CC BY
62
УДК 594.381.5:591.3:577.175.2
Н. П. Кудикина
ИНТЕГРАТИВНЫЕ СИСТЕМЫ ГИДРОБИОНТОВ И ИХ РОЛЬ В ЭКОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ
На модельных объектах (планарии и брюхоногие моллюски) показано влияние нейропептидов (окситоцин и вазопрессин) на активность регенерации, показатели репродуктивной стратегии и эмбриогенез. Проведенные исследования демонстрируют хорошие возможности тест-системы, включающей моллюсков и плоских червей. Правильный подбор таких тест-объектов позволит в короткие сроки изучить широкий спектр реакций на любые вводимые соединения на разных этапах развития организма.
The model animals (turbellaria flatworms and gastropod molluscs) were used in the experiments to study the influence of neuropeptides (oxytocin and vasopressin) on the regeneration activity, reproductive traits and embryogenesis. The results identify perspectives for using these animals as test-systems for ecological monitoring. Correct selection of such test-objects will provide an opportunity to study in short terms the wide spectrum of these animas' reactions to any chemical substance in different ontogenetic stages.
Одна из самых острых проблем экологического мониторинга — поиск критериев оценки воздействия факторов среды на гидробионтов. Воздействие веществ чуждой для живых организмов природы в рамках классической токсикологии изучено достаточно подробно, а вещества, имманентно присущие живым организмам, исследованы недостаточно.
Показано, что широкий набор различных по структуре химических соединений, попадающих в окружающую среду, может воздействовать на рецепторы гормонов и вызывать соответствующие эффекты. Они способны обусловливать дисбаланс гормонального гомеостаза, что ведет, например, к изменению плодовитости, феминизации и т. д. Такие последствия возникают при попадании в водоемы некоторых пестицидов, обладающих эстрагеновым и другими гормональными эффектами [1].
Сходство механизмов регуляции роста, размножения, обнаруженное у позвоночных и беспозвоночных, позволяет рекомендовать их в качестве тест-объектов для быстрого обнаружения эффектов подобных веществ. Характер изменения гормонального метаболизма дает возможность предсказать последствия воздействия загрязняющих веществ на основные показатели жизнедеятельности.
Согласно современным представлениям, нейрогипофизарные гормональные соединения вазопрессин-окситоцинового ряда — одна из наиболее древних групп регуляторных молекул. Их наличие доказано у целого ряда беспозвоночных животных, начиная с простейших [2 — 4].
Вестник РГУ им. И. Канта. 2008. Вып. 7. Естественные науки. С. 60 — 66.
В организме позвоночных эта группа гормонов обладает высокой функциональной активностью [5; 6], однако их участие в регуляции процессов регенерации и роста практически не изучено. Существует лишь несколько работ, в которых показана морфогенетическая функция нейропептидов позвоночных [7]. Мало известно и о влиянии этих гормонов на отдельные аспекты репродуктивной биологии и эмбриональное развитие животных.
В связи с этим целью нашей работы было изучение влияния экзогенно вводимых гормональных соединений вазопрессин-окситоцино-вого ряда на активность регенерации, рост и эмбриогенез с помощью тест-систем быстрого реагирования, включающих несколько групп жи-вотных-биоиндикаторов. Одновременно решался вопрос об эффективности таких систем для биомониторинга.
Материал и методика
Изучение влияния на процесс регенерации проводили на планари-ях Dugesia lugubris Schmidt, 1861 (Plathelmintes, Turbellaria, Tricladida, Duge-siidae). Условия содержания животных соответствовали стандартным [8].
В ходе эксперимента исследовался характер воздействия медицинского препарата питуитрина (смесь двух нейропептидов — вазопресси-на и окситоцина) в концентрации 0,0003 г/мл, который вносили в количестве 0,1 мл в организм животного с пищей (личинки мотыля).
Регенерацию вызывали отсечением передней трети тела (с головным ганглием). После операции животных рассаживали в сосуды с 25 мл воды. Анализ показателей хода восстановительного процесса у планарий проводился по стандартной методике прижизненной морфо-метрии, разработанной Тирасом и Сахаровой [9].
Для изучения влияния окситоцина на особенности репродуктивной стратегии и эмбриогенез использовали брюхоногого моллюска Lymnaea stagnalis L., 1799 (Gastropoda, Pulmonata, Lymnaidae), который являлся обычным объектом для такого рода исследований. Условия содержания прудовиков и проведения эксперимента, в том числе и дегельминтизация, были стандартным. Определение стадий развития эмбрионов вели по таблице нормального развития [10].
