CC BY
21
DOI: 10.23868/201812046
ИНТЕГРАЦИЯ СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ КАРДИОМИОЦИТОВ В СЕРДЕЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ КАК МОДЕЛЬ ОПТИЧЕСКОГО БИОПЕЙСМЕЙКЕРА.
В.А. Балашов1, А.А. Низамиева1, 2, В.А. Цвелая1, К.И. Агладзе1, 3
1 Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Россия
2 Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия
3 Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия
MODEL OF OPTiCAL BIOPACEMAKER BASED ON INTEGRATION OF PHOTOSENSITIVE CARDiOMYOCYTES INTO CARDIAC CULTURE
V.A. Balashov1, A.A. Nizamieva1, 2, V.A. Tsvelaya1, K.I. Agladze1 3
1 Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Dolgoprudny,, Russia
2 M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research and Clinical Institute, Moscow, Russia
3 E.N. Meshalkin National Medical Research Center, Novosibirsk, Russia
e-mail: agladze.ki@mipt.ru
Для возможного применения в терапии нарушений ритма сердца в настоящее время изучаются способы восстановления функций его проводящей системы с использованием репро-граммированных клеток и биологических материалов, которые могли бы обеспечивать стабильный физиологический ритм в течение всей жизни, в частности, после интрамиокардиальной трансплантации. Однако, важным остается вопрос их выживаемости и образования электрофизиологических связей с кардио-миоцитами реципиента.
В данной работе в качестве поисков рабочих подходов к созданию оптического биологического водителя ритма изучалась эффективность различных способов внесения и интеграции светочувствительной линии кардиомиоцитов ChR2-HL-1 в монослой неонатальных кардиомиоцитов крысы. Для исследования были выбраны два подхода к со-культивированию: интеграция в монослой изолированных клеток и кластеров линии Ch2-HL-1 в различной концентрации. Эффективность полученного таким образом модельного водителя ритма оценивалась следующими способами: методом оптического картирования производилась регистрация волн возбуждения, инициированных оптической стимуляцией, воздействующей исключительно на клетки линии Ch2-HL-1; иммуноцитохимическими методами производилась характеристика морфологии полученной со-культуры и оценивалась степень интеграции внесенных в монослой структур. В ходе проведенных исследований было показано, что наиболее эффективным методом является кластерный способ внесения клеток в первичную культуру: 100 % образцов с кластерами, внесенные спустя 6 ч. культивации монослоя, проявляли стабильную генерацию волн возбуждения на физиологически значимых частотах внешней стимуляции, по сравнению с 88 % для образцов с внесенными изолированными клетками на значениях частот, ниже физиологических. Более того, образцы с кластерным методом внесения в культуру оказались гораздо более устойчивыми (100 % при кластерном методе и 25 % при внесении изолированных клеток) к воздействию блокатора натриевых каналов, лидокаина. При этом эффективность интеграции зависела от условий роста клеток, что подробнее показано в результатах исследования. Полученные результаты в дальнейшем могут быть применены в разработке биологического водителя ритма.
Ключевые слова: биологический пейсмейкер, кардиомио-циты, клеточная культура, оптическое картирование.
The methods of cardiac conduction system recovery with the use of reprogrammed cells and biomaterials, which could provide a stable physiological heart rate throughout the lifetime, are currently studied for possible applications in the heart rhythm disorder treatment. The main issue of intramyocardial transplantation is the transplanted cells' survival and electrophysiological connections formation with the recipient cardiomyocytes.
In this paper, in search for working approaches for creating an optical biological pacemaker, we studied the effectiveness of various methods of photosensitive cardiac ChR2-HL-1 line cells integration into neonatal rat cardiac monolayers. For the study, two approaches of co-cultivation were selected: isolated cells and clusters integration of the Ch2-HL-1 line in various concentrations into monolayers. The effectiveness of the obtained model pacemaker was evaluated by the following means: registration of excitation waves initiated by optical stimulation, which affected only cells of the Ch2-HL-1 line, was carried out by optical mapping; immuno-cytochemical analysis methods were used to characterize the morphology of the obtained co-cultures and to assess the degree of the integration of the embedded structures into the monolayer. In the course of the research it was shown that the most effective method of integration of cells in the primary culture is the cluster method: 100 % of samples with clusters, integrated after 6 hours of monolayer cultivation, showed stable generation of excitation waves at physiologically significant external stimulation frequencies, compared with 88 % for specimens with integrated isolated cells at frequencies lower than physiological. Moreover, the samples with the cluster integration method turned out to be much more resistant (100 % in the cluster method and 25 % in the infusion of isolated cells) to sodium channel inhibitor, lidocaine. The efficiency of integration depends on the conditions of cell growth, which is discussed in more detail in the results of the study. The obtained results are applicable in the development of a biological pacemaker.
