CC BY
33
ПОИСК МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ АФИЦИДОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ТЛЕЙ - ПЕРЕНОСЧИКОВ ВИРУСА ОГУРЕЧНОЙ МОЗАИКИ (ВОМ)
© Григорян Л.Н.*
Филиал ФГБУ «Россельхозцентр» по Астраханской области, г. Астрахань
Вирус огуречной мозаики (ВОМ) является одним из наиболее распространенных и вредоносных фитовирусов. Список растений-хозяев ВОМ включал 775 видов, относящихся к 365 родам и 85 семействам [2, с. 52; 3, с. 37; 8, с. 119; 10, с. 212; 14, с. 715; 15, с. 687; 16, с. 141].
Наиболее активные переносчики вирусов растений - тли. Они служат важным звеном, определяющим в значительной степени закономерное развитие передаваемых ими заболеваний, и звеном, на котором основывают защитные мероприятия.
Для расширения ассортимента средств борьбы с тлями в последнее время возрос интерес к микробиологическим препаратам с инсектицидными свойствами. Богатейшим источником разнообразных по химическому строению и спектру действия биологически активных веществ являются почвенные бактерии - актиномицеты, в особенности, стрептомицеты - продуценты вторичных метаболитов с инсектицидными, акарицидными, нематицидными и другими специфическими свойствами [1, с. 170; 4, с. 323; 5, с. 27; 6, с. 26; 7, с. 145; 9, с. 1445; 11, с. 5452; 12, с. 250; 17, с. 873].
Биологически активные вещества, продуцируемые стрептомицета-ми, и их метаболиты интенсивно исследуются учеными во всем мире [13, с. 13].
Цель настоящих исследований - провести поиск микробиологических афицидов для контроля тлей-переносчиков вируса.
Оценка афицидной активности перспективных штаммов трех видов стрептомицетов проводилась на двух видах тлей, являющихся переносчиками вирусной инфекции - персиковой и виковой. При этом оценивалась быстрота наступления токсического эффекта, что является очень важным показателем для переносчиков.
Проведенные исследования, показали, что максимальную смертность виковой тли (M. viciae) наблюдали через 6 часов после обработки тест-насекомых культуральной жидкостью штамма 952 (32,3 %), минимальную -после обработки культуральной жидкостью штамма S-100 (10,5 %). При испытании исследуемых стрептомицетов на персиковой тле (M. persicae) показатель смертности через 6 часов был практически одинаков (29,5-29,8 %). При определении показателя НСР было установлено, что с увеличением
* Ведущий энтофитопатолог.
времени воздействия культуральнои жидкости стрептомицетов на виковую и персиковую тлей разница становится более значительной (3,32 %-8,63 %). При этом в контрольных вариантах смертности насекомых не наблюдали.
На основании данных эксперимента было предположено, что штаммы в результате спонтанной изменчивости в период хранения, могли потерять свои афицидные свойства, поэтому для повышения их биологической активности необходимо провести поддерживающий отбор.
Результаты оценки активности спиртовых экстрактов исследуемых штаммов стрептомицетов в отношении персиковой и виковой тлей приведены на рис. 1.
Рис. 1. Биологическая эффективность 0,5 % спиртовых экстрактов мицелия стрептомицетов в отношении М. угаав и М. рвпчсав
Проведенные исследования, результаты которых представлены на рис. 1, показали, что наибольшую афицидную активность в отношении виковой тли проявил штамм S-100: смертность тли после обработки 0,5 % раствором этанольного экстракта составила 58,3 %. Штаммы П-56 и 952 были менее активны: смертность виковой тли составила соответственно 36,7 % и 45 %. Персиковая тля оказалась менее восприимчива к исследуемым штаммам и ее смертность после обработки не превышала 11,7 %.
В ранее проведенных исследованиях по естественной изменчивости штаммов X \oidensis П-56, X НвгЬапсоЬг 8-100 [1, с. 170] было установлено, что в процессе хранения, они расщепляются на ряд морфологических вариантов, вследствие чего может происходить накопление низкоактивных вариантов и активность штамма понижается. Эта особенность хранения штаммов свидетельствует о необходимости проведения стабилизирующего отбора с целью повышения афицидной активности исследуемых штаммов стрептомицетов.
