CC BY
113
УДК 544.77022.532
А. А. Ханнанов, М. П. Кутырева, Н. А. Улахович,
А. Р. Гатаулина, Л. Я. Захарова, Г. А. Кутырев, М. А. Воронин, Е. В. Халдеева ИНКАПСУЛИРОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ДОКСОРУБИЦИНА ГИПЕРРАЗВЕТВЛЕННЫМИ ПОЛИЭФИРОПОЛИКАРБОНОВЫМИ КИСЛОТАМИ
Ключевые слова: гиперразветвленные полимеры, самоорганизация, транспорт лекарственных препаратов.
Изучено инкапсулирование противоракового лекарственного препарата доксорубицина карбоксильными производными гиперразветвленного полиэфирополиола третьей генерации (Boltom H30). Размеры частиц совместных агрегатов доксорубицин-гиперразветвленная полиэфирополиакриловая кислота варьируются от 30 до 200 нм. Размер агрегатов стабилен после загрузки и не меняется с течением времени.
Keywords: hyperbranched polymers, self-organization, drug delivery.
Studied the encapsulation of the anticancer drug doxorubicin carboxyl derivatives hyperbranched polyols third generation (Boltorn H30). The particle size of the joint units doxorubicin-hyperbranched polyesterpolyacrylic acid range from 30 to 200 nm. Size of the aggregates is stable after loading and does not change with time.
Введение
Одной из актуальных проблем современной биомедицинской химии является создание веществ, способных селективно захватывать, транспортировать в целевые органы и высвобождать лекарственные препараты, имеющие малую биодоступность. Инкапсулирование подобных лекарств является наиболее перспективным и дешевым способом улучшения их фармацевтического действия. Например, известный антираковый препарат доксоруби-цин чрезвычайно эффективен, но обладает низкой биодоступностью. Улучшить биодоступность док-сорубицина можно заключив его в биодеградируе-мые и нетоксичные макромолекулярные наноконтейнеры.
Гиперразветвленные полимеры (ГРП) являются наиболее подходящими системами для этих целей. Это обусловлено большим количеством функциональных групп на поверхности макромолекулы и уникальной сферической структурой ГРП [1-
3]. Так гиперразветвленные полиэфиры на основе 2,2-бис(гидроксиметил)пропионовой кислоты (2,2-бис-МПА), вследствие небольшого размера мономерных звеньев обладают плотной упаковкой терминальных ОН-групп, но в то же время их ядро сте-рически не загружено. Синтез ГРП существенно менее трудоемок по сравнению с синтезом аналогичных по строению дендримеров [4].
В данной работе в качестве исходной платформы был использован коммерческий гиперраз-ветвленный полиэфирополиол Boltom H третьей генерации (рис.1).
Модификация терминальных ОН-групп гиперразветвленного полиэфирополиола различными функционализирующими реагентами является одним из самых эффективных методов вариации его структуры и свойств [5]. В результате такой модификации были синтезированы гиперразветвленные системы, содержащие карбоксильные, амино-, ами-до- и силиламинные терминальные фрагменты, фосфор-, серо- и фторсодержащие группировки [6-
10]. Модифицированные гиперразветвленные полиэфиры приобретают способность к самосборке и
образованию нанокапсул, способных удерживать лекарственные вещества. Таким образом, целью настоящей работы является синтез производных гиперразветвленных полиэфирополиолов и оценка их способности связывать фармацевтические агенты, в том числе антираковые препараты.
" -±. _
О о он
,о но 9
о он
Ч-
. °хе С „ ...
^он
но—\Ji-o у
О г °\^0
ОН 4,5*0
Рис. 1 - Структура гиперразветвленного полиэфирополиола ВоНогп Н30 (1)
Экспериментальная часть
В качестве платформ для синтеза функциона-лизированных гиперразветвленных полиэфиров использован Boltom H30 (1) на основе этоксилирован-ного пентаэритрита (ядро) и диметилолпропионовой кислоты в качестве мономера (32 гидроксильных группы, Mr=3608 г/моль, гидроксильное число 525 мг/г КОН, и .=140-1450С) .
Модифицирующим агентом являлся малеи-новый ангидрид (АНа Aesar 99%). В синтезе были использованы органические растворители: диэтило-вый эфир, ацетон, 1,4-диоксан, изопропиловый спирт и бензол, очищенные согласно стандартным методикам [11].
