CC BY
140
- УДК 565.3
122
Н. П. Кудикина
DAPHNIA MAGNA STRAUS (1826) (CLADOCERA, CRUSTACEA) КАК ТЕСТ-ОБЪЕКТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭНДОКРИННЫХ НАРУШЕНИЙ У ГИДРОБИОНТОВ
Изучен характер воздействия препарата преднизолона — аналога гормона позвоночных гидрокортизона — на активность соматического роста, работу кровеносной системы, плодовитость и рождаемость вет-вистоусого рачка Daphnia magna Straus (1826) (Cladocera, Crustacea) в ряду трех последовательных поколений. Гормон оказал достоверное влияние на исследуемые морфофункциональные показатели жизнедеятельности дафний. Это свидетельствует о чувствительности выбранного тест-объекта к экзогенным гормонам и позволяет предложить использовать дафний для оценки эндокринных нарушений у гидробионтов.
This article examines the effect of prednisolone - an analogue of the vertebrate hormone hydrocortisone - on the activity of somatic growth, blood system function, fecundity, and reproductive rate in Daphnia Straus (1826) (Cladocera, Crustacea) in three consecutive generations. This hormone had a proven effect on the studied morpho-functional characteristics of Daphnia. It indicates that the test object is sensitive to exogenous hormones, therefore, Daphina can be used in assessing endocrine disorders in aquatic organisms.
Ключевые слова: ракообразные, дафнии как тест-объекты, преднизолон, эндокринные нарушения, соматический рост, частота сердечных сокращений, плодовитость, рождаемость.
Key words: crustaceans, Daphnia as a test object, prednisolone, endocrine disorders, somatic growth, rate of cardiac contractions, fecundity, reproductive rate.
Появляется все больше сведений о наличии в водной среде веществ, вызывающих нарушения в эндокринной системе гидробионтов. Такие расстройства могут вызывать промышленные ксенобиотики, природные гормоноподобные соединения (микоэстрогены, дифенольные фи-тоэстрогены и др.), а также гормональные соединения, попадающие в воду с различными стоками и как продукты метаболизма гидробионтов
[1-3].
© Кудикина Н. П., 2015
Вестник Балтийского федерального университета им. И. Канта. 2015. Вып. 1. С. 122 — 130.
Эндокринные механизмы управления метаболизмом действуют на разных уровнях организации. Этим объясняется высокая чувствительность эндокринной системы к любым внешним и внутренним факторам, нарушающим гормональный гомеостаз в организме животных [4].
Одна из самых острых проблем экологического мониторинга — поиск индикаторов, обладающих хорошо выраженной чувствительностью к определенной группе соединений. Для изучения эндокринных нарушений тест-объекты должны иметь хорошо сформированную эндокринную систему, обеспечивающую их чувствительность к гормональным факторам, а фенотипические изменения — отражать характер воздействия фактора и степень его отклонения от нормы.
Среди беспозвоночных наиболее развитой и хорошо изученной эндокринной системой с наличием всех основных элементов, характерных для позвоночных, обладают ракообразные [5 — 7]. По химической природе гормоны ракообразных представлены как специфическими для этой группы соединениями, так и гормонами, идентичными пептидным и стероидным гормонам позвоночных. Растущее внимание к группе стероидов связано с появлением в литературе данных об их физиологической роли у ракообразных в реализации основных процессов жизнедеятельности [3; 8 — 10]. У отдельных видов при экзогенном введении часть из них способна влиять на рост, размножение и стероидный метаболизм [2; 3; 11; 12]. Однако эти работы немногочисленны и касаются лишь отдельных сторон физиологической активности.
Благодаря хорошо развитой эндокринной системе и высокой чувствительности к экзогенным гормональным факторам ракообразные могут стать удобным тест-объектами для изучения эндокринных нарушений. В практике токсикологии для этого давно используется ветвисто-усый рачок Daphnia magna Straus (1826).
Цель работы было изучение влияния преднизолона — синтетического аналога гидрокортизона (гормона группы глюкокортикоидов) — на изменения комплекса морфофункциональных особенностей ветви-стоусого рачка D. magna в ряду трех последовательных поколений для разработки тест-методики оценки характера воздействия экзогенных гормональных соединений на гидробионтов.
