нарушений в мейозе, развилась в полиэмбриоид.
По мнению ряда исследователей, одна из важных особенностей культуры пыльников картофеля - относительно высокий уровень цитогенетической нестабильности растений-регенерантов. В культуре пыльников и микроспор картофеля получают растения-регенеранты не только с редуцированным числом хромосом, но и с плоидностью, характерной для растений - доноров пыльников и даже более высокого уровня [1]. Полиэмбриоиды, по нашему мнению, могли быть источниками таких растений.
Частота образования эмбриоидов (одиночных зародышеподобных структур) и полиэмбриоидов в опыте составила 1-0,5%. Процессов каллусообразования при формировании эмбриоидных структур мы не наблюдали.
Выводы. В результате проведенных исследований разработана методика введения в культуру микроспор картофеля сорта Невский.
На 11 сутки культивирования микроспор получены зародышеподобные структуры - эмбриоиды.
Помимо одиночных зародышеподобных структур, в суспензии микроспор картофеля на 11-12 сутки наблюдали конгломераты эмбриоидов - полиэмбриоиды.
Литература.
1. Генетические основы селекции растений. В 4 т. Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия/науч. ред. А. В. Кильчевский, Л. В. Хотылева. Минск: Беларус. навука, 2012. Т. 3. 489 с.
2. Ивановская Е.В. Гаплоидное растение Solanum tuberosum L. //Доклады АН СССР. 1939. Т. 24 (5). С. 488-491.
3. Montelongo-Escobedo H., Rowe P. R. Haploid induction in potato: Cytological basis for the pollinator effect//Euphytica. 1969. Vol. 18. Рр. 116-123.
4. Barrell1 Philippa J., Sathiyamoorthy Meiyalaghan1, Jeanne M.E. Jacobs Anthony J. Conner. Applications of biotechnology and genomics in potato Improvement // Plant Biotechnology Journal. 2013. Vol. 11. Рр. 907-920.
5. Шмыкова Н.А., Супрунова Т.П., Пивоваров В.Ф. Биотехнологические и молекулярно-генетические методы в селекции овощных культур (к 95-летию ВНИИССОК) // Сельскохозяйственная биология. 2015. Т. 50. № 5. С. 561-570.
6. Jahne A., Lorz H. Cereal microspore culture //Plant Sci. 1995. Vol. 109. Рр. 1-12
7. Efficient microspore embryogenesis in wheat (Triticum aestivum L.) induced by starvation at high temperature / A. Touraev, A. Indrianto, I. Wratschko, O. Vicente, E. Heberle-Bors // Sex Plant Reprod. 1996. Vol. 9. Pр. 209-215.
8. Dunwell J.M., Sunderland N. Anther culture of Solanum tuberosum L. // Euphytica. 1973. Vol. 22. Pр. 317-323.
9. Culture of freshly isolated wheat (Triticum aestisum L.) microspores treated with inducer chemicals / M.Y. Zheng, W. Liu, Y. Weng, E. Polle, C.F. Konzak//Plant Cell Rep. 2001. Vol. 20. P^. 685-690.
10. Highly efficient doubled-haploid production in wheat (Triticum aestivum L.) via induced microspore embryogenesis / W. Liu, Y. Zheng, E. Polle, C.F. Konzak//Crop Sci. 2002. Vol. 42. Pр. 686-692.
11. Фёдоров А.А. Жизнь растений в шести томах. Том 5. Часть 1. Цветковые растения/под ред. А. Л. Тахтаджяна. M.: Просвещение, 1980. 430 с.
12. Сельдимирова О.А., Круглова Н.Н. Формирование полиэмбриоидов в культуре in vitro как этап биотехнологии клонирования пшеницы // Известия Уфимского научного центра РАН. 2014. № 1. С. 22-26.
INDUCTION OF EMBRYOGENESIS IN THE CULTURE OF ISOLATED MICROSPORES OF NEVSKY TETRAPLOID VARIETY OF POTATO (SOLANUM TUBEROSUM L.)
L.I. Tikhomirova
Altai State University, prosp. Lenina, 61, Barnaul, 656049, Russian Federation
Summary. Broad prospects for the use of the potato forms with reduced chromosome number (dihaploids and monoploids) associated with the development of breeding on the basis of distant hybridization, and the possibility of selection of valuable genotypes using molecular markers. The method of microspores culture in vitro is one of the ways to obtain duplicated haploids (DH (double haploid) lines). It is based on the use of a biological phenomenon of androgenesis in vitro, in which haploid cells of microspores develop according to sporophytic way into embryo-like structures and later in regenerated plants, containing a half set of chromosomes. The purpose of our research was to develop the method of introduction of microspores to the culture and to determine the efficiency of induction of embryogenesis for the Nevskii variety of potato (Solanum tuberosum L.). The basis for the development of the methodology was the protocol for wheat cultivation. The pretreatment of unopened flower buds by low temperature was carried out. In our experiment, the use of a blender enabled to release and preserve viable up to 95% of microspores. At the time of isolation, 2-4% of dual-nucleus microspores with equal nucleus were detected. We also observed an abnormal development of microspores at the stage of tetrads, where there was the division of nucleus. Intensive growth of multicellular tumors caused the stretching and rupture of microspores cover. Embryoids appeared in 11 days. In addition to single embryo-like structures, we saw conglomerates of embryoids in suspension of potato microspores in 11-12 days. By analogy with wheat, we called them polyembryoids. The frequency of formation of embryoids (single embryo-like structures) and the frequency of formation of polyembryoids in the test was 0.5-1.0%. There was not the process of callus formation during the formation of embryoid structures. The success of the cultivation of potato microspores cv. Nevsky indicates the need for further work on optimization of the technology and receiving of green regenerated plants. Key words: potato, culture of isolated microspores, embryogenesis, dihaploid, proembryo. Author Details: L.I. Tikhomirova, Cand. Sc. (Biol.), head of division (e-mail: L-tichomirova@yandex.ru)
For citation: Tikhomirova L.I. Induction of Embryogenesis in the Culture of Isolated Microspores of Nevsky Tetraploid Variety of Potato (Solanum tuberosum L.). Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2016. V.30. No. 10. Pp. 9-11 (in Russ.).
