CC BY
106
УДК 632.913.1
Инновации —
основа успешного развития научной и производственной базы карантина растений
У.Ш. МАГОМЕДОВ, директор ФГУ «ВНИИКР» Н.А. ШЕРОКОЛАВА, заместитель директора
Развитие международной торговли, рост поставок импортных растительных грузов из разных стран мира создают реальный риск интродукции новых вредных организмов растений, в том числе фитопатоге-нов - возбудителей болезней, представляющих серьезную опасность для производства растительной продукции в нашей стране и ее продовольственной безопасности в целом. Кроме того, инвазии и акклиматизация на территории России чужеродных организмов оказывают влияние на состояние окружающей среды и природные экосистемы.
Наиболее опасные вредные организмы растений регулируются на международном уровне и имеют ка-
рантинный статус. Россельхознад-зор, как Национальная организация по карантину и защите растений Российской Федерации, играет ключевую роль в предотвращении интродукции карантинных вредных организмов в нашу страну.
Федеральное государственное учреждение «Всероссийский центр карантина растений» (ВНИИКР) с сетью филиалов в регионах, являясь главным научно-методическим референтным центром Россельхоз-надзора в этой сфере, ведет разнообразную многостороннюю работу по формированию научной базы для осуществления Федеральной службой по ветеринарному и фитосани-тарному надзору полномочий в области карантина растений.
В последние годы сформирована методологическая основа оценки фитосанитарных рисков, связанных
с перемещением подкарантинных грузов, создана система формирования перечня вредных организмов, имеющих карантинное значение для Российской Федерации.
Очень важную роль при контроле импортируемых и экспортируемых растительных грузов и обследовании территории Российской Федерации на выявление новых очагов и в проведении мониторинга ограниченно распространенных карантинных организмов играет лабораторная экспертиза.
Появление и активное внедрение в практику работы новых методов лабораторного анализа в последние десятилетия позволило вывести диагностику на более высокий качественный уровень во всем мире. Сегодня во многих не только научно-исследовательских, но и практических лабораториях для определения вирусов, бактерий, грибов, нематод, насекомых, сорных растений применяется множество разных методов и их модификаций. Десятки лет научно-исследовательского опыта ВНИИКР по целому ряду патогенов растений привели к созданию разнообразных методов их выявления в подкарантинных материалах и видовой идентификации.
Традиционно в карантинных лабораториях при работе с энтомологическими объектами, нематодами, грибами, сорными растениями применялись методы, основанные на изучении морфологических и анатомических признаков с применением техники микроскопирования. С 2005 г. ВНИИКР активно занимается внедрением в практику карантинной экспертизы современных методов диагностики. В настоящее время в наших лабораториях широко используются различные серологические и молекулярные методы, которые являются основой всех международных диагностических протоколов.
Одним из основных принципов организации системы диагностики во ВНИИКР является комплексный подход, подразумевающий отработку новых методов и наличие дубли-
36
ВНИИКР: НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ, НОВОСТИ
рующих с целью подтверждения результатов экспертизы, проверку вновь закупаемых тест-систем, оптимизацию существующих методов и разработку новых, использование внутреннихконтролей при проведении анализов, обучение и контрольные проверки персонала и др. Во многом этому способствовала активная работа наших специалистов в Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР), членом которой Российская Федерация является с 1957 г.
ЕОКЗР - межправительственная организация, ответственная за сотрудничество в сфере карантина и защиты растений в Европейском и Средиземноморском регионах. Одной из ее фундаментальных задач является содействие гармонизации во всех сферах официального карантина и защиты растений.
В 1994 г на Европейской конференции по диагностике в области карантина растений впервые была сформулирована идея о необходимости создания гармонизированных процедур идентификации карантинных организмов. В последние годы диагностика является приоритетным направлением работы ЕОКЗР. В рамках этой деятельности в 1998 г. ЕОКЗР приступила к выполнению рабочей программы по диагностике, основным направлением которой стало создание международных диагностических протоколов для регулируемых организмов (серия РМ 7), которые рекомендовано использовать в качестве стандартов. Протоколы описывают процедуры и методы официальной диагностики регулируемых вредных организмов.
Эти стандарты создаются с привлечением большого числа национальных экспертов стран-членов организации. При их разработке учитываются все инновации в сфере диагностики, а утверждение проводится по ступенчатой схеме после скрупулезного изучения экспертами и обсуждения в странах-членах организации.
Понимая важность этой проблемы, Россельхознадзор уделяет большое внимание гармонизации методов и процедур диагностики с целью повышения их качества и признания результатов другими странами.