Материалы и методика
В эксперименте использовали рачков D. magna Str. (Cladocera, Crustacea) в возрасте 2—3 дней размерами 0,8—1,2 мм из лабораторной культуры. Каждый эксперимент длился 28 суток. Изучали характер воздействия гормонального препарата стероидной природы — пред-низолона. Экспериментальные среды для содержания рачков получали путем внесения в дехлорированную воду гормонального препарата. Использованный препарат преднизолон представляет собой дегидрированный аналог гидрокортизона и обладает сходными с ним свойствами, но его воздействие эффективнее самого гидрокортизона в 3—5 раз.
Рабочие концентрации гормона определяли в ходе серии предварительных экспериментов с использованием линейки разных концентраций гормонов. Средой для содержания контрольных животных служила дехлорированная вода. Животные содержались в сосудах емкостью 500 мл при температуре 17—19 °С. Плотность посадки составля-
ла 20 ос./л. Смену растворов и кормление животных проводили через каждые 72 часа. В качестве корма использовали свежеприготовленную смесь из негустой суспензии пекарских дрожжей и гомогенат различных водорослей. Численность особей в контрольной и экспериментальной группах составляла 300 рачков. Полученные данные по двум экспериментальным группам дафний были объединены, поскольку они оказались практически идентичными.
Экспериментальные серии опыта проведены в двух повторностях. Характер воздействия выбранной концентрации препарата изучался на трех последовательных партеногенетических поколениях дафний: родительское поколение (Р), первое (Б1) и второе (Б2) дочерние поколения. Препарат вносили в первые сутки эксперимента, и исследуемые показатели регистрировали один раз каждые три дня после начала опыта. Исследовали характер влияния преднизолона на линейный рост дафний (мм), частоту сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин), плодовитость (число яиц в выводковых камерах, экз. яиц/самку) и рождаемость (экз. личинок / самку). Цифровые данные обрабатывались стандартными статистическими методами с использованием критерия Стьюдента при уровне достоверности 95 %.
Результаты исследований
В среде с преднизолоном у животных родительского поколения активность соматического роста снижалась, особенно заметно в период с 7-х по 10-е сутки опыта. Ингибирующий эффект сохранялся до 16-х суток. Во второй половине эксперимента выявлен противоположный эффект препарата. Размеры дафний до конца эксперимента достоверно превышали контрольные значения.
У дафний Б1 показатели соматического роста в экспериментальной группе начиная с 4-х суток опыта были достоверно выше контрольных. Высокая скорость роста сохранялась в этой группе до 16-х суток опыта. С начала последней декады эксперимента и до его конца интенсивность роста в обеих группах совпадала, поэтому конечные размеры дафний были сходными.
Тенденция к увеличению активности линейного роста сохранялась у дафний Б2 начиная с 4-х суток опыта и до конца эксперимента. Дефинитивные размеры животных в обеих группах достоверно различались между собой (табл. 1).
Таблица 1
Изменение линейных размеров (мм) под влиянием преднизолона
Группа Сутки опыта
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28
Рк 1,0 1,3 2,0* 2,4* 2,5 2,9 3,0 3,0* 3,1* 3,2*
Рэ 1,0 1,2 1,7 2,1 2,3 2,7 3,1 3,3 3,4 3,5
Б1к 1,0 1,4 2,1* 2,5* 2,7* 3,9* 3,1 3,2 3,2 3,2
Б1э 1,0 1,8 2,3 2,9 3,0 3,1 3,1 3,2 3,2 3,3
Б2к 1,1 1,3 1,7* 2,1* 2,4 2,5* 2,7 2,8 2,8* —
Б2э 1,1 1,6 2,3 2,5 2,7 2,9 3,0 3,1 3,3 —
К — контроль; Э — эксперимент; * — достоверные различия.
Наличие экзогенного преднизолона существенно влияло на активность работы сердца животных. У дафний родительского поколения сразу после внесения препарата наблюдалось резкое снижение частоты сердечных сокращений. Ингибирующее действие сохранялось в течение 7 дней. В дальнейшем присутствие препарата, наоборот, приводило к постепенному усилению сердечной деятельности. Максимальные значения ЧСС были зарегистрированы в период с 13-х по 16-е сутки эксперимента. В последней декаде эксперимента стимулирующий эффект снижался вплоть до полного исчезновения в последние дни опыта.