Содержание карбоксильных групп определяли титрованием растворенной навески исследуемого
вещества 0.1 н. водно-ацетоновым (1:1) раствором щелочи по методике [12].
В качестве противоопухолевого антибиотика использовался (88-цис)-10-(3-амино-2,3,6-
тридезокси-альфа^-ликсогексо-пиранозил)окси-7,8,9,10-тетра-гидро -6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксилацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион (Доксорубицин (DOX)), код ATX L01DB01 фирмы TEVA Pharmaceutical Industries (Israel)
Методика синтеза полиэфирополиакриловых кислот ВН30(СООН)х
Навеску Boltorn H30 (1) 4 г нагревали до 1400С, охлаждали до 500С и затем растворяли в 10 мл ацетона (15 мл диоксана). К нагретому раствору Boltorn H30 добавляли 1.32 г (2), 2.64 г(3), 3,12 г(4)) малеинового ангидрида, растворенного в 5 мл аце-тона(2) или 6 мл диоксана (3,4) при мольных соотношениях 1:12, 1:24 и 1:28. Смесь перемешивали при температуре кипения растворителя 560С в течение 14 часов для мольного соотношения 1:12 и 98 0С для мольных соотношений 1:24 и 1:28 в течение 28 и 42 часов соответственно. После охлаждения смесь обрабатывали бензолом, образовавшийся желтобелый продукт отделяли и высушивали в вакууме. Получили 2.70 г (выход 67.56%) соединения (2), 2.70 г (выход 72.62%) соединения (3) и 2.35 г (выход 58.95%) соединения (4) в виде белых аморфных веществ.
Спектральные характеристики полученных соединений:
Соединение (2) BH30(CH=CHC00H)12:
ИК спектр, v, см-1 : 3394 (OH^);
2978(CH3as,); 2945, 2883 (CH2as, CH2s); 1721 (C=0); 1643(С=С), 1465 (деформационные CH3s); 1375 (деформационные CH2s); 1214 (C-O); 1119 (0-C)3,w
Спектр ЯМР 'H, 5, м.д.: 1,14, 1,21, 1,32 уш.с (OC(O)CCH3); 3.63-3.72 м (OCH2CH2); 4,11, 4,13 (C(CH20C)4); 4,28-4,30 м (CH20C(0)); 6,40 с (-CH=CH-).
Спектр ЯМР 13C, 5, м. д.: 18,1, 19,4, 20,7 (-CH3); 43,7 (C(CH20C)4); 50,5 (H3C-C(CH2b); 64.968.9 (-CH2-);132,1 (-CH=CH-); 175,1 (-C=0).
Соединение (3) BH30(CH=CHC00H)24:
ИК спектр, v, см-1: 3423 (0Ысвяз);
2974(CH3as,); 2941, 2883 (CH2as, CH2s); 1725 (C=0); 1643(С=С), 1465 (деформационные CH3s); 1371 (деформационные CH2s); 1218 (C-0); 1119 (0-C)эфиP
Спектр ЯМР :H, 5, м.д.: 1,14, 1,21, 1,32 уш. с (0C(0)CCH3); 3.63-3.72 м (0CH2CH2); 4,11, 4,14 (C(CH20C)4); 4,28-4,30 м (CH20C(0)); 6,40 с (-CH=CH-).
Спектр ЯМР 13C, 5, м.д.: 17,1, 18,4, 19,7 (-CH3); 42,7 (C(CH20C)4); 49,5 (H3C-C(CH2b); 64.067.6 (-CH2-);133,2 (-CH=CH-); 174,2 (-C=0).
Соединение (4) BH30(CH=CHC00H)28:
ИК спектр, v, см-1: 3452 (0Ысвяз);
2978(CH3as,); 2949, 2891 (CH2as, CH2s); 1721 (C=0); 1638(С=С), 1466 5(CH3s); 1375 5(CH2s); 1222 (C-0); 1119 (0-C^
Спектр ЯМР 1H, 5, м.д.: 1,13, 1,21, 1,32 уш. с (0C(0)CCH3); 3.64-3.71 м (0CH2CH2); 4,11, 4,14
(С(СН2ОС)4); 4,28-4,33 м (СН20С(0)); 6,41 с (-СН=СН-).
