CC BY
12Краткие сообщения / Brief Reports
УДК: 632.4 : 57.083.18
инсектицидные свойства некоторых фитопатогенных аскомицетов
А.о. Берестецкий, л.с. Аполлонова, с.в. сокорнова, Т.д. черменская
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Проведена первичная оценка инсектицидной активности фитопатогенных аскомицетов по отношению к виковой тле (Megoura viciae). Культуральный фильтрат девяти (45%) из 20 изученных изолятов грибов проявил инсектицидную активность по отношению к виковой тле (Megoura viciae). Экстракты из культурального фильтрата и мицелия патогена мака Brachycladium papaveris показали более высокую афицидную активность, чем эталонный коммерческий инсектицид. Таким образом, фитопатогенные аскомицеты могут являться продуцентами инсектицидных метаболитов.
ключевые слова: фитопатогены, аскомицеты, афицидная активность, виковая тля.
О взаимоотношениях грибов и насекомых известно достаточно много. С одной стороны, грибы (преимущественно аскомицеты) являются первичными или вторичными патогенами насекомых, с другой стороны, некоторые виды насекомых - мицетофаги. Кроме того, крайне интересны и недостаточно изучены отношения между насекомыми-фитофагами и фитопатогенными грибами. Занимая одну экологическую нишу - определенный орган растения-хозяина, - они, как правило, конкурируют за субстрат [Hatcher, 1995; Kluth et al., 2002; Dickson, Mitchell, 2010]. Насекомые могут быть переносчиками спор грибов, что на практике интересно для биологической борьбы с сорняками, либо для разработки профилактических мер борьбы с заболеваниями культурных растений [Hill et al., 2003; Feldman et al., 2008]. Много работ посвящено устойчивости растений к патогенам, индуцированной насекомыми, и наоборот [Mouttet et al., 2011; Boucias et al., 2012].
Полагают, что патогенность для насекомых среди сумчатых и несовершенных грибов (в том числе, фито-патогенных) не является редким, необычным феноменом [Борисов и др., 2001]. Так, из культурального фильтрата, полученного в результате ферментации возбудителя сетчатой пятнистости листьев ячменя (Pyrenophora teres) на
Материалы
Для изучения инсектицидной активности использовали 20 изолятов фитопатогенных грибов из рабочей коллекции лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР (табл. 1). Четыре из них отобрали для определения влияния продолжительности культивирования на их афицидную активность (табл. 2). Штамм Brachycladium papaveris N 30 был использован для изучения инсектицидной активности его экстрактов в сравнении с коммерческим ботаническим инсектицидом нимацаль (Neemazal TS, Trifolium, Германия).
Грибы культивировали в 100-мл конических колбах на двух жидких питательных средах (25 мл/колбу): глюкозо-аспаргино-вой среде (ГА) и синтетической среде M-1-D. Культуры грибов инкубировали стационарно 3 недели при переменном освещении (12 ч в день) и постоянной температуре 24°С. Для биологической оценки использовали супернатант, полученный в результате центрифугирования культуральной жидкости 10 мин при 14000 об/ мин. Определение антибиотической активности проводили методом бумажных дисков.
Гриб, показавший максимальную афицидную активность, культивировали 14 суток на жидкой питательной среде М-1-D общим объёмом 1 л. После отделения биомассы на фильтровальную бумагу культуральный фильтрат (850 мл) последовательно экстрагировали гексаном, хлористым метиленом, диэтиловым эфиром и этилацетатом по 300 мл дважды. Высушенный мице-
ряде жидких питательных сред, выделен и в 1996 г. запатентован ряд инсектицидных метаболитов [Manker et al., 1996]. У некоторых фитопатогенных грибов выявлены метаболиты с инсектицидными свойствами, характерные для энтомопатогенов. Так, деструксин В отвечает за патогенные свойства фитопатогенного гриба Alternaria brassicae и энтомопатогенного гриба Metarhizium anisopliae [Vey et al., 2001]. Фоменол обнаружен у Nigrospora sacchari и Hirsutella thompsonii var. synnematosa [Fukushima et al., 1998], боверицин - у Beauveria bassiana, видов Isaria и некоторых фитопатогенных видов рода Fusarium [Wang, Xu, 2012]. Эти данные предполагают неизученную до сих пор возможную эволюционную связь между некоторыми видами энтомопатогенных и фитопатогенных грибов, а также более широкую представленность продуцентов-хеморегуляторов поведения насекомых среди микроорганизмов филлосферы.
Целью данного исследования было проведение первичной оценки инсектицидной активности фитопатогенных аскомицетов по отношению к виковой тле (Megoura viciae Buckton) и определение дальнейших перспектив поиска и изучения хеморегуляторов поведения насекомых, образуемых упомянутой группой грибов.