Специалисты ВНИИКР участвуют в работе групп экспертов ЕОКЗР по диагностике, техническим требованиям к лабораториям, по бактериальным болезням, вредителям леса, инвазивным видам, фитосанитар-ным процедурам, в группе экспертов по делам комиссии по фитоса-нитарным мерам. Невозможно переоценить значение этой работы для становления, развития и совершенствования отечественной карантинной диагностики. Участие российских экспертов дает возможность вносить коррективы при разработке диагностических протоколов по карантинным для России видам и общим стандартам по фито-санитарным процедурам, учитывая интересы нашей страны, а также участвовать в профессиональных и круговых тестированиях, подтверждать идентификацию карантинных вредных организмов, обмениваться культурами и другими референтными материалами, оперативно получать консультации ведущих специалистов Европы.
В лабораториях ВНИИКР наряду с собственными методическими разработками по выявлению и идентификации карантинных вредных организмов широко применяются и диагностические протоколы ЕОКЗР. Все изменения требований в области карантинной фитосанитарной диагностики анализируются специалистами ВНИИКР и внедряются в практику работы службы в нашей стране.
В настоящее время специалистами ВНИИКР используется около 40 методов выявления и идентификации вредных организмов. Наряду с классическими методами с применением влажных камер, питательных и селективных сред, биохимических тестов, флотации, центрифугирования, тестов на растениях-индикато-
рах широко внедрены серологические и молекулярные методы.
Все лаборатории оснащены современными оптическими приборами, что позволяет на высоком уровне проводить изучение морфологических особенностей, измерение различных параметров и фотографирование выявленных насекомых, нематод, грибов, бактерий и сорных растений, а также фотодокументи-ровать результаты экспертизы.
Благодаря развитию современных экспресс-методов диагностики в последние годы в нашем центре активно стали развиваться лаборатории вирусологии и бактериологии. Лаборатория вирусологии располагает тест-наборами для иммуно-ферментного анализа (ИФА) к 20 фитопатогенным вирусам. Помимо экспертизы подкарантинной продукции на наличие карантинных вирусов систематически проводится мониторинг импортных семян и посадочного материала плодовых, ягодных и декоративных культур на выявление опасных вирусов. По результатам мониторинга предложено ввести в перечень карантинных для Российской Федерации вредных организмов четыре новых вируса.
Лабораторией вирусологии впервые в РФ изучены штаммы возбудителя карантинного заболевания -шарки сливы с использованием мо-ноклональных антител и штамм-специфичных праймеров. Установлено наличие штаммов D, С и W. Агрессивный штамм М обнаружен при обследованиях на сливах и персиках импортного происхождения в Краснодарском и Ставропольском краях. Впервые в РФ выявлен и идентифицирован с использованием комплекса методов вирус некротической пятнистости бальзамина, который является опасным патогеном овощных и цветочно-декоративных культур.
Совместно с сотрудниками ВНИИ сахарной свеклы и сахара выявлен и идентифицирован методами ИФА и ПЦР вирус некротического пожелтения жилок - возбудитель ризома-нии сахарной свеклы, ранее считав-
ВНИИКР: НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ, НОВОСТИ
37
шийся отсутствующим в Российской Федерации.
В качестве скринингового теста метод иммуноферментного анализа используется также для выявления карантинных видов бактерий, фито-плазм и грибов.
В лаборатории бактериологии применяется широкий спектр методов, основу которых составляют современные экспресс-анализы: им-мунофлуоресцентный, иммунофер-ментный, модификации анализа на основе ПЦР, а также классические микробиологические методы - посевы на питательные среды, биохимические тесты, тесты на растениях-индикаторах. Благодаря освоению новых методов диагностики на территории Российской Федерации ежегодно выявляются новые очаги карантинного заболевания - бактериального ожога плодовых культур, ранее отсутствовавшего в нашей стране. При досмотре продовольственного картофеля, поступающего из Китая, в течение последних двух лет лаборатория Иркутского филиала ВНИИКР выявляет опасное заболевание картофеля - бурую бактериальную гниль.
Стремительно развивается диагностика на основе молекулярных методов. Накоплен богатый опыт в теории и практике ПЦР. В мае 2010 г. в составе отдела диагностики ВНИИКР была создана лаборато-
рия, основными функциями которой являются разработка и оптимизация молекулярных методов, подтверждение идентификации, выполненной другими методами, ва-лидация, проверка качества тест-систем.
Большой интерес представляют модификации метода ПЦР, позволяющие учитывать результаты реакции, не открывая пробирки, что исключает контаминацию на стадии детекции. Одним из таких вариантов является метод ЛавИ-РСЯ - специфическая флуоресцентная гибридизация в процессе амплификации, разработанный российской фирмой «ДНК-Технология». Этот метод успешно применяется для диагностики десяти карантинных фитопато-генных организмов не только в центре, но и в 7 его филиалах в разных регионах России.