Использовали медицинский препарат окситоцин (Oxitocinum, производитель ЛЕК, Любляна, СФРЮ; 5 %-ного раствор), синтетическое действующее вещество которого полностью соответствует гормону, вырабатываемому задней долей гипофиза. Препарат вводили моллюскам внутримышечно в ткань ноги (0,2 мл 5 %-ного раствора). Чтобы не разрушить педальный ганглий, инъекции осуществляли строго в переднюю треть ноги.
Статистический анализ проводили с помощью Т-критерия Стью-дента (табл. 1).
Регенерация планарий под влиянием нейропептидов. Процесс регенерации по характеру протекания делят на две категории: эпиморфоз и морфолаксис [11].
Таблица 1
Объем исследованного материала и регистрируемые показатели
62
Группа Длина тела, мм Количество особей Регистрируемые показатели
Вщввіа І^пЬгів
Контрольная 21 30 Длина бластемы (Ъ,мм); коэффициент регенерации (Кр); коэффициент восстановления (Кв)
Эксперимен- тальная 21 30
Ьуттва stagnalis
Контрольная 40 30 Интенсивность кладки (% нерестящихся особей); плодовитость (капс./ кладку); продолжительность и динамика эмбриогенеза
Эксперимен- тальная 40 30
Результаты и обсуждение
Активность эпиморфоза оценивают по величине бластемы (регенерационной почки) и коэффициенту регенерации (Кр), отражающему интенсивность роста бластемы.
На начальных этапах восстановления питуитрин не оказывал существенного действия на скорость роста бластемы, был отмечен лишь слабый ингибирующий эффект. Начиная с 3-х суток опыта характер действия препарата менялся на противоположный. Размеры регенерационной почки у экспериментальных планарий были выше, чем в контроле. Стимулирующий эффект усиливался во времени. Максимальные различия в размерах бластемы обнаружены на завершающем этапе регенерации. У полностью восстановившихся экспериментальных животных размеры регенерационной почки были в 1,2 раза выше, чем в контроле (табл. 2).
Таблица 2
Изменение длины бластемы под влиянием питуитрина
Группа Сутки опыта
1-е 2-е 3-е 4-е 5-е 6-е 7-е 8-е
Контрольная 0,69 ± 0,14 1,44 ± 0,18 2,16 ± 1,31 3,91 ± 0,31 5,19 ± 0,34 6,32 ± 0,36 6,44 ± 0,40 6,49 ± 0,35
Эксперимен- тальная 0,64 ± 0,10 1,36 ± 0,14 2,4 ± 0,25 4,06 ± 0,3 5,6 ± 0,37 7,48 ± 0,44 7,76 ± 0,44 7,81 ± 0,45
td 1,72 1,57 0,13 0,79 1,64 3,52 4,13 4,13
tst 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6
Первые трое суток опыта значения Кр, отражающего интенсивность процесса эпиморфоза, в обеих исследуемых группах были невелики и сходны между собой. Особенно заметный рост этого показателя зарегистрирован у планарий с 4-х по 5-е сутки эксперимента. Кр у экспериментальных животных был выше, чем в контроле. Достоверные различия отмечены только при завершении восстановительного процесса (6 — 8-е сутки) (табл. 3).
Таблица 3
Изменение Кр у задних регенерантов под влиянием питуитрина
Группа Сутки опыта
1-е 2-е 3-е 4-е 5-е 6-е 7-е 8-е
Контрольная 0,64 ± 0,01 1,36 ± 0,14 2,40 ± 0,25 4,06 ± 0,31 5,60 ± 0,37 7,48 ± 0,44 7,76 ± 0,43 7,81 ± 0,45
Эксперимен- 0,69 ± 1,44 ± 2,16 ± 3,91 ± 5,19 ± 6,32 ± 6,44 ± 6,49 ±
тальная 0,14 0,176 1,31 0,31 0,34 0,36 0,35 0,35
td 1,74 1,57 0,13 0,79 1,64 3,52 4,13 4,13
tst 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6
63
Показателем активности морфолаксиса, восстановления исходных пропорций тела, когда процесс перестройки захватывает весь организм, служит коэффициент восстановления (Кв). Как и в случае роста бластемы, был обнаружен стимулирующий эффект введенного препарата. Особенно заметно он ускорял процесс восстановления продольных пропорций тела на завершающем этапе регенерации (табл. 4).
Таблица 4
Изменение Кв у задних регенерантов под влиянием питуитрина
Группа Сутки опыта
1-е 2-е 3-е 4-е 5-е 6-е 7-е 8-е
Контрольная 10,13 ± 3,50 20,92 ± 3,04 31,41 ± 4,24 56,84 ± 4,56 75,43 ± 3,42 85,50 ± 3,14 93,58 ± 3,26 94,34 ± 3,26
Эксперимен- тальная 10,31 ± 1,97 19,73 ± 3,38 35,52 ± 4,06 59,86 ± 4,33 82,75 ± 3,92 110,5 ± 4,06 114,7 ± 4,35 115,3 ± 4,42
td 0,11 0,19 1,31 2,12 2,41 3,14 3,24 3,36
tst 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6
Регенерация у планарий связана с накоплением и расходованием нейросекреторного материала. Активирующие и ингибирующие восстановление факторы проявляют свою активность в зависимости от сроков регенерации [12; 13].