После помещения в среду с гормоном у дафний дочернего поколения Б1 наблюдалось стойкое снижение ЧСС, продолжавшееся в течение _
14 суток опыта. Положительный эффект был очень кратковременным — 125 только 16-е сутки). До конца эксперимента показатели ЧСС в обеих группах различались мало.
Содержание в растворе с преднизолоном дафний Б2 приводило к резкому снижению ЧСС. Выраженный кардиотоксический эффект был заметно короче, чем у дафний Б2 — всего 3 суток (4 — 7-е сутки). И в этом случае до конца эксперимента работа сердца в исследуемых группах существенно не отличалась (табл. 2).
Таблица 2
Изменение ЧСС (уд./мин) под влиянием преднизолона
Группа Сутки опыта
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28
Рк 312* 331* 348* 324* 281* 291* 272 292 280 304
Рэ 260 302 334 394 317 320 287 301 274 312
Б1к 352 352* 361 313* 338* 272* 320 286 300 300
Б1э 348 311 316 279 310 323 306 308 301 200
Б2к 300 338* 353* 315 316* 314* 316 314 314 —
Б2э 300 280 296 306 336 330 310 308 310 —
К — контроль; Э — эксперимент; * — достоверные различия.
Появление первых яиц в выводковых камерах дафний (Р) опытной и контрольной групп было зарегистрировано на 7-е сутки опыта. Количество яиц у самок в среде с препаратом была заметно выше, чем в контроле. К 13-м суткам плодовитость рачков достигла максимальных значений (9,3 яиц/ самку), в контрольной группе их было почти в 3 раза меньше (3,2 яиц/ самку). Максимальная активность откладки яиц сохранялась у экспериментальных дафний в течение 7 дней (13 — 19-е сутки). В контроле пик начался позже и был короче по времени (19 — 22-е сутки). Максимальные значения плодовитости у интактных и опытных животных близки между собой. По мере завершения эксперимента динамика яйцекладки в исследуемых группах различалась: в контроле снижалась постепенно, а в экспериментальной группе на 25-е сутки опыта был зарегистрирован еще один отчетливый пик ее увеличения.
В выводковых камерах дафний первые яйца появились одновременно с контролем — на 4-е сутки опыта. Преднизолон заметно стимулировал активность их формирования: к 7-м суткам различия между плодовитостью рачков двух исследуемых групп достигли достоверных значений. Максимальные значения были зарегистрированы у экспериментальных животных уже на 10-е сутки опыта. Высокая активность откладки яиц сохранялась у них в течение следующих 6 дней (10—16-е сутки). У интактных животных максимальный уровень плодовитости был отмечен только на 13-е сутки опыта, после чего активность формирования яиц резко снижалась и уже к 16-м суткам достигала минимума. В экспериментальной группе это происходит позднее, на 19-е сутки опыта. При завершении эксперимента количество яиц у самок обеих групп было сходным.
У дафний третьей генерации резкое увеличение плодовитости происходит в самом начале опыта — уже к 7-м суткам регистрировалось максимальное количество яиц, почти в 8 раз превышающее контрольные значения. После этого их число постепенно снижалось, оставаясь до 16-х суток существенно выше, чем в контроле (более чем в 1,5 раза). Далее, до конца количество яиц у экспериментальных дафний было выше, чем в контроле, но уровень зарегистрированных различий оказался значительно ниже, чем в начале опыта. Максимальная плодовитость дафний в чистой воде наблюдалась позже, чем в опыте, — на 10-е сутки, после чего существенно не менялась. В конце эксперимента плодовитость в обеих группах была практически одинаковой (табл. 3).
Таблица 3
Изменение плодовитости (экз. яиц/самку) под влиянием преднизолона
Группа Сутки опыта
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28
Рк — — 2,3* 5,3 3,2* 5,9* 9,8 8,0* 3,0* 1,6
Рэ — — 3,9 6,7 9,3 7,6 9,7 5,0 7,5 1,9
Б1к — 2.2 2,5* 7,1* 10,4 3,2* 6,4 3,9 5,6 5,7
Б1э — 3,5 4,6 10,4 9,4 10,6 6,1 5,7 5,7 5,7
Б2к — — 0,8 0,8* 3,4* 1,1* 6,7* 4,0* 3,5 —
Б2э — — 1,1 4,0 6,2 3,1 13,0 8,0 5,0 —
К — контроль; Э — эксперимент; * — достоверные различия.