Keywords: biological pacemaker, cardiomyocytes, cell culture, optical mapping.
Введение
Сердечная недостаточность характеризуется одними из самых высоких показателей госпитализации и смертности среди взрослых пациентов [1]. Многие сердечнососудистые заболевания могут привести к развитию серьезных осложнений, в частности, к нарушениям частоты, ритмичности и насосной функции сердца [2].
На протяжении более 50 лет имплантация электрокардиостимуляторов является основным средством терапии нарушений сердечного ритма. Однако у этого метода существует некоторое количество ограничений, из которых можно выделить постоянную потребность в мониторинге системы, возможность инфицирования кардиостимулятора, неприспособленность
к возрастным изменениям и многое другое. В связи с этим, востребована разработка биологического пейсмейкера как менее инвазивного и более физиологичного подхода к лечению аритмий [3, 4]. Однако в процессе работы над подобным биологическим устройством возникает ряд проблем, связанных с получением клеток и оценкой эффективности их пейс-мейкерной активности. В отдельных исследованиях изучаются возможности оптогенетического подхода при создании биопейсмейкера с помощью световой стимуляции кардиомиоцитов [5, 6]. Группа клеток в миокарде, имитирующая работу сердечного водителя ритма, может быть создана как трансплантацией аутогенных дифференцированных стволовых клеток [3,7], так и прямым редактированием генома клеток на участке миокарда для придания им пейсмей-керных свойств [8]. Такие клетки могут быть сенсибилизированы к свету при помощи внедрения в плаз-молемму канального родопсина 2 [9-11]. Также их способность к генерации потенциала действия может быть основана на мембранных белках, обеспечивающих медленную диастолическую реполяризацию и ритмичные возбуждения [7].
При трансплантации пейсмекерных клеток, важными остаются вопросы об их выживаемости, образовании функциональных связей с кардиомиоцитами реципиента и необходимом количестве таких клеток для надёжной стимуляции. Для увеличения максимального времени, в течение которого субстрат-зависимые клетки могут находится в свободном состоянии, и улучшения их встраивания в нативные ткани пациента представляется перспективным использование синтетических и природных биополимеров в качестве микроносителей. Основными материалами, используемыми в этой области, являются нановолокна, получаемые с помощью электроспиннинга [12-14], гидрогели, полимерные губки, децеллюляри-зированные матриксы органов [1 5]. В частности, было продемонстрировано [1 6], что заключение в капсулы из альгината отдельных стромальных стволовых клеток способствует повышенной их выживаемости и снижению скорости их выведения из организма при внутривенных инъекциях в экспериментах на мышах.
В предыдущих исследованиях была показана возможность стимуляции светом культуры неона-тальных крысиных кардиомиоцитов при добавлении в неё на этапе посадки светочувствительных клеток НЕК293 с трансфецированным канальным родопсином 2 [17, 18]. В другой работе была исследована передача возбуждения при сокультивировании им-мортализованной мышиной линии вентрикулярных кардиомиоцитов с встроенным в мембрану канальным родопсином-2 СИП2-Н1_-1 и неонатальных кардиоми-оцитов крысы. В данной работе была проведена модельная интеграция светочувствительных клеток культуры СИП2-Н_-1 в монослой неонатальных крысиных желудочковых кардиомиоцитов с целью определения оптимального способа формирования функционально активного синцития из различных типов клеток [19].
Материалы и методы
Дизайн исследования
В качестве образцов для исследования использовались культуры неонатальных кардиомиоцитов, выделенные из желудочков сердца крысы. Контрольные образцы культивировались в течение 48-72 ч, после чего оценивались их критические частоты стимуляции электродом. Экспериментальные образцы представляли собой монослои неонатальных кардиомиоцитов,
культивируемые в течение 6, 24 или 48 ч., после чего к ним добавлялись в различных концентрациях светочувствительные клетки СИП2-Н_-1 в виде кластеров или отдельных клеток. После последующей совместной культивации в течение 24 ч. оценивались вероятности оптической стимуляции образцов с интегрированными светочувствительными клетками и критические частоты стимуляции их светом.
Культура ChR2-HL-1
В качестве светочувствительных клеток использовалась иммортализованная клеточная линия кардиомио-цитов Н_-1 [19, 20] с трансфицированным канальным родопсином в связке с флуоресцентным белком еУРР (в дальнейшем данная клеточная линия будет обозначена СИП2-Н_-1). Для культивирования линии СИП2-Н_-1 использовалась среда Клейкомба [21], смена среды производилась каждые три дня. Клетки выращивались во флаконах Т25 при 37°С и 5 % С02. Когда клеточный монослой достигал 80 % конфлюэнтности, клетки пассировались с помощью 0,25 % раствора трипсина с ЭДТА.