Полученные нами данные позволяют предположить, что в самом начале восстановительного процесса питуитрин нивелирует действие активирующих факторов регенерации. Далее, в течение 3 —4-х суток опыта, когда формируется новый ганглий, введенный животным препарат подавляет активность веществ ингибиторов, а начиная с 5-х суток он вновь усиливает действие естественных стимуляторов регенерации. Доказательство — высокий темп восстановления бластемы у подопытных планарий в конце эксперимента.
Ранее совместное действие вазопрессина и окситоцина на регенерацию планарий не изучалось. В исследованиях Шеймана [10] описано действие вазопрессина на скорость восстановления планарии О^еБІа tigrina. Его результаты совпадают с отмеченной нами тенденцией усиления питуитрином активности восстановительного процесса на за-
64
ключительном этапе регенерации, проявившейся как в характере роста бластемы, так и в особенностях изменения показателей Кр и Кв.
В исследованиях, проведенных нами ранее, было показано, что ок-ситоцин стимулировал рост бластемы только вначале (1 — 4-е сутки) и в дальнейшем не влиял на ход восстановительного процесса. Гормон тормозил сроки восстановления глаз и снижал скорость переворота животных в исходное положение, что говорит об ингибирующем действии препарата на нервную систему планарий. Следовательно, выявленный эффект связан прежде всего с действием вазопрессиновой составляющей питуитрина.
Воздействие окситоцина на моллюсков. Под влиянием гормона существенно менялись динамика нереста и его количественные характеристики. Введение окситоцина задержало начало кладки у экспериментальных животных почти на сутки. Продолжительность периода между кладками составляла от 3 до 6 суток. В контроле она не превышала 2 суток. Число моллюсков, участвующих в кладке в первой половине эксперимента (9 —20-е сутки), не превышало 23 %. У контрольных животных в этот период зарегистрирована максимальная интенсивность кладки — 48 % особей. Во второй половине опыта (20 —29-е сутки) периодичность кладки в обеих группах была сходной. Ее интенсивность в контроле постепенно снижалась (25 %). У экспериментальных моллюсков окситоцин стимулировал процесс кладки, и максимальное число животных откладывало яйцевые шнуры в течение последних суток опыта (43 %).
В течение первых двух недель после введения гормон практически не влиял на величину кладок. Затем количество капсул в кладках инъецированных животных уменьшалось. Средние показатели индивидуальной плодовитости в этот период различались незначительно (контроль — 100,8 капс./кл.; опыт — 109). Во второй половине опыта произошло падение плодовитости (контроль — 98,0 капс/кл; опыт — 76,4 капс/кл). В результате суммарная величина яйцепродукции у экспериментальных животных заметно снизилась в сравнении с контролем (контроль — 2026 капсул; опыт — 2886).
У брюхоногих моллюсков рост и развитие репродуктивной системы, нормальное течение оо- и сперматогенеза, овуляция и откладка яиц находятся под сложным гормональным контролем нейросекреторных центров ЦНС. Они же определяют и характер полового поведения моллюсков [14]. Наши результаты позволяют предположить, что окси-тоцин включается в процесс гормональной регуляции активности репродуктивной системы, подавляя при этом естественные стимуляторы исследуемых процессов, и усиливает эффекты ингибирующих факторов, например гормонов глазных щупалец, в норме тормозящих образование яиц [15].
Питуитрин — препарат, содержащий оба гипофизарных гормона, вызывал раннее начало нереста, увеличивал интенсивность кладки, количество отложенных кладок и число содержавшихся в них капсул [16; 17]. Это подтверждает полученные на планариях данные о стимулирующем характере действия вазопрессина.
Окситоцин сократил сроки эмбрионального развития прудовиков почти на сутки. Характер его влияния на отдельные стадии эмбриогенеза менялся в зависимости от качества происходящих перестроек [10] (табл. 5).
Таблица 5
Ход эмбрионального развития (стадии эмбриогенеза) большого прудовика под влиянием окситоцина
Группа Сутки опыта
1-е 2-е 3-е 4-е 5-е 6-е 7-е 8-е 9-е 10-е 11-е 12-е 13-е 14-е
Контрольная 6 16 20 21 23 24 25 26 26 26 28 28 29 29
Экспери- ментальная 5 16 19 21 24 24 25 26 27 27 28 29 29
65
В литературе нет данных об участии окситоцина в регуляции эмбриогенеза. Подтверждением его функциональной активности на этом этапе онтогенеза служат данные, полученные нами при изучении влияния медицинских препаратов, содержащих окситоцин, которые каждый в разной степени сокращали сроки эмбриогенеза и изменяли продолжительность отдельных его стадий [16; 17].