В связи с этим сотрудниками лаборатории микробиологической защиты растений ВИЗР были проведены исследования естественной изменчивости
штамма X Шйетгя П-56. Данный штамм был расклонирован на 10 вариантов и каждый клон был испытан на афицидную активность. Результаты, полученные сотрудниками ВИЗР, показали, что наибольшую активность проявил клон № 5. В дальнейшем этот клон был вновь отселектирован на 10 клонов и нами была проведена оценка их биологической активности в отношении М. рвпчсав и М. угсгав.
Результаты определения биологической активности культуральной жидкости моноклоновых изолятов клона № 5 X \oidensis П-56 в отношении М. рвшсае представлены на рис. 2.
40
123456789 10 № клона
Рис. 2. Биологическая активность культуральной жидкости моноклоновых изолятов клона № 5 5". \oidensis П-56 в отношении М. рвшсае
Из рис. 2 видно, что смертность моноклоновых изолятов клона № 5 5. \oidensis П-56 в отношении М. рвшсав стала проявляться уже через 2 часа. К концу опыта наибольшая смертность зафиксирована у клона 9 (35,0 %), минимальная у клонов 4 и 5 (11,7 %). Процент смертности остальных клонов не превышал 13,3 %.
Погибшие особи значительно отличались от живых представителей даже визуально. Различия видны в окраске (от светло- и ярко - зеленой у живых до грязножелтой и коричневой у погибших), в форме тела (у погибших оно немного вздуто). Кроме того, особи, подвергшиеся действию культу-ральной жидкости исследуемого штамма, но еще не погибшие, отличались поведением от контрольных: в первом случае они активно передвигались по дну и крышке чашки, а в последнем - малоактивны (не передвигались, а лишь шевелили конечностями), в основном располагаясь на дне чашки.
Результаты определения биологической активности культуральной жидкости моноклоновых изолятов клона № 5 5. \oidensis П-56 в отношении М. угсгав представлены на рис. 3.
120
123456789 10
№ клона
Рис. 3. Биологическая активность культуральной жидкости моноклоновых изолятов клона № 5 5". 1о1йгт18 П-56 в отношении М. ушаг
По результатам, представленным на рис. 3 видно, что смертность моноклоновых изолятов клона № 5 5. 1о1йгт18 П-56 в отношении М. у1с1аг стала заметна уже через 2 часа (НСР05 = 8,9), но у клонов 1, 4, 5, 9 она отсутствовала. К концу эксперимента наибольшая смертность зафиксирована у клона 2 (98,3 %), минимальная у клона 6 (63,9 %). Процент смертности остальных клонов колебался в пределах 75,0-96,7 %.
Характер проявления токсического действия моноклоновых изолятов на виковую тлю был сходен с его проявлением на персиковой.
Рис. 4. Биологическая эффективность 0,3 % спиртового экстракта мицелия клона № 5 5. 1о1йгт18 П-56 в отношении М. ушаг и М. ргшсаг
После оценки афицидной активности культуральной жидкости этих 10 клонов, они были объединены и проэкстрагированы спиртом. Из маточного экстракта после разбавления водой был получен 0,3 % водно-спиртовой экстракт, который был снова испытан на двух видах тлей.
Результаты оценки активности спиртовых экстрактов исследуемого штамма в отношении персиковой и виковой тлей приведены на рис. 4.
Проведенные исследования, результаты которых представлены на рис. 4, показали, что смертность после обработки 0,3 % раствором этанольного экстракта клона № 5 штамма 5. 1о1йгт18 П-56 в отношении М. ушаг и М. ргшсаг заметна уже через 2 часа. Однако, виковая тля оказалась более восприимчива к действию препарата (31,7 %), а смертность М. ргпчсаг была менее значительна (23,3 %). Уже на 4 час эксперимента смертность М. ргт1-саг составила более половины насекомых (53,3 %), а смертность виковой тли увеличилась до 76,6 %. К 20 часу в составе виковой тли была обнаружена лишь одна живая особь (98,3 % погибших особей), а у персиковой оставались живыми еще 22 (63,3 %). К концу эксперимента (24 часа) смертность виковой тли составила 100 %, аМ. ргпчсаг - 63,3 %.