Первичная культура кардиомиоцитов
Первичная культура неонатальных крысиных желудочковых кардиомиоцитов была получена согласно протоколу Woгthington [14, 19]. В работе использовались сердца крысят возрастом от 1 до 4 сут. До посадки светочувствительных клеток №П2-Н_-1 монослои кардиомиоцитов культивировались в среде ОМЕМ с 5 % содержанием фетальной сыворотки крупного рогатого скота. После посадки светочувствительных клеток образцы культивировались в среде Клейкомба. В каждом эксперименте был контрольный образец культуры не-онатальных кардиомиоцитов без №П2-Н_-1 клеток.
Посадка светочувствительных
клеток линии ChR2-HL-1
В качестве «субстратов» для внесения светочувствительных клеток линии №П2-Н_-1 использовались первичные культуры неонатальных крысиных кардиомиоцитов. Внесение производилось спустя 6, 24 и 48 ч. от начала культивирования и проводилось несколькими способами:
1. Внесение отдельных клеток:
Клеточную суспензию вносили в лунку культураль-ного планшета с первичной культурой в концентрации 30-1100 кл./мм2. В качестве контроля эти клетки помещали в том же количестве на свободное покровное стекло, покрытое фибронектином. Для определения доли клеток, прикрепившихся к монослою, производилось сравнение количества клеток на монослое и контрольном образце.
2. Внесение малых кластеров клеток:
Для получения малых кластеров светочувствительных клеток плоская лунка 24-луночного планшета предварительно покрывалась агарозой для предотвращения прикрепления клеток к поверхности лунки. В нее помещалась суспензия клеток культуры №132-Н_-1. Плотность клеток в лунке составляла 0,5-1 млн кл./см2. Через сутки эти клетки образовывали на неадгезивной подложке своеобразную сеть (рис. 1А). Полученные и скрепленные между собой клетки разбивались на отдельные кластеры с помощью механического пипетирования (рис.1Б). Полученная суспензия кластеров вносилась к образцам первичной культуры. Площадь проекции кластеров, получаемых таким методом, варьировалась в пределах 1000-20000 мкм2, что составляло порядка 30-500 клеток.
Рис. 1. Кластеры из светочувствительных клеток линии С1пР2-Н_-1: А — сетка, которую образуют С1пР2-Н_-1 на агарозном геле; Б — малые кластеры, получаемые на поверхности плоской неадгезивной подложки. Косое освещение. Масштабный отрезок — 200 мкм
Оптическое картирование
Для регистрации волн возбуждения и наблюдения за ответом на оптическую стимуляцию на 3-5 сут. после внесения клеток проводилось оптическое картирование образцов. Для визуализации волн возбуждения использовался кальций зависимый краситель Fluo-4-AM (Invitrogen, USA). После окрашивания образцы помещались в раствор Тирода и находились при температуре +20°С во время экспериментов. Волны возбуждения регистрировались высокочувствительной камерой Andor iXon3 и микроскопа MVX-10 (Olympus, Япония).
Стимуляция образцов
Общая оценка способности культуры, содержащей светочувствительные клетки, отвечать на световой импульс производилась с помощью световой стимуляции по всей площади образца, что достигалось путём быстрого открытия затворки флуоресцентной лампы с соответствующим флуоресцентным кубом. Так как максимумы поглощения красителя Fluo-4-AM и канального родопсина 2 лежат в близких спектральных диапазонах, то представлялось возможным одновременно возбуждать мембранный белок и флуоресцентный краситель.
Для точечной стимуляции использовался 470 нм светодиод M470F1 8 мВт (Thorlabs, США), с излучением, подаваемым через оптоволокно. На выходе оптоволокна мощность составляла 5,5 ± 0,3 мВт/мм2. При этом присутствовала фоновая засветка излучения, используемого для регистрации волн возбуждения. Её интенсивность составляла примерно 0,33 мВт/мм2. Длительность светового импульса, используемого для оптической стимуляции, составляла 50 мс. Площадь светового пятна, в пределах которого стимулировались клетки, составляла 1-2 мм2.
В качестве контроля производилась стимуляция культуры с помощью точечного платинового и референтного кругового электродов. Напряжение составляло 4-7 В. Длительность импульса 10 мс. Периоды стимуляции варьировались в пределах 200-5000 мс.
Иммуноцитохимия
Для исследования морфологии со-культуры кардио-миоцитов и светочувствительных клеток образцы фиксировались с помощью 4 % PFA и окрашивались на специфичный сократительному аппарату кардиомиоцитов
белок а-актинин, актиновые филаменты и ДНК клеток. Для этого были использованы антитела: первичные мышиные моноклональные антитела к а-актинину (A7811, Sigma-Aldrich), вторичные мышиные Alexa Fluor 594 (A-11020, Life Technologies), а также Alexa Fluor 488 Phalloidin Conjugate (A12379, Molecular Probes) и DAPI (Vector Laboratories). Исследование проводилось на сканирующем конфокальном микроскопе LSM 710 (Zeiss, Германия).
