CC BY
34
УДК 579.66; 57.033
Мурзина Е.Д.*, Занина О.С., Бутырин С.П., Побережный Д.Ю., Атрощик Е.А., Нагаева В.Е., Трищенкова А.В., Гордиенко М. Г., Кузнецов А.Е., Калёнов С.В.
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия, 125047, Москва, Миусская площадь, дом 9
*e-mail: [email protected]
ИНТЕГРАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССА РАСПЫЛИТЕЛЬНОЙ СУШКИ ГАЛОБАКТЕРИЙ
В работе представлены результаты исследования распылительной сушки биомассы галобактерий на лабораторной установке BÜCHI B-290. В качестве варьируемых параметров были выбраны температура и расход сушильного агента, расходы сжатого воздуха и исходной биосуспензии, подаваемых на форсунку. Предложена интегральная характеристика состояния высушенного материала при хранении, включающая оценку лаг-фазы, выживаемости, содержания каротиноидов, уровня накопления биомассы при глубинном культивировании.
Ключевые слова: хранение галобактерий, сушка галобактерий, метаболиты галобактерий, экстремальные галофилы.
Экстремально галофильные микроорганизмы НаЪЪа^епит salinarum являются перспективными объектами культивирования промышленного масштаба. Разнообразное применение находят биологически активные вещества этих микроорганизмов: термостабильные ферменты, липиды, осмопротекторы, каротиноиды, галоцины. Биомасса галобактерий используется как биологически активная добавка с
иммуностимулирующими и радиопротекторными свойствами, а белок фотосистемы бактериородопсин применяется в прототипах биоэлектронных устройств [1].
Культивирование галобактерий - нестабильный в производственных масштабах процесс, связанный с неустойчивостью штаммов, отравлением среды метаболитами, гибелью культуры от различных видов стресса (механический, тепловой, осмотический шок и др.). Выработка метаболитов, связанных с химическим/фотохимическим окислением клеточных компонентов и среды культивирования влияет на выход и состояние биомассы. Полученная при культивировании в стандартных условиях биомасса имеет, с учетом выработки метаболитов и их влияния на клеточные компоненты, непостоянный состав, что определяет ее характеристики, особенно в высушенных препаратах при хранении.
Разработанный подход к культивированию галобактерий с использованием адсорбентов и ионообменных смол уменьшает негативные последствия стрессовых воздействий на клетку (фотохимические процессы в среде при температуре культивирования 38° C и аэрации), устраняет основную долю метаболитов [2], которые концентрируются в адсорбенте/ионообменной смоле, что можно показать методами ВЭЖХ. Идентификация накапливающихся метаболитов представляет отдельную задачу, однако влияние их на хранение культуры можно дифференцировать при сравнении биомассы, высушенной в различных условиях, выращенной при использовании сорбента/ионообменной смолы в сравнении со стандартными условиями культивирования.
В массовом производстве препаратов на основе галобактерий кроме обеспечения максимального выхода биомассы и целевых клеточных компонентов приоритетной является технология последующего высушивания биомассы с целью длительного сохранения компонентов клетки в нативном состоянии. Традиционным способом сушки многих микроорганизмов является сублимационная сушка под вакуумом - периодический процесс, характеризующийся высокими эксплуатационными затратами и длительностью. Распылительная сушка в ряде случаев успешно применяется в качестве альтернативной технологии обезвоживания биомассы благодаря малому времени контакта высушиваемого материала и нагретого сушильного агента, высокой скорости испарения влаги и тем самым предотвращение перегрева термочувствительных материалов при правильно выбранных условиях ведения процесса. Полученные параметры распылительной сушки могут послужить "ускоренной" аналогией процессов происходящих в природе при высушивании галобактерий и дать подходы к объяснению случаев внезапных взрывных вспышек роста галофильных микроорганизмов в природе.
Культивирование галобактерий (штаммы КСК-03307 и 353П) проводилось в колбах по методике с внесением и без внесения адсорбента/ионообменной смолы [3]. Использовались два типа материалов, успешно удаляющих метаболиты галобактерий: 1 -инкапсулированный в оболочку агара активированный уголь АГ-3, 2 - Hypersol-Macronet МЫ500, фирмы РигоШе.
Исследования распылительной сушки биомассы галобактерий проводились на лабораторной установке распылительной сушки В-290, предоставленной швейцарской компанией ВиСН1. При проведении экспериментальных работ варьировались температура (от 120 до 160°С) и расход (от 30 до 40 м3/ч) сушильного агента, подаваемого в аппарат; расход сжатого воздуха, подаваемого на пневматическую форсунку (в результате перепад давления на форсунке
варьируется от 0,34 до 0,64 атм) и скорость подачи высушиваемой биомассы галобактерий (от 0,28 до 0,32 кг/ч). В результате исследований были получены сыпучие порошки с остаточным влагосодержанием не превышающим 2 %.
На рис. 1 представлены фотографии высушенной биомассы. Видно, что частицы имеют сферическую
форму; средний размер частиц лежит в интервале от 20 до 36 мкм в зависимости от условий ведения процесса. Результаты исследования
гранулометрического состава высушенной биомассы представлены на рис. 2.