Спектр ЯМР 13С, 5, м.д.: 18,1, 19,4, 20,7 (-СН3); 43,8 (С(СН20С)4); 50,5 (Н3С-С(СН2Ъ); 64.9-67.8 (-СН2-);133,6 (-СН=СН-); 175,2 (-С=0).
Методика формирования совместных агрегатов в системах БИ30(СООИ)-йОХ
Для приготовления бинарных смесей ВН30(СООН)х-БОХ использовался бидистиллят. В мерную колбу на 10мл вносили постоянную навеску доксорубицина (0.46мМ), затем приливали от 25 мкл до 5 мл раствора гиперразветвленной полиэфирополиакриловой кислоты с концентрацией 1 мМ. Растворы доводили до 10 мл бидистиллированной водой и фильтровали через мембранные фильтры “МПИроге” с диаметром пор 0.45 мкм для удаления пыли.
Определение степени связывания
доксорубицина
Оценку степени связывания доксорубицина проводили в бинарных системах ВН30(С00Н)х-БОХ. Для определения степени связывания осуществляли серию экспериментов по определению оптической плотности при Х= 485 нм в бинарных смесях при постоянной концентрации доксорубицина и переменной концентрации ВН30(С00Н)х.
Концентрацию связавшегося доксорубицина находили по разности между их исходной и оставшейся в растворе концентрациями методом спек-трофотомерии по градировочному графику:
А(смеси) = -0.001 + 2253.36 х С
Концентрацию связавшегося доксорубици-на определяли по формуле:
C (связ) = С (DOX) -
A(смеси) + 0.001 2253.36
Л
+ 0.001
2253.36
Исходя из количественного значения связанного доксорубицина, рассчитывается степень связывания (%).
Аппаратура
ИК-спектры поглощения веществ регистрировали на ИК Фурье-спектрометре, Spectrum 400 (Perkin Elmer) с приставкой НВПО Алмаз KRS-5: разрешение 4 см-1, накопление 5 сканов, время регистрации 16 с, диапазон съёмки 4000-400 см-1.
Электронные спектры поглощения снимали на спектрофотометре Lambda 750 (Perkin Elmer, UK) в области длин волн 190-1000 нм, при Т=25±0.01°С с использованием термостатирующей системы, включающей термостатируемый держатель кювет, проточный термостат Julabo MB-5A и термостат Пельте PTP-1. Для измерения использовали кварцевые кюветы, толщина которых равна 1 см. Точность измерения оптической плотности (А) составляла +1%.
Спектры ЯМР в (CD3)2C0 были записаны на многофункциональном спектрометре ЯМР с Фурье-преобразованием “Avance 400” (Bruker) с рабочей частотой 400 МГц на ядрах :Н и 125.77 МГц на ядрах 13С.
Размеры частиц измеряли методом динамического рассеяния света на анализаторе наночастиц «Malvern Zetasizer Nano» фирмы «Malvern» (Великобритания). Измерения проводили при угле рассеяния 1730. Перед измерениями образцы фильтровали через мембранные фильтры “Millipore” c диаметром пор 0.45 мкм для удаления пыли. Автокорреляционные функции флуктуаций интенсивности рассеянного света анализировали с использованием метода кумулянтов, позволяющего оценить распределение агрегатов по размерам (IS0 13321:1996). Кислотное число (КЧ) определяли методом рН-метрического титрования по методике [12].
Обсуждение результатов
Модификацией платформы гиперразветвлен-ного полиэфирополиола третьей генерации Boltorn H30 малеиновым ангидридом синтезированы поли-дентатные гиперразветвленные полиэфирополикар-боновые кислоты (соединения 2, 3, 4), содержащие фрагменты акриловой кислоты в терминальном положении (схема 1).
Схема 1
(BH30)—
(1)
0\^0 (0H)32
0H
In
^ п = 12 - (2)
= 24 - (3) = 28 - (4)
Чистоту полученных продуктов контролировали методом ИК-спектроскопии с преобразованием Фурье и ЯМР спектроскопии на ядрах 13С и :Н. В спектрах ЯМР 1 Н соединений (2-4) сигналы протонов этенильного фрагмента -СН=СН- находятся в цис-положении, что соответствует наличию сингле-та при 5Н 6.42 м.д. во всех соединениях. В спектре 13С сигналы данных протонов проявляются в виде дублета при резонансных частотах 5С 130.9 м.д., 5С 130.7 м.д.