Статистический анализ
Статистические данные представлены в виде: среднее значение ± стандартное отклонение. Для данных, распределение которых не соответствовало нормальному, вычислялись нижний квартиль, медиана и верхний квартиль. Для целей исследования было проведено оптическое картирование на 24 образцах с внесенными через 6 ч. культивации отдельными ChR2-HL-1 и на 13 образцах с отдельными светочувствительными клетками, внесенными через 48 ч. культивации. Так же было проанализировано 20 образцов с внесенными через 6 ч. культивации кластерами ChR2-HL-1 и 9 образцов с кластерами светочувствительных клеток, внесенными через 48 ч. культивирования.
Сравнение контрольных и экспериментальных групп проводиломь с помощью U-критерия Манна-Уитни. Различия между группами считались статистически значимыми при p<0,05. Статистический анализ производился в программе Wolfram Mathematica 11.
Результаты
Структурная характеристика внесенных клеток
Одиночные клетки вносимой культуры ChR2-HL-1 успешно интегрировались на разновозрастные (6, 24 и 48 ч, как указано в методах) монослои первичной культуры. Количество прикрепившихся в таких экспериментах клеток HL-1 сравнивалось с количеством клеток, прикрепившихся к контрольному субстрату. Средняя доля успешно интегрировавшихся в монослой первичной культуры внесенных клеток составлял 43±12 % от количества прикрепившихся клеток на контрольном образце спустя 24 ч. от внесения. На рис. 2 представлена культура неонатальных желудочковых кардиомиоцитов с внесенными в неё светочувствительными клетками ChR2-HL-1 (рис. 2А) и контрольный образец светочувствительных клеток (рис. 2Б).
Рис. 2. Клетки линии СИР2-Н_-1: А - внесенные на первичную культуру; Б — на покровное стекло (контроль). Зеленым показана флуоресценция белка еУРР в клетках СИР2-Н_-1. Масштабный отрезок — 100 мкм
ЗОООцт2 102 ООО мт'
Меап агеа: 3.0± 1.8х 104цт2
Б 'Л * 4 , , . ' Г Г V. + ч % - V Л — "т- . *
3 ООО цт2
Меапагеа: 1.4 ± 1.1 х 104цт2
56 000цт2
Рис. 3. Кластеры клеток линии СИР2-Н_-1, интегрированные в первичную культуру крысиных кардиомиоцитов, 24 ч. со-культивирования: А — распластанный кластер, внесенный в 6-ч. первичную культуру; Б — флуоресценция белка еУРР в плазмалемме клеток линии СИР2-Н_-1; В, Г — кластер клеток СИР2-Н_-1, внесенный в монослой 48-часовой первичной культуры. Д. Е — распределение кластеров по размерам через 24 ч. со-культивирования после внесения на 6- и 48-часовые монослои первичных культур, соответственно. А, В — освещение по методу светлого поля; Б, Г — лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Под графиками указаны диапазоны размеров кластеров. Масштабный отрезок — 100 мкм
Е
Кластеры, внесенные спустя 6 и 48 ч. культивирования монослоя первичной культуры, успешно прикреплялись, но проявляли различное взаимодействие с культурой. Площадь кластеров, внесенных на менее плотные культуры, после 24 ч. совместного культивирования увеличивалась в среднем в три раза и лежала в диапазоне 3,0±1,8х104 мкм2. Всего было проанализировано 357 таких кластеров. Аналогичные характеристики распластывания наблюдались и на контрольных образцах (рис. 3А, Б). На рис. 3А, Б продемонстрирована миграция светочувствительных клеток и внедрение их в монослой первичной культуры. Трёхмерная реконструкция кластера на конфокальном микроскопе спустя 24 ч.
совместного культивирования с первичной культурой показала, что клетки, за исключением середины кластера, росли в 1-2 слоя (рис. 4А, Б), при том, что свободные кластеры имели форму, более близкую к сферической.
Внесение кластеров на первичные культуры после 48 ч. культивирования также сопровождалось их встраиванием в кардиальный монослой (рис. 3В, Г). Однако, после 24 ч. со-культивирования кластеры на таких монослоях отличались от кластеров, внесенных на первичные культуры спустя 6 ч. Всего было проанализировано 219 кластеров на более плотных культурах. Спустя 24 ч. после внесения их средняя площадь составляла 1,4±1,1х104 мкм2, что ближе к площади свободных
кластеров, которая составляла 1,1±0,7х104 мкм2. Клетки находились в кластере более плотно и наблюдалась менее выраженная миграция светочувствительных клеток из него в монослой. Сравнение размеров кластеров после 24 ч. совместного культивирования №132-Н_-1 между первичной культурой 6- (рис. 3Д) и 48-часового (рис. 3Е) возраста показало, что в первом случае кластерам присуща большая средняя площадь и лучшее распластывание.