В двух группах родительского поколения (Р) выход молоди начинался одновременно — на 10-е сутки опыта. Динамика этого процесса в эксперименте и контроле различалась. В контрольной группе максимальное число молоди появлялось в течение 13 — 16-х суток, после этого активность выхода резко снижалась и к 19-м суткам достигала минимума. У экспериментальных животных высокие и близкие по значению к контролю показатели держались вплоть до 19-х суток, после чего коли-
чество молоди постепенно снижалось. В чистой воде непосредственно перед завершением эксперимента (25-е сутки) возникал еще один короткий пик активности выхода молоди.
Появление первых потомков у дафний как в опыте, так и в контроле, совпало (7-е сутки). Количество рождаемых особей в гормональной среде были значительно ниже контрольного уровня. Активность выхода молоди в экспериментальной группе нарастала гораздо быстрее, чем в чистой воде, и в течение 10—13-х суток опыта их количество было уже достоверно выше, чем в контроле, где это произошло только к 16-м суткам. Во второй половине эксперимента динамика рождаемости
в исследуемых группах была сходной. Количество молоди в обеих -
группах также совпадало. Исключение — последние сутки опыта, когда 127 у животных в чистой воде произошел резкий скачок рождаемости.
В контрольной и опытной группах дафний Б2 первая молодь появилась на 7-е сутки. Рождаемость была сходной. Динамика активности выхода молоди в чистой воде и среде с гормоном совпадала. В течение всего опыта количество рождаемых особей у экспериментальных животных было выше, чем у контрольных (табл. 4).
Таблица 4
Изменение рождаемости (экз. личинок /самку) под влиянием преднизолона
Группа Сутки опыта
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28
Рк — — — 2,9 6,7 6,6* 1,6* 2,0* 3,8* 1,3
Рэ — — — 3,3 6,2 5,0 5,6 3,8 2,1 1,1
Б1к — — 2,2* 2,5* 3,8* 6,8 5,7 2,7 1,4 13,3
Б1э — — 0,03 4,6 6,4 6,6 6,0 3,4 2,0 8,0*
Б2к — — 0,8 0,8* 3,4* 1,1* 6,7* 4,0* 3,5* —
Б2э — — 1,1 4,0 6,3 3,1 13,6 8,0 5,0 —
К — контроль; Э — эксперимент; * — достоверные различия.
Обсуждение результатов
Выявлена общая тенденция в характере воздействия препарата на соматический рост и репродуктивную активность. Она проявляется в усилении стимулирующего эффекта гормона в ряду исследуемых поколений. В рамках этой тенденции каждой генерации дафний были присущи свои особенности ответных реакций, связанные с различиями исследуемых физиологических функций.
По отношению к ростовым и анаболическим процессам у позвоночных глюкокортикоиды служат антагонистами соматотропного гормона, регулирующего рост. Однако их активность может значительно варьировать в зависимости от концентрации. Введение заместительных доз кортизола адреналэктомированным животным способствует их росту, тогда как фармакологические дозы его тормозят [13].
У ракообразных процессы роста, созревания и размножения тесно сопряжены с линочным циклом, нормальный ход которого обеспечива-
ется сложной системой эндокринной регуляции, включающей нейро-секреторные центры и специализированные эпителиальные железы. Известны две основные группы гормонов, управляющих линькой: ней-росекреторные гормоны комплекса Х-орган — синусная железа, ингиби-рующие линьку, и стероидные гормоны экдизоны, производные Y-ор-гана, стимулирующие ее [6].
У некоторых ракообразных показано наличие еще одной группы стероидов — половых и глюкокортикоидов, — идентичных гормонам позвоночных. Они активно участвуют в регуляции разных этапов онтогенеза [2; 5; 7; 8].