В 2009 г. на международной конференции по диагностике в Великобритании мы представили презентацию по внедрению в карантинную экспертизу метода ЛавИ-РСЯ, разработанного в России и успешно применяемого в карантинных лабораториях учреждений, подведомственных Россельхознадзору, что вызвало большой интерес европейских коллег.
Для выявления возбудителей бактериальной бурой и кольцевой гнилей картофеля, бактериального вил-
та кукурузы, вируса шарки сливы используется геа!41те-РСР. Диагностика с применением этой технологии также сокращает риск контаминации в процессе экспертизы.
На основе комбинирования поли-клональных антисывороток и технологии ЛавИ-РСЯ в лаборатории вирусологии разработан метод имму-носпецифической ПЦР для выявления возбудителя шарки сливы, превосходящий по чувствительности метод ИФА и стандартный АавИ-РСЯ.
С использованием специфических праймеров, сконструированных в компаниях «Агродиагностика» и «Синтол», во ВНИИКР впервые разработан ПЦР-тест для выявления андийского латентного вируса картофеля и андийского вируса крапча-тости картофеля. Эти вирусы являются карантинными организмами, отсутствующими на территории РФ.
В настоящее время молекулярные методы диагностики разрабатываются также для идентификации возбудителей золотистого пожелтения винограда, бактериального вилта кукурузы, диплодиозов кукурузы, индийской головни пшеницы, фито-фтороза земляники и малины, коричневого ожога хвои сосны, галловых нематод, карантинных и других опасных вирусов картофеля, американского клеверного минера, череды волосистой.
38
ВНИИКР: НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ, НОВОСТИ
С 2009 г. начали использовать метод рестрикционного анализа продуктов амплификации (RFLP-PCR), который позволяет выявить различия на определенном участке последовательности ДНК близкородственных видов после постановки ПЦР с универсальными праймера-ми. Этот метод используется при диагностике трипсов, мух лириомиз и разрабатывается для определения галловых нематод, штаммовой принадлежности вируса шарки сливы и других организмов.
Для окончательной идентификации выявленных карантинных вредных организмов используется метод прямого секвенирования определенных участков их генома, который мы проводим на договорной основе с другими учреждениями. Проведение прямого секвенирования необходимо при первичном обнаружении отсутствующих видов вредных организмов, в случае уточнения идентификации, а также при разработке методов диагностики для новых видов.
Идет поиск и других новых лабораторных методов и методик. Известно, что пробоподготовка является одним из наиболее ответственных этапов диагностики на основе молекулярно-генетических методов. От качества выделенной ДНК или РНК зависит достоверность проведения анализов за счет отсутствия ложноотрицательных результатов в образцах с хорошо выде-
ленной и очищенной ДНК/РНК. В нашем центре разрабатываются новые и внедряются уже известные методики выделения ДНК/РНК, которые опубликованы в диагностических протоколах и других известных печатных изданиях. Кроме того, проводится сравнение качества ДНК/РНК, выделенной различными коммерческими тест-системами, и добавляются этапы, позволяющие повысить выход ДНК/РНК или улучшить их очистку. Поднять эту очень важную часть экспертизы на высокий уровень позволил новый прибор - спектрофотометр ND-2000 NanoDrop, который появился в лаборатории молекулярных методов в 2010 г.
Этот прибор является уникальным для лабораторий, занимающихся ДНК-диагностикой, так как с его помощью можно проводить измерение концентрации ДНК, измерять белковые примеси, а значит, знать степень очистки ДНК, от этого напрямую зависит качество результатов экспертизы. Точное измерение концентрации ДНК позволяет использовать оптимальное количество матрицы в ПЦР и реакции секвенирования, оптимизировать методики пробопод-готовки, проводить работу по клонированию продуктов ПЦР.
Диагностические лаборатории ВНИИКР оснащены современным оборудованием и владеют методами, рекомендованными международными протоколами.
Одним из важнейших требований для аккредитованных лабораторий является признание надежности и достоверности используемых методов. Перед внедрением в практику они должны пройти процедуру валидации. Это необходимо делать для каждого метода и патогена в связи с тем, что они имеют определенные особенности и свои собственные характеристики. Основными критериями, определяющими надежность методов, являются чувствительность, специфичность, повторяемость и воспроизводимость. В нашем учреждении этому вопросу уделяется большое внимание. Признание надежности и достоверности методов осуществляется путем сравнения новых с отработанными в лаборатории и хорошо себя зарекомендовавшими, а также проведением специальных исследований, необходимых для получения данных по этим критериям. Одна из таких работ по проведению сравнительных испытаний метода flash-PCR с общепринятыми методами при выявлении латентной инфекции возбудителя кольцевой гнили картофеля была выполнена совместно специалистами ВНИИКР, РГАУ-Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева и ВНИИ картофельного хозяйства.