Иммуноцитохимические исследования подтвердили интеграцию кластеров линии №132-Н_-1 в первичную культуру (рис. 4). Фиксация образцов для всех случаев происходила спустя одно и то же время. На рис. 4А-Г показан кластер клеток №132-Н_-1, интегрированный в 6-ч. монослой первичных кардиомиоцитов. Ввиду малого времени культивации клетки первичной культуры не успевали полностью распластаться и между ними оставались промежутки, где был доступ к субстрату, с которым мог взаимодействовать кластер. Морфологическое анализ образца показал, что благодаря этому эффекту происходило взаимное проникновение между кардиомиоцитами неонатальной культуры и клетками светочувствительного кластера (рис. 4А-Г). Анализ трёхмерной реконструкции образца подтвердил интеграцию по всей площади и снижение толщины совокупности монослоя и кластера до 2-3 слоев клеток. На рис. 4Д и Е показан кластер клеток №132-Н_-1, внесённый к 48-часовой культуре первичных кардиомиоцитов. Кластер светочувствительных клеток прикреплялся по всей площади контакта с монослоем без взаимного проникновения двух культур.
Функциональная характеристика вносимых клеток
Эффективность стимуляции культуры отдельными клетками линии ChR2-HL-1. Отдельные клетки №132-Н_-1 вносили к первичной культуре в различных концентрациях. Критическая частота стимуляции образцов, то есть максимальная частота, при которой образец реагировал на каждый световой импульс, варьировалась в зависимости от плотности внесения светочувствительных клеток, которая составляла 30-1100 кл./мм2 (табл. 1 ). В табл. 1 представлена зависимость критической частоты, усваиваемой образцами при точечной оптической стимуляции площади 1 мм2 (т. е. в световом пятне оказывалось от 30 светочувствительных клеток) оптоволокном. В качестве контроля использовался образец неонатальной первичной культуры без внесения светочувствительных клеток.
Таблица 1. Зависимость критической частоты стимуляции светом от концентрации внесенных в стимулируемый образец первичной культуры клеток линии №132-Н_-1
Концентрация ^-1, клеток/мм2 Критическая частота стимуляции светом, Гц
30 0,22 ± 0,11
70 0,26 ± 0,07
140 0,42 ± 0,05
550 0,62 ± 0,12
1100 0,69 ± 0,25
При точечной стимуляции культур неонатальных кардиомиоцитов с отдельными клетками №132-Н_-1 исследованных концентраций, отвечающих на раздражение,
минимальная критическая частота стимуляции составила 0,2 Гц. При повышении концентрации подсаживаемых светочувствительных клеток критическая частота приближалась к физиологически значимым величинам. При концентрации 0,55 и 1,1 тыс./мм2 внесенных клеток №132-Н_-1 увеличивалась вероятность формирования случайных малых кластеров, что могло способствовать увеличению критической частоты возбуждения.
Для оценки общей способности культур с интегрированными светочувствительными клетками реагировать на световые импульсы, оценивалась доля отвечающих образцов и количество появляющихся при этом источников волн возбуждения. При общей засветке образца с отдельными клетками №132-Н_-1, внесенными на 6-часовую культуру, ответ на раздражение наблюдался в 21 из 24 образцов. При этом на отвечавших образцах образовывалось 1 -2 источника волн возбуждения. Засветка образца с клетками №132-Н_-1, внесенными на 48часовую культуру показала, что ответ на раздражение наблюдался в 9 из 13 образцов. На каждом образце появлялось 1-2 источника волн возбуждения (рис. 5А). Статистический анализ не выявил значимых различий между 6- и 48-часовыми группами культур.
При точечной стимуляции обнаруженных источников волн возбуждения на 6- и 48-часовых образцах, квартили распределения критических частот, воспринимаемых культурами, составляли 0,3; 0,4; 0,53 Гц и 0; 0,37; 0,48 Гц, соответственно, что заметно ниже физиологически релевантных частот (от 1 Гц).
Для выяснения влияния блокаторов каналов на сердечные монослои производилась их обработка лидокаи-ном в концентрации 0,86 тМ в течение 5 мин. При этом проявилось статистически значимое снижение возбудимости монослоёв (рис. 5), а на многих из них произошло полное ингибирование ответа на световое раздражение. В частности, при засветке образца с клетками №132-Н_-1, внесенными на 6-часовую культуру, ответ на раздражение наблюдался только в 6 из 24 образцов. При общей засветке образца с клетками №132-Н_-1, внесенными на 48-часовую культуру, ответ на раздражение наблюдался в 3 из 13 случаев.