и методы
лий вместе с фильтровальной бумагой экстрагировали 96% этанолом объёмом 100 мл сначала 1 час, затем - 1 сутки. Растворители отгоняли на роторном испарителе, после чего оценивали инсектицидную активность полученных экстрактов. Хромато-графическое разделение экстрактов проводили при помощи ТСХ в системе гексан-ацетон-уксусная кислота (70:30:1); хромато-граммы проявляли 10%-м раствором серной кислоты в этаноле при температуре 110°С.
Для определения контактной инсектицидной активности культурального фильтрата и экстрактов грибов использовали лабораторную культуру виковой тли (Megoura vicea), которую содержали при температуре 24°С и 16-часовом световом дне на проростках бобов.
Для первичной оценки инсектицидной активности грибов использовали культуральный фильтрат, которым пропитывали диски фильтровальной бумаги диаметром 3.6 см (250 мкл/диск) в пластиковой чашке Петри диаметром 4 см. Затем в чашки вносили личинок тли старшего возраста (около 20 особей/чашку). В качестве контроля использовали чистые питательные жидкие среды.
Для оценки инсектицидной активности экстрактов на фильтровальную бумагу наносили 250 мкг сухого вещества в ацетоне (в контроле - только растворитель), после упаривания которого бумагу пропитывали 250 мкл дистиллированной воды и перено-
сили в чашку Петри. В качестве эталона (положительного контроля) - 0.4%-й раствор препарата нимацаль. Опыт выполнен в 4 повторностях. Через 4 часа инкубации при искусственном
Результаты
Культуральный фильтрат девяти (45%) из 20 изученных изолятов вызывал гибель тли. При культивировании грибов на среде ГА выявлено 6 потенциальных продуцентов инсектицидных веществ, на среде M-1-D - 7. Заметную инсектицидную активность (более 30% погибших особей) проявил культуральный фильтрат пяти изолятов грибов: Ascochyta sp. N 8, Phoma exigua N 23, Phoma sp. K-44, Septoria sp. N 27, Verticillium dahliae N 33. Однако 100%-ю гибель насекомых не наблюдали. Важно отметить афицидную активность двух изолятов грибов из рода Septoria, относящихся к типичным патогенам растений (табл. 1). Химия грибов этого рода изучена недостаточно, чтобы предполагать наличие каких-либо инсектицидных веществ. Не известны также и данные о инсектицидной активности Phoma exigua и V. dahliae. Антибиотическая активность культурального фильтрата грибов к B. subtilis была слабой (зона лизиса не более 6 мм) или отсутствовала, поэтому трудно говорить о какой-либо её связи с афи-цидной активностью (табл. 1).
Таблица 1. Афицидная и антибактериальная активность 3-недельного культурального фильтрата 20 изолятов грибов в зависимости от состава жидкой питательной среды
Тест-организм
Megoura viciae Bacillus
Вид гриба Изолят* (обездвиженные особи, % к контролю) subtilis (зона лизиса, мм)
ГА M-1-D ГА M-1-D
Alternaría simmonsii S-142 0 20 0 0
Ascochyta pisi N 1 20 0 0 0
Ascochyta sp. S-6/ N 8 0 35 0 0
Brachycladium papaveris Р-1.39/30 16 30 0 0
Phoma chenopodiicola N 6 0 0 3.3 0
Phoma exigua N 23 0 38 1.5 0
Phoma exigua С-240/ N 35 0 0 2.5 5.0
Phoma sp. К-44 10 44 0 0
Septoria sonchi S-9.206.3 26 10 0 0
Septoria sp. N 27 42 0 0 0
Verticillium dahliae С-310/N 33 46 50 0 5.8
Контроль 0 5 0 0
освещении и температуре 24°С проводили учет уровня смертности тли. О биологической эффективности экстрактов судили по среднему проценту гибели вредителя по сравнению с контролем.
и обсуждение
не превышала 25%. Причём, при культивировании грибов на среде М-1-D она была в среднем выше, чем на среде ГА. Пик активности у различных изолятов грибов проявлялся в различные сроки культивирования; в частности, у B. papaveris - на 14 сутки роста (табл. 2). B. papaveris - возбудитель гельминтоспориоза мака снотворного перспективен как потенциальный микогербицид против него [O'Neill et al, 2000; Гасич и др., 2011]. Данные о возможных трофических связях B. papaveris с насекомыми в литературе отсутствуют.
Таблица 2. Афицидная активность (% к контролю) культурального фильтрата фитопатогенных грибов по отношению к виковой тле
* Не отмечена афицидная и антибактериальная активность у изолятов: С-363 Alternaría cirsinoxia, S-106 А. sonchi, N 15 А. tenuissima; S-112 Ascochyta tussilaginis; S-129 Botryosphaeria sp.; N S-12911 Colletotrichum lupini; 15-11/ N 19 Phoma sanguinolenta; К-85/N 36 Pseudosphaerulina cannabina; S-47/N 32 Stagonospora cirsii.