Таким образом, под влиянием вводимых препаратов существенно меняется характер гормонального гомеостаза в организме, что приводит к специфическим для исследуемого семейства гормонов эффектам, связанным с изменением работы различных систем органов, в частности репродуктивной системы. Влияние окситоцина проявляется уже на ранних этапах онтогенеза и существенно меняет репродуктивную стратегию вида в целом. Изученные нейропептиды обладают морфогенетической активностью и включаются в естественные механизмы регуляции регенерации у планарий.
Полученные результаты продемонстрировали хорошие возможности предложенной тест-системы, учитывающий моллюсков и плоских червей, для изучения активности пролиферации и характера влияния нейрогипофизарных гормонов на репродуктивную стратегию вида.
Список литературы
1. Dodson S. I., Shurin I. B., Girvin K. M. Daphnia reproductive bioassay for testing toxicity of agueous samples and presence of an endocrine disrupter / / Wisconsin Alum. Research Foundation. 2000. № 8. Р. 76 — 84.
2. Mayers P., Couillard P. The Amphiphilic of Vasopressin and Analogues on the Plasma Membrane of Amoeba proteus / / General and comparative endocrinology. 1990. Vol. 80. Р. 24-32.
3. Crus L. I., de Santos V., Zataralla G. C., et al. Invertebrate vasopressin/ oxytocin homologs // I. of Biol. Chem. 1998.Vol. 262. № 33. Р. 15821-15824.
4. Kesteren R. E., Smit B. A., De Lang P. R., et al. Structural and Functional Evolution of the Vasopressin/Oxytocin Superfamily: Vasopressin-Related Conopressin Is the Only Member Present in Lymnea, and Is Involved in the Control of Sexual Behavior // The Joumal of Neuronscience. 1995. Vol. 15(9). Р. 5989-5998.
66
5. Черниговская Е. В., Жуков Д. А. Вазопрессин- и окситоцинергические системы у линий крыс, селективных по способности к выработке активного избегания // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1995. Т. 31. № 5; 6.
6. Красновская И. М., Глазова М. В., Макина Д. М. Взаимодействие между вазо-прессинергическими клетками крупноклеточных центров гипоталамуса и щитовидной железой у крыс // Там же. 1998. Т. 34. № 6.С. 683—689.
7. Шейман И. М. Mорфогенетическая функция нейропептидов / / Sech. Phisiol. J. 1989. 75. № 5. С. 619—625.
8. Schurman W., Roland P. Inhibition of regeneration in the planarian Dugesia polychroa (Schmidt) by treatment with magnesium chloride: a morphological study of wound closure // Hydrobiologia. 1998. 383. Р. 111—116.
9. Тирас Х. П., Сахарова Н. Ю. Прижизненная морфометрия регенерации планарий // Онтогенез. 1984. Т. 15. № 1. С. 374 — 380.
10. Астауров Л. П. Объекты биологии развития. М., 1975.
11. Лиознер Л. Д. Основные проблемы учения о регенерации. М., 1975.
12. Тирас Х. П., Шейман И. М. Химические факторы — регуляторы морфогенеза планарий // Онтогенез. 1984. Т. 15. № 4. С.374—380.
13. Сахарова Н. Ю., Гордон Р. Я. Нейросекреторная активность в период регенерации планарий // Там же. 1981. Т. 12. С. 152 — 154.
14. Khan H. R., Ashton M. L., Mukai S. T. Tne effect of mating on the structure of neurosecretory caudodorsal cell in Helisoma durei (Mollusca) / / Can. J. Zool. 1992. 32. № 5. Р. 198—214.
15. Pokora Z. Hormonalna kontrola procesow rozrodczuch u slimacow ptuco-dysznych. Stilommatophora // Prz. Zool. 1989. № 2. Р. 207—229.
16. Никитина С. М. Влияние экзогенных стероидных соединений на эмбриогенез прудовика обыкновенного (Lymnaea stagnalis L.) // Гидробиологические исследования в бассейне Атлантического океана: Сб. науч. тр. Калининград, 2000. Т. 1. С. 114—121.
17. Кудикина Н. П. Влияние гормональных соединений на отдельные этапы онтогенеза большого прудовика (Lymnaea stagnalis Lam., 1799) / / Гидробиологические исследования в бассейне Атлантического океана: Сб. науч. тр. Калининград, 2000. Т. 1. С. 122—123.
Об авторе
Н. П. Кудикина, канд. биол. наук, доц., РГУ им. И. Канта, [email protected].