Эффективность стимуляции культуры кластерами ChR2-HL-1. Кластеры №132-Н_-1 клеток, внесенные на первичные монослои, культивированные в течении 6 ч., более эффективно отвечали на возбуждение светом в сравнении с другими группами (рис. 5А). При равномерной оптической стимуляции достаточной интенсивности всей культуры одномоментно появлялось 5-12 источников волн возбуждения со случайным расположением по образцу. Так как разным кластерам была присуща разная задержка по времени инициации возбуждения в ответ на стимуляцию, волны возбуждения от источников, быстрее реагировавших на свет, подавляли более медленные источники, что ограничивало их максимальное количество.
При точечной засветке кластеров на таких образцах все группы светочувствительных клеток регулярно отвечали на раздражение. Пример волны возбуждения, инициированной на сердечной культуре светом, показан на рис. 6А. Несмотря на тот факт, что все внесенные кластеры реагировали на раздражение светом, критические частоты такой стимуляции значительно варьировались в зависимости от конкретного кластера. В среднем, она составляла 1,2±0,3 Гц (рис. 5Б). Для сравнения, в качестве контроля использовались монослои неонатальных кардиомиоцитов без светочувствительных клеток, которые стимулировались электродом. Их критические частоты находились в пределах 2,3±0,8 Гц.
Рис. 4. Кластеры из светочувствительных клеток, внесенные на первичные культуры кардиомиоцитов: А-Г — кластеры, внесенные через 6 ч. после культивирования первичной культуры; Д — кластеры, внесенные на 48-часовую культуру; Е — трёхмерная реконструкция одного из кластеров. Красный — а-актинин, зелёный — ф-актин, синий — ядра клеток (докрашены □АР!). _БМ изображения. Масштабный отрезок: А-Г — 100 мкм; Д — 300 мкм, Е — 50 мкм
А
10
Ч I
*
х ё х
I
т
1.1
1.0
0.5
т
т
!
XIX
т
Шш
Рис. 5. Характеристики ответа на световой импульс отдельных светочувствительных С1п132-Н_-1 клеток и их кластеров, внесенных на 6- и 48-часовые монослои неонатальных крысиных кардиомиоцитов: А — количество источников волн возбуждения, появляющихся в сердечных культурах в ответ на засветку образца сразу по всей площади; Б — Критические частоты, воспринимаемые сердечными монослоями из разных групп в ответ на точечный световой импульс. 1 — отдельные клетки, внесенные на 6-часовые монослои, 2 — отдельные клетки, внесенные на 48-часовые монослои, 3 — кластеры, внесенные на 6-часовые монослои, 4 — кластеры, внесенные на 48-часовые монослои. Прямоугольники — нижний и верхний квартили с медианой, «усы» — 5 и 95 процентили. Оранжевые и фиолетовые столбцы показывают распределения до и после воздействия 0,86 мМ лидокаином
Б
Кластеры фоточувствительных клеток №132-Н_-1, подсаженные на монослои неонатальных сердечных кар-диомиоцитов после 48 ч. культивирования, также демонстрировали ответ в виде волны возбуждения на раздражение светом. При общей засветке излучением синего спектра, в 6 из 9 образцов возникали 1 -3 источника возбуждения (рис. 5А). Учитывая тот факт, что на один образец приходилось примерно по 20 кластеров,
то эффективность образования электрической связи составляла менее 10 %. Распределение критических частот стимуляции светом по квартилям для таких образцов составляло 0; 0,5; 0,57 Гц (рис. 5Б).
Следует отметить, что диапазон критических частот явно зависел от времени со-культивирования первичной культуры и подсаженных в нее №132-Н_-1 клеток. В частности, эксперимент для 5 образцов с внесенными
А
0.0 Б
0.7 5 1.5 Б 22 ъ
Б
Время
рис. 6. Волны возбуждения в сердечной культуре, инициированные в ответ на стимуляцию кластера световыми импульсами: А — распространение волны возбуждения по культуре неонатальных кардиомиоцитов с подсаженным кластером СИ132-Н1_-1 в разные промежутки времени; Б — пространственно-временная развёртка распространения волны вдоль оси, обозначенной «Х» на рис. А. Толстые вертикальные белые линии — световой импульс (10 мс). Показан ответ культуры на каждый световой стимул. Период стимуляции 1300 мс. Масштабный отрезок — 3 мм
кластерами показал, что по прошествии 48 ч. после внесения СИ132-Н_-1 клеток средняя критическая частота стимуляции светом составляла порядка 0,9±0,4 Гц. Но через 72 ч. усреднённая частота стимуляции образцов с теми же кластерами составляла около 1,4±0,3 Гц.