Большое внимание уделяется стандартизации методик и созданию гармонизированных диагностических процедур, которыми могли бы пользоваться все лаборатории, работающие в области карантинной фитосанитарной экспертизы. С этой целью 23 сентября 2009 г. приказом № 3310 Федерального агентства по техническому урегулированию на базе ФГУ «ВНИИКР» создан технический комитет «Карантин и защита растений», одним из направлений деятельности которого является регистрация разработанных методических материалов в качестве национальных стандартов и стандартов организации.
С целью оптимизации научных исследований и внедрения новых ме-
ВНИИКР: НАУЧНЫЕ СООБЩЕНИЯ, НОВОСТИ
39
Поздравляем с юбилеем!
тодов лабораторной экспертизы в области карантина растений ВНИИКР заключил 14 соглашений с различными научно-исследовательскими и производственными учреждениями, в том числе с двумя зарубежными. Восстановлены тесные контакты со многими научными институтами Россельхозакадемии.
В составе ВНИИКР создана научно-производственная лаборатория синтеза феромонов, которая впервые в России ориентирована на производство половых феромонов карантинных вредителей с целью проведения масштабных обследований для выявления новых очагов отсутствующих и ограниченно распространенных карантинных организмов. Своевременное уничтожение карантинных видов, не успевших акклиматизироваться на новой территории, имеет важное значение для искоренения, предотвращения их распространения и исключения необходимости дальнейших интенсивных химических обработок, ухудшающих экологию.
В 2010 г наше учреждение стало партнером программы EUPHRESCO (EUropean PHytosanitary RESearch COordination). В настоящее время это самая крупная сеть по координации научных исследований в области карантина растений в Европе. В ее состав входят 33 партнера из 22 стран и 14 наблюдателей. ВНИИКР участвует в двух проектах этой программы: по диагностике бактериальных гнилей картофеля и по идентификации возбудителя рака картофеля на уровне патотипов.
Участие в новых исследованиях, в том числе и за рубежом, применение современных технологий и оборудования открывает ФГУ «ВНИИКР» широкие перспективы для совершенствования научно-технических основ обеспечения деятельности Национальной организации по карантину и защите растений, что, в конечном счете, будет и в дальнейшем способствовать обеспечению фитосанитарной безопасности нашей страны.
13 января исполнилось 70 лет А.А. Кузину, сотруднику Всероссийского центра карантина растений.
Свой трудовой путь Анатолий Алексеевич начал 17-летним юношей на крупном кораблестроительном заводе в Николаеве. Затем была служба в погранвойсках на кораблях Черноморского флота и лишь после — учеба в Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева и в аспирантуре Молдавского НИИ орошаемого земледелия и овощеводства. После защиты диссертации он был направлен во Всесоюзный НИИ биологических методов защиты растений в Кишиневе. Здесь за короткое время раскрылись его способности не только исследователя, но и научного редактора тематического сборника ВНИИБМЗР, ученого секретаря и помощника директора института. Его статьи в периодической печати («Правда», «Известия», «Советская Молдавия», «Защита растений»), выступления на телевидении способствовали повышению авторитета нового учреждения и значимости первых успехов в области биологической борьбы с вредными организмами.
Обладая широким кругозором и базой профессиональных знаний, Анатолий Алексеевич легко осваивал новые направления деятельности куда бы его ни забрасывала судьба. Свыше пяти лет отдано работе в различных учреждениях за рубежом — заместителем директора Научной фи-топатологической лаборатории МСХ СССР в Эфиопии, уполномоченным МСХ СССР по защи-
те и карантину растений при Торгпредстве СССР в Республике Афганистан, экспертом Росгос-карантина в Греции по карантинной проверке продукции, отгружаемой в Российскую Федерацию, начальником отдела Всесоюзного научно-исследовательского центра «Агроресурсы».
В непростое для страны время, без малого 15 лет, А.А. Кузин проработал на посту заместителя директора ВНИИКР, и делал все, чтобы сохранить, а в некоторых вопросах и приумножить авторитет и значимость карантинной науки. Он и поныне трудится в стенах этого учреждения и активно выступает на страницах журнала.
Анатолий Алексеевич всегда в центре общественной жизни, человек добрый и отзывчивый, каждого поддержит, даст правильный совет. Этим он вызывает искреннее уважение коллектива, члены которого тепло поздравляют ветерана с юбилеем, желают ему здоровья, благополучия и творческих успехов!
У.Ш. МАГОМЕДОВ, директор ФГУ «ВНИИКР»