Наиболее подробно количественное содержание глюкокортикои-дов изучено в жизненном цикле двух видов речных раков. Динамика гидрокортизона тесно коррелирует с характером распределения гликогена в тканях на разных стадиях линьки, что вполне согласуется с общими представлениями о них как о регуляторах жирового и углеводного обмена. Это позволяет предположить, что глюкокортикоиды, наряду с экдизонами, могут участвовать в обеспечении всех пред- и по-слелиночных перестроек [8].
Прямые указания на участие гидрокортизона в процессе линьки у дафний отсутствуют. Косвенным подтверждением этого может служить изменение количества данного гормона у дафний под влиянием экзогенных окситоцина и эстрадиола, сопровождавшееся увеличением числа линек и плодовитости [3]. Линька и выход потомства у дафний синхронизированы: молодь выходит из выводковых камер непосредственно перед линькой [14]. Обнаруженное нами возрастание рождаемости у экспериментальных дафний, возможно, косвенное подтверждение увеличения числа линек. Это дает преимущества экспериментальным животным для увеличения линейных размеров тела по сравнению с ин-тактными.
Можно предположить, что наличие в среде преднизолона приводит к нарушению природного баланса гормонов и, как следствие, изменению общего уровня метаболизма у дафний, что нашло свое отражение в нарушении работы всех систем организма.
Подтверждением способности экзогенных стероидов включаться в регуляцию процессов линьки и размножения служат опыты с модельным эстрогеном диэтилстилбэстролом (ДЭС). Нарушение гормонального гомеостаза, вызванное изменением систем его ферментного обеспечения, проявлялось в снижении числа линек и плодовитости в ряду нескольких поколений дафний. Кормление креветок Fenneropenaeus indiens (у автора — устаревшее Penaeus indiens) пищей с добавками про-пионата тестостерона и ДЭС приводило к увеличению скорости роста, а гонадотропин человека задерживал рост ювенильных особей [12].
В линочном цикле ракообразных процессы роста и размножения регулярно чередуются друг с другом. Это связано с последовательностью включения гормонов, стимулирующих и подавляющих линьку [6]. Одновременное увеличение линейных размеров, рождаемости и плодовитости у экспериментальных дафний свидетельствует о нарушении естественного механизма регуляции этих процессов под влиянием
преднизолона. Нарастание стимулирующего эффекта в ряду исследованных поколений может быпъ связано с накоплением гормона в организме дафний, постоянно живших в экспериментальных средах. Нарушения эндокринного гомеостаза, выпзванные преднизолоном, могли привести к нарушению систем метаболизма.
Действие гормона на активность работы сердца у трех исследованных поколений проявлялось только в первой половине опыта и имело ингибирующий характер. Следовавшие за этим периоды стимуляции быыли непродолжительными. Есть данные о прямом воздействии преднизолона на сердечную мышцу позвоночных. Накапливаясь в ней, гормон увеличивал сократимость миокарда, повышал артериальное давление и в целом служил кардиостимулятором [15]. У ракообразных частота и амплитуда сердечных сокращений находятся под регулирующим действием нейроэндокринного перикардиального органа, также стимулирующего работу сердца [6].
В качестве вероятного механизма угнетающего действия преднизолона на величину ЧСС у дафний можно предположить его способность включаться в общий сложный механизм эндокринной регуляции, что ведет к резкому изменению гормонального гомеостаза. Это изменение проявляется в нарушении нормального функционирования разных систем организма, включая кровеносную.
Подтверждением способности гидрокортизона включаться в регуляцию процессов жизнедеятельности у беспозвоночных животных могут быгть данные, полученные нами ранее. Так, у планарий гидрокортизон выыраженно стимулировал скорость регенерации [16]. У брюхоногих моллюсков он менял скорость прохождения начальных стадий эмбриогенеза, сокращая в результате общее время, необходимое для развития эмбрионов [17]. Динамика гормона в жизненном цикле двустворчатых и головоногих моллюсков позволяет говорить о его участии в регуляции процессов гаметогенеза [18; 19]. Увеличение уровня этого гормона, обнаруженное у некоторых видов двустворок, живущих в условиях стресса, может быгть свидетельством включения его в реализацию процессов адаптации у моллюсков [10; 18].