Рис. 1. Биомасса галобактерий на фоне соли
Основным критерием эффективности процесса сушки являлась выживаемость микроорганизмов, оценка лаг-фазы (стремление ее к минимуму), накопление биомассы к концу культивирования и распад каротиноидов, поскольку при гибели клеток 45%
возможно окисление их компонентов, что снижает ценность продукта. Для оценки данного показателя качества проводили высевы полученных сухих образцов методом Коха на стандартную агаризованную среду для галобактерий.
- - - Т=140 С, Ррасп=0.46 атм.
--Т=127С, Ррасп= 0.34 атм.
-Т=120 С, Ррасп=0.46 атм.
--Т=127 С, Ррасп= 0.64 атм.
--Т=160 С, Ррасп=0.46 атм.
ч -ч
. ■ о
1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 91-100
Размеры частиц во фракции, мкм Рис. 2. Гранулометрический состав образцов
Рост галобактерий продолжался 7 дней при глубинном культивировании в колбах и до 14 на агаризованной среде в условиях повышенной влажности. Подсчет колоний производился визуально. Выживаемость полученных
распылительной сушкой образцов составила от 32 до 65 %.
Результаты культивирования и высевов с использованием в качестве инокулянта высушенных образцов сравнивались с результатами контрольного культивирования и высева исходной биомассы галобактерий. Количество инокулята сухих образцов рассчитывалось таким образом, чтобы в нем содержалось столько же клеток, сколько их содержалось в 2 мл инокулята контрольной суспензии с оптической плотностью 0,75 (измерения проводятся при длине волны Х=540 нм). Засев проводится трижды
для усреднения получаемых показателей. Некоторые полученные результаты представлены на рис. 3.
2,50
■ - ■ Т=140 С, Ррасп=0.46 атм
--Т=160 С, Ррасп=0.4б атм
2 до — • т=120 С. Ррасп=0-4б атм
1,50
0,50
0.00
-Т=127 С, Ррасп=0.64 атм
— ■ Т=127 С, Ррасп=0.34 атм —О— эталон
40 50 Время, ч
Рис. 3. Начальные участки кривых роста контрольного и высушенных образцов
Проведенные опыты позволили предложить интегральную характеристику состояния
высушиваемых образцов, фиксирующуюся в дальнейшем на протяжении 2 лет и базирующуюся на весовом вкладе следующих характеристик по убыванию значимости: продолжительность лаг-фазы, выживаемость клеток, содержание каротиноидов,
конечном уровне биомассы при глубинном культивировании.
Интересным является тот факт, что образцы, высушенные при более высоких температурах, показывают лучшую выживаемость и сохранность каротиноидов в процессе хранения.
Мурзина Екатерина Дмитриевна аспирантка 1 года обучения кафедры биотехнологии Занина Ольга Сергеевна аспирантка 2 года обучения кафедры биотехнологии
Бутырин Сергей Павлович, Побережный Даниил Юрьевич, Атрощик Евгения Александровна, Нагаева Виктория Евгеньевна студенты 2 курса кафедры биотехнологии
Гордиенко Мария Геннадьевна к.т.н., в.н.с. НИЧ РХТУ им.Д.И. Менделеева
Трищенкова Анастасия Владимировна
Кузнецов Александр Евгеньевич к.т.н., доцент кафедры биотехнологии Каленов Сергей Владимирович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии Организация: РХТУ им.Д.И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Wagner N. L. et al. Directed evolution of bacteriorhodopsin for applications in bioelectronics //Journal of The Royal Society Interface. - 2013. - Т. 10. - №. 84. - С.97.
2. Каленов С.В. Культивирование дрожжей и галобактерий в условиях контролируемого окислительного стресса: Дис. на соискание ученой степени канд.тех.наук: 03.00.23/ Каленов Сергей Владимирович; РХТУ им.Д.И. Менделеева.-М., 2007.
3. Кузнецов А.Е., Каленов С.В. Способы получения биомассы галобактерий // Патент России № 2323226.
Murzina Ekaterina Dmitrievna*, Zanina Olga Sergeevna, Butyrin Sergey Pavlovich, Poberezhniy Daniil Yuryevich, Atroshchik Evgeniya Alexandrovna, Nagaeva Viktoriya Evgenevna, Trishchenkova Anastasia Vladimirovna, Gordienko Mariya Gennadievna, Alexander Evgenevich Kuznetsov, Kalenov Sergey Vladimirovich
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: [email protected]
THE INTEGRATED CHARACTERISTIC OF PROCESS OF SPRAY DRYING OF HALOPHILIC BACTERIA.
Abstract
In work results of research of spray drying of biomass of halophilic bacteria on the laboratory BUCHI B -290 installation are presented. the varied parameters as temperature and an expense of the drying agent, expenses of compressed air and initial biosuspension, given on a nozzle were chosen. The integrated characteristic of a condition of the dried-up material at storage including an assessment a lag-phase, survival, the contents of carotinoids, level of accumulation of biomass at deep cultivation is shown.
Keywords: storage of halobacteria, drying of halobacteria, metabolites of halobacteria.