Таким образом, проведенные исследования по оценке афицидной активности культуральной жидкости моноклоновых изолятов и спиртового экстракта отселектированного клона № 5 штамма 5. 1о1йгт18 П-56 отношении М. ушаг и М. ргшсаг, показали повышение смертности насекомых по сравнению с предыдущими опытами по проверке биологической активности неотселектированных штаммов 5. ИггЬапсо1ог 8-100, 5. сапЛёш 952, 5. 1о1йгп818 П-56.
Однако афицидный эффект моноклоновых изолятов был достаточно специфичен: клоны, которые проявляли высокую афицидную активность по отношению к М. утаг оказывались менее активными для М. ргпчсаг, что говорит об избирательности действия. Таким образом, наши исследования показали, что М. ргшсаг обладает большей устойчивостью к действию данных образцов биопрепаратов, чем М. угсгаг.
По этой причине достаточно сложно выбрать более активные клоны, потому что наибольшая смертность в отношении М. утаг зафиксирована у клонов 2 (98,3 %) и 3 (91,7 %), а максимальная смертность в отношении М. ргЫ-саг у клона 9 (36,7 %). В связи с этим, для создания биологических препаратов эффективных против комплекса тлей - переносчиков вирусов необходим постоянный отбор активных клонов в отношении обоих видов вредителей.
Как показали наши исследования, спиртовые экстракты неотселектиро-ванных штаммов 5. НггЬапсо1ог 8-100, 5. сапёгёш' 952 и 5. 1о1йгт18 П-56 проявляют более сильные афицидные свойства, по сравнению с моноклоно-выми изолятами. Афицидный эффект штамма 5. 1о1йгт18 П-56, подвергнутого поддерживаемому отбору, достаточно высок как в культуральной жидкости моноклоновых изолятов, так и в спиртовом экстракте. Таким образом, проведение стабилизирующего отбора повышает афицидную активность
штаммов стрептомицетов и, следовательно, является необходимым условием при создании эффективных микробиологических афицидов для контроля тлей-переносчиков вируса.
Выводы:
1. Оценка биологической активности культуральной жидкости штаммов стрептомицетов 5. \oidensis П-56, 5. ИвгЬапсо1ог 8-100, 5. candidus 952 в отношении М. рвшсав и М. уШав не выявила высокой смертности обоих видов тлей, что свидетельствует о возможной потере активности в результате хранения и, следовательно, необходимости стабилизирующего отбора.
2. Исследования афицидной активности культуральной жидкости моно-клоновых изолятов и спиртового экстракта отселектированного клона № 5 штамма 5. \oidensis П-56 в отношении М. угаав показали повышение смертности насекомых с 52,5 % до 75,0 % в сравнении с неотселектированными штаммами 5. НвгЬапсо1ог 8-100, 5. candidus 952, 5. \oidensis П-56. Однако, смертностьМ. рвпчсав снизилась с 52,5 % до 13,3 %.
3. Афицидный эффект моноклоновых изолятов был достаточно специфичен - клоны, которые проявляли сильную афицидную активность на М. уШав оказывались менее активными для М. рвшсав, что свидетельствует о большей устойчивости этого вида к действию данных лабораторных образцов биопрепаратов.
4. Афицидные свойства спиртовых экстрактов неотселектированных штаммов были более выраженными, по сравнению с культуральной жидкостью моноклоновых изолятов. После стабилизирующего отбора афицидный эффект штамма 5. \oidensis П-56 был достаточно высок как в культуральной жидкости моноклоновых изолятов, так и в спиртовом экстракте, однако начальный токсический эффект был выше (4 часа) у спиртового экстракта. В результате скрининга смертность М. рвшсав повысилась с 36,7 % (0,5 % спиртовой экстракт) до 63,3 % (0,3 % спиртовой экстракт), а смерность М. утав - с 11,7 % (0,5 % спиртовой экстракт) до 100 % (0,3 % спиртовой экстракт), что свидетельствует о перспективности данного штамма в качестве продуцента биопрепаратов с афицидной активностью для контроля тлей-переносчиков вирусов.