Наличие у дафний комплекса выграженных ответных реакций на введение экзогенного преднизолона свидетельствует о высокой гор-мончувствительности этого вида. Изменения характера линейного роста, репродуктивной и сердечной активностей отражают характер и степень воздействия препарата на выбранные тест-функции. Можно предположить, что внесение дополнительных доз препарата в организм дафний приводит к нарушению гормонального гомеостаза и, как следствие, нормальной реализации основных функций организма. Все это позволяет предложить Daphnia magna в качестве тест-объекта для оценки эндокринных нарушений у гидробионтов.
Список литературы
1. Ezratty V. L'hypothese des perturbateurs endocriniens: Sensationnalisme ou science // Energ.-sante. 1998. Vol. 9, N 2. P. 167-176.
2. Dodson S., Shurin I., Girvin K. Daphnia reproductive bioassay for testing toxicity of agueous samples and presence of an endocrine disrupter // Wisconsin Alum. Research Foundation. 2000. № 8. P. 76-84.
3. Полунина Ю. Ю. Сообщество ветвистоусых ракообразных в специальных условиях эстуария : автореф. ... канд. биол. наук. Калининград, 2006.
4. Баранов В. Г. Физиология эндокринной системы. Л., 1979.
5. Fingerman M., Nagabhushanam R., Sarojini К. Vertebrat-type hormones in crustaceans: localization, identification and functional signification // Zool. Sci. 1993. Vol. 10, № 1. P. 13-29.
6. Проссер Л. Сравнительная физиология животных. М., 1978. Т. 3.
7. Rene L. The endocrinology of invertebrates //Ecotoxicology. 2000. N 1 — 2. P. 41—57.
8. Чибисова Н. В. Динамика стероидных гормонов на отдельных этапах онтогенеза речных раков : автореф. ... канд. биол. наук. Л., 1989.
9. Summavielle T., Rocha M., Ribeiro et al. In vitro metabolism of steroid hormones by ovary and hepatopancreas of the crustacean Penaeid shrimp Marsupenaeus ja-ponicus // Sci. mar. 2003. Vol. 67, № 3. P. 299 — 306.
10. Никитина С. М. Стероидные гормоны у беспозвоночных животных. Л., 1982.
11. Кудикина Н. П. Особенности ответных реакций организма ракообразных на экзогенные эндокринные соединения // Тезисы докладов VIII съезда гидробиологического общества РАН. Калининград, 2001. Т. 1. C. 18 — 22.
12. Baldwin W., Milam D., Leblanc G. Physiological and biochemical perturbation in Daphnia magna following exposure to the model environmental diethylstilbestrol // Environ. Toxicol. and chem. 1996. № 3. P. 945 — 952.
13. Тeппермен Д., Теппермен Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы М., 1989.
14. Zaffagnini F. Reproduction in Daphnia // Mem. Ist. ital. idrobiol. «Dott. M. Marchi». 1987. № 45. P. 245—285.
15. Колпаков М. Г. Механизмы кортикостероидной регуляции функций организма. Новосибирск, 1978.
16. Кудикина Н. П. Влияние экзогенных гормональных соединений на процесс регенерации у плоских червей // Вестник Российского государственного университета им. И. Канта. 2012. Вып. 7. С. 84 — 91.
17. Kudikina N.P. Effect of Hormonal Compounds of Embriogenesis of the Pond Snail Lymnaea stagnalis (L., 1758) // Journal of Developemental Biology. 2011. Vol. 42, № 3. P. 179—184.
18. Кудикина Н. П. Стероидные гормоны в жизненном цикле двустворчатых моллюсков. // Вестник Российского государственного университета им. И. Канта. 2008. Вып. 7. С. 79—86.
19. Кудикина Н. П. Экологические аспекты динамики стероидных гормонов в репродуктивном цикле морских двустворчатых, брюхоногих и головоногих моллюсков // Уч. записки Казанского ун-та. 2007. Т. 9, № 3. С. 214 — 224.
Об авторе
Наталья Петровна Кудикина — канд. биол. наук, доц., Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград.
E-mail: [email protected]
About the author
Dr Natalya P. Kudikina, Associate Professor, Immanuel Kant Baltic Federal University, Kaliningrad.
E-mail: [email protected]