Кислотное число (КЧ) и содержание кислотных групп (п) в синтезированных соединениях определяли рН-метрическим титрованием по стандартной методике [12] (табл.1).
Таблица 1 - Характеристики полиэфирополиакриловых кислот (п = 3, p =0.95)
Соединение, № Степень функцио- нализации (f,%) Кислотное число, мг КОН/г COOH, %
(2) 5б.3 137.7±б.9 11.1±0.55
(3) 74.7 27l.4i5.l 22.2±0.74
(4) 87.5 315.7±3.1 24.8±0.1б
Гиперразветвленные полиэфирополиакриловые кислоты (2-4) обладают способностью к самоас-социациии с образованием агрегатов [13, 14], по-
этому они могут быть использованы в качестве инкапсулирующих реагентов для фармацевтических препаратов.
В качестве объекта для инкапсуляции был выбран лекарственный препарат доксорубицин (БОХ) (рис. 2).
Рис. 2 - Структурная формула противоопухолевого антибиотика доксорубицин
Данный цитостатический препарат относится к антибиотикам антрациклинового ряда, производится из даунорубицина или продуцируется микроорганизмами 8ігерЮшусе8 соетІіотЬі^, оказывает антимикотическое и антипролиферативное воздействие, эффективно воздействует более чем на 20 видов раковых опухолей, включая такие распространенные как рак молочной железы, рак щитовидной железы, рак желудка, саркома мягких тканей, рак яичников [15, 16]. Набор функциональных групп (ОН, С=О и СООН группами) в синтезированных гиперразветвленных полиэфирополикислотах обеспечивает комплиментарность их взаимодействия со структурными фрагментами доксорубицина (ОН, С=О и КН2 группы), следовательно, связывание лекарственного препарата. Метод УФ/ВИД спектро-фотометрии был выбран для оценки связывания доксорубицина в бинарных системах БН30(СООН)12-БОХ, БН30(СООН)24-БОХ и
ВН30(СООН)28-ЭОХ. Электронный спектр поглощения доксорубицина содержит два максимума (рис.3).
2-
<
1
(BH30(C00H)24)’
мМ
------2.5*10-4
------5*10-4
------7.5*10-4
------1*10-4
------2.5*10-3
------5*10-3
------7.5*10-3
------1*10-2
------1.15*10-2
2*10-2 DOX
300
450
X; nm
600
750
Рис. 3 - Электронные спектры поглощения в бинарной системе ВН30(СООН)24-ООХ в водном растворе, СБ0Х=0.46 мМ
0
Первый максимум при длине волны 290 нм и второй максимум при длине волны 450 нм имеет два плеча при 485 и 525нм. Введение в раствор гипер-разветвленных полифирополиакриловых кислот БИ30(СООИ)12, ВН30(СООН)24 и ВН30(СООН)28 доксорубицина приводит к уменьшению оптической плотности при всех длинах волн. Для оценки связывания доксорубицина в бинарных системах БИ30(СООИ)12-БОХ, БИ30(СООИ)24-БОХ и
БИ30(СООИ)28-БОХ была изучена зависимость оптической плотности водных растворов, содержащих постоянную концентрацию БОХ (0.46 мМ) при различной концентрации ВН(СООН)х (табл. 2)
Установлено, что наиболее эффективное связывание доксорубицина наблюдается для системы ВИ30(СООИ)24. Для данной системы связывание доксорубицина происходит при всех концентрациях полимера с максимальным значением при соотношении полимер : доксорубицин равном 1 : 46.