При снижении возбудимости культуры лидокаином (0,860 мМ, 5 мин) полного подавления передачи возбуждения между группами светочувствительных клеток и культурой кардиомиоцитов не наблюдалось, однако происходило заметное падение критических частот стимуляции светом. На контрольных образцах при стимуляции электродом критические частоты находились в пределах 0,9±0,2 Гц. Квартили распределения критических частот оптической стимуляции образцов с внесенными светочувствительными кластерами через 6 ч. культивирования равнялись 0,4; 0,47; 0,53 Гц (рис. 5Б). Квартили критических частот стимуляции светом образцов с подсаженными светочувствительными кластерами через 48 ч. культивирования были заметно ниже и равнялись 0; 0,34; 0,46 Гц.
обсуждение
Проведённое исследование показало, что одиночные клетки СИ132-Н_-1 способны инициировать волну возбуждения в монослое первичной культуры сердечных клеток при световой стимуляции, однако такой отклик на возбуждение светом является нерегулярным, и, следовательно, ненадёжным для последующего применения в модельном водителе ритма сердца. Учитывая тот факт, что в каждый образец было интегрировано по тысяче клеток и при этом находились только единичные источники ответа на световую стимуляцию, можно сделать вывод, что большинство клеток, внесенных в виде суспензии, либо не образовали электрической связи с окружающей культурой, либо их было недостаточно для её стимуляции.
Кластерный способ внесения светочувствительных клеток показал возможность устойчивого образования электрической связи между внесенными и окружающими клетками и осуществимость надёжной стимуляции прототипа сердечной мышечной ткани. Однако эффективность интеграции кластера в монослой зависела от условий внесения клеток. Можно предположить, что успех внесения светочувствительных кластеров на менее плотных монослоях, где клетки могли контактировать с субстратом и расти по нему, и более низкая эффективность внесения на плотных монослоях зависели от контакта с подложкой. Стоит предположить, что эта
разница не вызвана различиями во времени культивации культур, так как на одних и тех же образцах кластеры успешно образовывали электрическую связь на более редких участках культуры, и хуже образовывали её на плотных. Такой механизм соответствует результатам предыдущих исследований [17, 19]. В одном из них культуры С1п132-Н_-1 и неонатальных кардиомиоцитов росли по одному плоскому субстрату, после чего образовывали стабильный электрический контакт. В другом — светочувствительные клетки НЕК293 замешивались в суспензию кардиомиоцитов, совместно высаживались на образец, культивировались, образовывали кластеры, после чего могли стимулировать сердечный монослой. В обоих этих исследованиях для образования связи клетки совместно росли на одном субстрате.
Механизм влияния субстрата на образование контакта между клетками может заключаться в их направленном росте, что может вызывать усиленное давление цитоплазматичеких мембран клеток друг на друга. Такой плотный контакт плазмолемм клеток различных типов может способствовать формированию коннексинов между ними. К тому же, электрическое возбуждение может переходить с клетки на клетку в местах тесного контакта их мембран напрямую [22].
Для прояснения этого вопроса можно использовать анизотропные культуры кардиомиоцитов [23], где клетки имеют веретенообразную морфологию и преимущественно мигрируют вдоль выделенного направления, более эффективно образуя электрическую связь на своих полюсах [24]. При подтверждении положительного влияния субстрата на встраивание внесенных в сердечную культуру клеток, подобные условия можно воспроизвести не только на плоском стекле, но и на субстрате, представляющим из себя фрагменты волокон — так называемые микроподложки [1 4]. Такие субстраты могут не только направлять рост клеток и способствовать образованию электрической связи, но и повышать степень их выживаемости и приживляемости после трансплантации.
Заключение
В ходе исследования было выяснено, что как отдельные светочувствительные клетки СИ132-Н_1, так и их кластеры интегрируются в монослои неонаталь-ных крысиных кардиомиоцитов, делая полученную со-культуру восприимчивой к световым импульсам, что является основой для оптической стимуляции сердечных культур и тканей. Однако эффективность
стимуляции зависит от количества интегрированных внесенных клеток и условий их внесеиия. Было показано, что эффективность стимуляции сердечной ткани отдельными клетками является нерегулярной, не достигает физиологически релевантных частот и является, в общем, ненадёжной. Так же было выявлено, что эффективность стимуляции единичными клетками уязвима к воздействию лидокаина.
Кластеры светочувствительных клеток ChR2-HL-1 успешно интегрируются в сердечные монослои. На функциональном уровне такие кластеры могли
ЛИТЕРАТУРА:
1. Murphy C., Shelley E., O'Halloran A.M. et al. Failure to control hypercholesterolemia in the Irish adult population: cross-sectional analysis of the baseline wave of The Irish Longitudinal Study on Ageing (TILDA). Ir. J. Med. Sci. 2017; 186 (4): 1009-17.