В повторном эксперименте с использованием 4 изолятов отобранных грибов наибольшая афицидная активность была зафиксирована у двухнедельного культураль-ного фильтрата B. papaveris N 30. При культивировании гриба на среде M-1-D афицидная активность культурального фильтрата была около 40%, на среде - более 60%. Активность культурального фильтрата остальных грибов
Гриб
Среда
Ascochyta sp. 8
Alternaría simmonsii S-142 Brachycladium papaveris N 30 Verticillium dahliae N 33
ГА М-1-D
ГА М-1-D
ГА М-1-D
ГА М-1-D
Срок 1
культивирования, недель 2 3 4
I.3 7.6 7.5 25.3 6.3
II.3 5
5.1
11.3
2.5
3.7
3.8 0
2.9
1.6
Чтобы подтвердить способность отобранных изолятов грибов образовывать инсектицидные метаболиты в качестве модельного микроорганизма использовали изолят В. papaveris N 30. Из культурального фильтрата и мицелия двухнедельной культуры гриба были получены экстракты для оценки их активности. Максимальную инсектицидную активность (более 75%) показал гексановый экстракт из культурального фильтрата. Активность других экстрактов из культурального фильтрата не превышала 18%. Высокую биологическую эффективность (около 60%) проявил этанольный экстракт из мицелия гриба. В положительном контроле - при использовании коммерческого природного инсектицида - гибель тли была на уровне 50%. В контроле смертность насекомых была не выше 17.5% (табл. 3). В дальнейшем необходимо выделение индивидуальных соединений из нативной жидкости и ми-
Таблица 3. Биологическая эффективность экстрактов (0.1%) из культурального фильтрата и мицелия Вга^усЫшт рарауепз N 30, выращенного на среде МШ
Экстракт Выход, мг/мл Смертность тли, % Биологическая эффективность, % к контролю
Гексановый 9.2 78.8 a 74.3
Хлористометиленовый 5.9 20.0 b 3.0
Эфирный 4.4 32.5 c 18.2
Этилацетатный 17.2 27.5 bc 12.1
Водный остаток - 36.3 c 22.8
Этанольный (мицелия) - 66.3 d 59.2
Neemazal TS 0,4% - 48.8 cd -
Контроль - 17.5 b -
Примечание. Значения, отмеченные разными буквами, существенно различаются при р<0.05.
целия гриба и подтверждение их афицидной активности. Известно также, что экстракты, полученные из нативной жидкости и мицелия B. papaveris, проявляют также фито-токсическую и антифунгальную активность [Титова и др., 2013], что увеличивает интерес к дальнейшему исследова-
нию метаболитов гриба.
Таким образом, на основании проведенных исследований экспериментально показана потенциальная возможность фитопатогенных аскомицетов образовывать инсектицидные метаболиты.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 12-04-00853).
Plant Protection News, 2015, 3(85), p. 56 - 58
INSECTICIDAL PROPERTIES OF PHYTOPATHOGENIC ASCOMYCETES
А.О. Berestetskiy, L.S. Apollonova, S.V. Sokornova, T.D. Chermenskaya
All-Russian Institute of Plant Protection, St Petersburg, Russia
Insecticidal activity of phytopathogenic ascomycetes (20 isolates) was evaluated using Megoura viciae as a test model. Culture filtrate of 9 isolates (45% of the total amount) showed aphicide activity. Extracts obtained from culture filtrate and mycelium of Brachycladium papaveris, a pathogen of Papaver spp., were significantly more active than an etalon commercial botanic insecticide. These data shows a potential ability of plant pathogenic fungi to produce insect regulators. Keywords: plant pathogen; ascomycete; aphicide activity; Megoura viciae.
Борисов Б.А., Серебров В.В., Новикова И.И., Бойкова И.В. Энтомопато-генные аскомицеты и дейтеромицеты. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. Под ред. В.В. Глупова. М.: Круглый год, 2001. С. 352-427.
Гасич Е.Л., Ганнибал Ф.Б., Берестецкий А.О., Казарцев И.А., Хлопунова Л.Б., Терлецкий В.М., Бекяшева Е.Н. Таксономически значимые признаки Crivellia papaveracea и Brachycladium papaveris — патогенов мака, обнаруженных в России и Украине // Микология и фитопатология, 2013. 47. С. 240-251.
Титова Ю.А., Шенин Ю.Д., Павлюшин В.А., Краснобаева И.Л. Вторичные эндометаболиты штамма Brachycladium papaveris 1.39 и его реи-золятов // Микология и фитопатология. 2013. 47. С. 266-273.
Boucias D. G., Lietze V.-U., Teal P. Chemical signals that mediate insect-fungal interactions // Biocommunication of Fungi. Ed. G. Witzany. Dordrecht, Heidelberg, New-York, London: Springer. 2012. Р. 305-336.