Таблица 2 - Зависимость оптической плотности (А) в бинарных системах ВН30(СООН)х-БОХ от концентрации ВН30(СООН)х при Х=485 нм
Концентра-ция БИ30(СООИ)Х, моль/л О О О ин со ^ рр Б О О О Д О ин со ^ рр Б О О О 8 О ин со ^ рр Б
2х10-7 0.726 0.542 1.652
5х10-7 0.528 0.487 1.598
7х10-7 0.549 0.490 1.464
1х10-6 0.670 0.489 1.522
2,5х10-6 0.438 0.438 1.521
5х10-6 0.732 0.538 1.579
7х10-6 0.952 0.652 1.622
1х10-6 1.025 0.565 Опалесцирует
1х10-6 0.854 0.685 1.622
2х10-6 Опалесци- рует 0.679 1.272
В свою очередь, в бинарной системе БИ30(СООИ)12-БОХ также наблюдается связывание БОХ при любых концентрациях полимера, которое при соотношении 1:46 достигает максимальной эффективности. В бинарной системе ВН30(С00Н)28-БОХ наиболее эффективное связывание лекарственного препарата приходится на соотношение 1:23. Данные спектрофотометрии использованы для расчета степени связывания доксорубицина полимерной капсулой, которая составила для БИ30(СООИ)12, БИ30(СООИ)24 и БИ30(СООИ)28 80%, 78% и 47% соответственно (рис 4.).
Для оценки размеров совместных агрегатов в системах БИ30(СООИ)х/БОХ был использован метод динамического светорассеяния. Методом динамического светорассеяния зафиксировано образование совместных агрегатов БИ30(СООИ)х- БОХ во всех системах с размерами от 30 до 200 нм (рис.
5). Для систем БИ30(СООИ)12-БОХ и БИ30(СООИ)24-БОХ в областях концентраций полимера 0.01 мМ - 0.05 мМ наблюдается наименьший разброс частиц по размеру, что однозначно го-
ворит об образовании стабильных агрегатов. С ростом концентрации размер и разброс совместных агрегатов возрастает. Однако в системе
БИ30(СООИ)28-БОХ наблюдается резкое уменьшение размеров агрегатов с 1000 нм до 50 с ростом концентрации ВН30(С00Н)х.
О(ВН30(ОООН)Х)'
Рис. 4 - Зависимость степени связывания доксорубицина от концентрации ВН30(СООН)х
Рис. 5 - Зависимость среднего гидродинамического диаметра в системах ВН30(СООН)х/БОХ от концентрации полимера
При дальнейшем росте концентрации размер агрегатов и их разброс меняются слабо. Из этого следует что, насыщение БИ30(СООИ)х доксоруби-цином происходит во всем диапазоне концентраций, а совместные агрегаты устойчивы.
Таким образом, синтезированы новые гипер-разветвленные полиэфирополиакриловые кислоты третьей генерации БИ30(СООИ)х, содержащие 12, 24 и 28 фрагментов акриловой кислоты в терминальных положениях. Доказано, что БИ30(СООИ)х способны связывать антираковый препарат доксорубицин. Эффективность связывания возрастает в ряду производных БИ30(СООИ)28 - БИ30(СООИ)24 -БИ30(СООИ)12, что можно объяснить оптимальным соотношением в молекуле полимера (2) гидроксильных и карбоксильных групп, обеспечивающим наиболее сильное взаимодействие с комплиментарными функциональными группами доксорубицина. Ги-перразветвленные полиэфирополиакриловые кисло-
ты BH30(COOH)X потенциально могут быть использованы в качестве эффективных переносчиков док-
сорубицина, обеспечивая его биодоступность.
Литература
1) Aryal, S., Prabaharan, M., Pilla, S., Gong, S., 2009. Biodegradable and biocompatible multi-arm star amphiphilic block copolymer as a carrier for hydrophobic drug delivery. Int. J. Biol. Macromol. 44, 346-352.
2) Chen, S., Zhang, X.Z., Cheng, S.X., Zhuo, R.X., Gu, Z.W., 2008. Functionalized amphiphilic hyperbranched polymers for targeted drug delivery. Biomacromolecules 9, 2578-2585.
3) Agueros, M., Areses, P., Campanero, M.A., Salman, H., Quincoces, G., Penuelas, I., Irache, J.M., 2009. Bioadhesive properties and biodistribution of cyclodextrinpo-ly(anhydride) nanoparticles. Eur. J. Pharm. Sci. 37, 231240.
4) Hibbeler R.C. Statics and mechanics of materials. New Jersey: Prentice Hall. 1995. 810 p.
5) Zou, J., Shi, W., Wang, J., Bo, J., 2005. Encapsulation and controlled release of a hydrophobic drug using a novel nanoparticle-forming hyperbranched polyester. Macromol. Biosci. 5, 662-668.