2. Пиданов О.Ю., Богачев-Прокофьев А.В., Елесин Д.А. и др. Тора-скопическая аблация для лечения пациентов с изолированной формой фибрилляции предсердий в России. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2018; 22 (2): 14-21.
3. Meyers J.D., Jay P.Y., Rentschler S. Reprogramming the conduction system: Onward toward a biological pacemaker. Trends Cardiovasc. Med. 2016; 26 (1): 14-20.
4. Rosen M.R., Brink P.R., Cohen I.S. et al. Genes, stem сells and biological pacemakers. Cardiovasc. Res. 2004; 64 (1):12-23.
5. Ambrosi C.M., Boyle P.M., Chen K. et al. Optogenetics-enabled assessment of viral gene and cell therapy for restoration of cardiac excitability. Sci. Rep. 5. 2015; article number: 17350.
6. Nussinovitch U, Gepstein L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature biotechnology. 2015 Jul;33(7):750.
7. Protze S.I., Liu J., Nussinovitch U. et al. Sinoatrial node cardiomyo-cytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nat. Biotechnol. 2017; 35 (1): 56-68.
8. Arrenberg A.B., Stainier D.Y., Baier H. et al. Optogenetic control of cardiac function. Science. 2010; 330 (6006): 971-74.
9. Volkov O., Kovalev K., Polovinkin V. et al. Structural insights into ion conduction by channelrhodopsin 2. Science. 2017; 358 (6366): 8862.
10. Crocini C., Ferrantini C., Coppini R. et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Sci. Rep. 6. 2016; article number: 35628.
11. Zhang F, Wang LP, Boyden ES, Deisseroth K. Channelrho-dopsin-2 and optical control of excitable cells. Nature methods 2006; 3(10):785.
12. Chepeleva, E.V., Balashov, V.A., Dokuchaeva, A.A. et al. Analyis of biological compatibility of polylactide nanofibrous matrix vitalized with cardiac fibroblasts in a porcine model. Genes and Cells 2017; 12(4): 62-68
отвечать на световые импульсы с физиологически релевантными частотами, а обработка лидокаином вызывала лишь адекватное снижение критических частот. Однако электрическая связь между кластерами и монослоями кардиомиоцитов возникала не во всех случаях. Вероятность ее возникновения значительно зависела от взаимодействия кластеров с окружающей культурой.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 16-15-10322.
13. Чепелева Е.В., Балашов В.А., Докучаева А.А. и др. Исследование биологической совместимости полилактидных нановолоконных матрик-сов, заселенных фибробластами сердца, в эксперименте на мини-свиньях. Гены и клетки 2017; 12(4): 62-68
14. Balashov V., Efimov A., Agapova O. et al. High resolution 3D microscopy study of cardiomyocytes on polymer scaffold nanofibers reveals formation of unusual sheathed structure. Acta Biomaterialia 2018; 68: 214-22.
15. Sotnichenko A.S., Gubareva E.A. et al. Decellularized rat heart matrix as a basis for creation of tissue engineered heart. Cellular Transplantation & Tissue Engineering 2013; 8(3): 86-94.
16. Mao A.S., Shin J.W. et al. Deterministic encapsulation of single cells in thin tunable microgels for niche modelling and therapeutic delivery. Nature materials 2017; 16(2): 236.
17. Jia Z., Valiunas V., Lu Z. et al. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 2011; 4 (5): 753-60.
18. Boyle P.M., Williams J.C., Ambrosi C.M. et al. A comprehensive mul-tiscale framework for simulating optogenetics in the heart. Nat. Commun. 4. 2013; article number: 2370.
19. Agladze N.N., Halaidych O.V., et al. Synchronization of excitable cardiac cultures of different origin. Biomater. Sci. 2017; 5 (9): 1777-85.
20. Yakushenko A., Gong Z., Maybeck V. et al. On-chip optical stimulation and electrical recording from cells. J. Biomed. Opt. 2013; 18 (11): 111402.
21. Claycomb W.C., Lanson N.A., Stallworth B.S. et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. PNAS USA 1998; 95 (6): 2979-84.
22. Picone JB, Sperelakis N, Mann Jr JE. Expanded model of the electric field hypothesis for propagation in cardiac muscle. Math. Comp. Model. 1991; 15(8):17-35.
23. Orlova Y, Magome N, Liu L, Chen Y, Agladze K. Electrospun nanofibers as a tool for architecture control in engineered cardiac tissue. Biomaterials 2011; 32(24): 5615-24.
24. Erofeev I.S., Agladze K.I. Two models of anisotropic propagation of a cardiac excitation wave. JETP Letters 2014; 100(5): 351-4.
Поступила: 28.09.2018