Dickson T.L., Mitchell C.E. Herbivore and fungal pathogen exclusion affects the seed production of four common grassland species // PLoS ONE. 2010. 5, e12022.
Feldman T. S., O'Brien H. E., Arnold A. E. Moths that vector a plant pathogen also transport endophytic fungi and mycoparasitic antagonists // Microb. Ecol. 2008. 56. Р. 742-750.
Fukushima T., Tanaka M., Gohbara M., Fujimori T. Phytotoxicity of 3 lactones from Nigrospora sacchari // Phytochemistry. 1998. 4. Р. 625-630.
Hatcher P.E. Three-way interactions between plant pathogenic fungi, herbivorous insects and their host plants // Biological Reviews. 1995. 70. Р. 639-694.
список (References)
Hill R.L., Fowler S.V., Wittenberg R., Barton J., Casonato S., Gourlay A.H., Winks C. Phytomyza vitalbae, Phoma clematidina, and insect-plant pathogen interactions in the biological control of weeds. In: Proceedings of the XI International Symposium on Biological Control of Weeds (eds.; Cullen, J.M., Briese, D.T. Kriticos, D.J., Lonsdale, W.M., Morin, L. and Scott, J.K.), Canberra, Australia: CSIRO Entomology. 2003. Р. 48-56.
Kluth S., Kruess A., Tscharntke T. Insects as vectors of plant pathogens: mutualistic and antagonistic interactions // Oecologia, 2002, 133, Р. 193-199.
Manker D. C., Rosendahl C. N., Heide M., Bachmann T. L., Nielsen R. I. Fungicidal and insecticidal compounds and compositions derived from fungal strains of Pyrenophora teres. United States Patent №№ 5491122, 1996.
Mouttet R., Bearez P., Thomas C., Desneux N. Phytophagous arthropods and a pathogen sharing a host plant: evidence for indirect plant-mediated interactions. PLoS ONE, 2011, 6, el8840.
O'Neill, N. R., Jennings, J. C., Bailey, B. A, Farr, D. F. Dendryphion penicillatum and Pleospora papaveracea, destructive seedborne pathogens and potential mycoherbicides for Papaver somniferum. // Phytopathology, 2000. 90. Р. 691-698.
Vey A., Hoagland R., Butt T.M. Toxic metabolites of fungal biocontrol agents // Fungi as biocontrol agents. Wallingford: CAB International. 2001. Р. 311-345.
Wang Q., Xu L. Beauvericin, a bioactive compound produced by fungi: a short review // Molecules, 2012. 17. Р. 2367-2377.
Translation of Russian References
Borisov B.A., Serebrov V.V., Novikova I.I., Boikova I.V. Entomopathogens of ascomycetes and deuteroycetes. In: Pathogens of insects: structural and functional aspects. Pod red. V.V. Glupova. Moscow: Kruglyi god, 2001. P. 352-427. (In Russian). Gasich E.L., Gannibal F.B., Berestetskii A.O., Kazartsev I.A., Khlopunova L.B., Terletskii V.M., Bekyasheva E.N. Taxonomically significant
characters of Crivellia papaveracea and Brachycladium papaveris - poppy pathogens found in Russia and Ukraine. Mikologiya i fitopatologiya, 2013. 47. P. 240-251. (In Russian).
Titova Yu.A., Shenin Yu.D., Pavlyushin V.A., Krasnobaeva I.L. Secondary endometabolites of of Brachycladium papaveris 1.39 strain and its reisolates. Mikologiya i fitopatologiya. 2013. 47. P. 266-273. (In Russian).
сведения об авторах
Всероссийский НИИ защиты растений, шоссе Подбельского, 3, 196608 Санкт-Петербург - Пушкин, Российская Федерация *Берестецкий Александр Олегович. Зав. лабораторией, кандидат биологических наук, e-mail: aberestetski@yahoo.com Сокорнова Софья Валерьевна. Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, e-mail: mymryk@gmail.com
Черменская Таисия Дмитриевна. Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, e-mail: tchermenskaya@yandex.ru
| Аполлонова Лариса Станиславовна
Information about the authors
All-Russian Institute of Plant Protection, Podbelskogo shosse, 3, 196608, St Petersburg - Pushkin, Russian Federation
*Berestetskiy Alexander Olegovich. Head of Laboratory, PhD in Biology,
e-mail: aberestetski@yahoo.com Sokornova Sof'ya Valerievna. Senior Researcher, PhD in Biology,
e-mail: mymryk@gmail.com Chermenskaya Taisiya Dmitrievna. Senior Researcher, PhD in Biology,
e-mail: tchermenskaya@yandex.ru Apollonova Larisa Stanislavovna
* Ответственный за переписку
* Responsible for correspondence