6) Nguyen, J., Steele, T.W.J., Merkel, O., Reul, R., Kissel, T., 2008a. Fast degrading polyesters as siRNA nano-carriers for pulmonary gene therapy. J. Control. Release 132, 243251.
7) Reul, R., Nguyen, J., Kissel, T., 2009. Amine-modified hyperbranched polyesters as non-toxic, biodegradable gene delivery systems. Biomaterials 29, 5815-5824.
8) Низамов И.С., Шамилов Р.Р., Кутырев Г.А., Черкасов Р.А. Фосфорилирование полиэфирополиолов Boltorn H20 и Н40 пирокатехинхлорфосфитом // Журнал органической химии. -2010. -Т.46, №2, -С.302-303.
9) Кутырева М.П., Гатаулина А.Р., Кутырев Г.А., Низамов И.С., Улахович Н.А. аминосилильные производные гиперразветвленных полиэфиров и их металлокомплек-сов //Журнал Общей химии. -2011, Т.81, вып.5, -С.873-874.
10) Cherkasov R.A., Gataulina A.R., Shamilov R.R., Nizamov
I.S., Kutyrev G.A. Phosphorylaition and thiophosphorilai-tion of oligomeric polyesterpolyols of Boltorn H20, H30 and H40. // Phosphorus, Sulfer fnd Silicon and Related elements. -2011, V.186, № 4, -P.1001-1002.
11) Потапов, В.М. Органикум. Практикум по органической химии / В.М. Потапов, С.В Понаморёв // М.: Мир, 1979. — 453 c.
12) Торопцева А.М., Белогородская К.В., Бондаренко В.М. Лабораторный практикум по химии и технологии высокомолекулярных соединений. М.: Химия. 1972. 360 с.
13) Ханнанов А.А., Захарова Л.Я., Кутырева М.П., Гатаулина А.Р., Воронин М.П, Улахович Н.А., Кутырев Г.А. Самоагрегация в водных растворах модифицированных полиэфирополиолов третьей генерации.// Вестник Казанского технологического университета, 2012, Т. 15, №.
II, С. 129-132.
14) Ханнанов А.А., Захарова Л.Я., Кутырева М.П., Гатаулина А.Р., Воронин М.П, Улахович Н.А., Кутырев Г. А., Солюбилизация гиперразветвленного полиэфирополио-ла Boltorn H20 с помощью не ионного ПАВ Brij-35, Вестник Казанского технологического университета, 2013, Т. 16, №. 1, С. 132-135.
15) Y. Xiao, R. Jaskula-Sztul, A. Javadi,W. Xu, J. Eide, A. Dammalapati,M. Kunnimalaiyaan, H. Chen, S. Gong, Codelivery of doxorubicin and siRNA using octreotide-conjugated gold nanorods for targeted neuroendocrine cancer therapy, Nanoscale 4 (2012) 7185-7193.
16) X.B. Xiong, A. Lavasanifar, Traceable multifunctional micellar nanocarriers for cancer-targeted co-delivery of MDR-1 siRNA and doxorubicin, ACS Nano 5 (2011) 52025213.
© А. А. Ханнанов - асп. каф. неорганической химии КФУ, arthann@gmail.com; М. П. Кутырева - канд. хим. наук, доц. каф. неорганической химии КФУ, mkutyreva@mail.ru; Н. А. Улахович - д-р хим. наук, проф. каф. неорганической химии КФУ, Nikolay.Ulakhovich@kpfu.ru; А. Р. Гатаулина - канд. хим. наук, ст. препод. каф. неорганической химии КФУ, alphiag@mail.ru; Л. Я. Захарова - д-р хим. наук, проф. каф. органической химии КНИТУ, зав. лаб. высокоорганизованных сред ИОФХ им.А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, lucia@iopc.ru; Г. А. Кутырев - д-р хим. наук, проф. каф. технологии переработки полимеров и композиционных материалов КНИТУ, genkutyrev@mail.ru; М. А. Воронин - канд. хим. наук, н.с. лаб. высокоорганизованных сред ИОФХ им.А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, voronin@iopc.ru; Е. В. Халдеева - канд. хим. наук, зав. лабораторией микологии Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии e_khaldeeva@mail.ru