Список литературы:
1. Бойкова И.В. Биологические особенности стрептомицетов - основы новых инсектицидных биопрепаратов: дисс. ... канд. биол. наук / И.В. Бойкова. - СПб., 1998. - 170 с.
2. Коробкова Е.А. Обоснование геотехнологических параметров и продолжительности консервации неглубоких угольных разрезов / Е.А. Коробкова, В.Б. Артемьев. - Пермь, 1987. - С. 52-57.
3. Лобанок А.Г. Микробный синтез на основе целлюлозы. Белок и другие ценные продукты / А.Г. Лобанюк, В.Г. Бабицкая, Ж.Н. Богдановская. -Минск: Наука и техника, 1988. - С. 37-42.
4. Сотченкова Д.В. Антимикробные белки и пептиды, участвующие в защите растений от грибных и бактериальных патогенов / Д.В. Сотчеткова, И.В. Голденкова // Успехи современной биологии. - 2003. - Т. 123, № 4. -
C. 323-335.
5. Berdy J. Are actinomycetes exhausted as a source of secondary metabolites / J. Berdy // Proc. 9th. - Intern. Symp. Biol. of Actinomycetes. - M., 1994. -P. 27-36.
6. Berdy J. Bioactive microbial metabolits / J. Berdy // Antibiot. - 2005. -Vol. 58. - № 1. - P. 1-26.
7. Challis G.L. Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species / G.L. Challis,
D.A. Hopwood // PNAS. - 2003. - V 100. - P. 145-155.
8. Chater K.F. Morphological and physiological differentiation in Streptomyces / K.F. Chater // Gene. - 1983. - V 26. - P. 119-158.
9. Corbaz R. Metabolic product of Actinomycetes / R. Corbaz, L. Ettlinger,
E. Gaumann // III. Nonactin. Helv. Chim. Acta. - 1955. - V 38, № 3. - P. 14451448.
10. Fabre B. A simple screening method for insecticidal substances from ac-tinomycetes / B. Fabre, E. Armau, J. Etienne // J. Antibiot. - 1988. - V 31, № 2. -P. 212-219.
11. Galperin M.Y. Conserved hypothetical proteins: prioritization of targets for experimental study / M.YGalperin, E.V Koonin // Nucleic Acids Res. - 2004. -V. 32, № 20. - P. 5452-5463.
12. Grunewald J. Chemoenzymatic and template-directed synthesis of bioactive macrocyclic peptides / J. Grunewald, M.A. Marahiel // Microbiol. - 2006. -№ 87. - Р. 250-252.
13. McClintock I.A. True nature of spinach blight and the relation of the insects to its transmission / I.A. McClintock, L.B. Smith // Agric, Res. - 1918. -№ 14. - Р. 13-25.
14. Miller K.L. Bacterial, viral, and fungal insecticides / K.L. Miller, A.J. Ling, A. Lee, Jr. Bulla // Science. - 1983. - V. 219, № 4. - P. 715-721.
15. Schwecke T. Enzymatic characterization of the multifunctional enzyme -[L - aminoadipyl]-L-cysteinyl-D-valine synthetase from Streptomyces clavulige-rus / T. Schwecke, Y. Aharonowitz, H. Palissa // Europ. J. Biochem. - 1992. -V. 205, № 4. - P. 687-694.
16. Waksman S.A. The Actinomycetes. Nature, occurrence and activities / S.A. Waksman // Baltimore: Williams & Wilkins. - 1959. - Vol. 1. - P. 141.
17. Winans S.C. Mob psychology [Tekst] / S.C.Winans, B.L. Bassle // Bacte-riol. - 2002. - V 184, № 4. - P. 873-883.
