CC BY
0
© Коллектив авторов, 2024
Масютина А.М.1, Муругин В.В.1, Пащенков М.В.1' 2
Ингибиторы внутриклеточных сигнальных путей подавляют воспалительный ответ, вызванный синергически действующими веществами бактериальной природы
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Сочетанная активация NOD- и Toll-подобных рецепторов клеток врожденного иммунитета является мощным провоспалительным стимулом и может лежать в основе системного воспалительного ответа при бактериальном сепсисе.
Цель исследования - оценить возможности подавления продукции провоспали-тельных цитокинов макрофагами, активированными сочетанием агонистов NOD1 и TLR4, путем ингибирования сигнальных путей с участием фактора транскрипции NF-kB и митоген-активируемых протеинкиназ (МАПК).
Материал и методы. Макрофаги, полученные из моноцитов крови здоровых доноров, стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании. Активность сигнальных путей с участием фактора транскрипции NF-kB и МАПК подавляли с помощью низкомолекулярных ингибиторов киназ, добавляемых до или после начала активации клеток. На выходе оценивали экспрессию мРНК генов провоспалительных цитокинов TNF, IL6, IL12B и IL23A с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией, а также секрецию ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 с помощью иммуноферментного анализа.
Результаты. Ингибирование сигнальных путей с участием NF-kB и МАПК позволило предотвратить или прервать экспрессию и продукцию ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 макрофагами, активированными мощным провоспалительным стимулом - комбинацией агонистов NOD1 + TLR4. Наибольший эффект оказывало одновременное ингибирование обоих сигнальных путей. Показан вклад сигнальных путей с участием NF-kB и МАПК в синергическое усиление экспрессии гена IL12B.
Заключение. Полученные данные могут быть использованы при разработке новых подходов к противовоспалительной терапии при тяжелых бактериальных инфекциях.
Ключевые слова: макрофаги; NOD1; TLR4; мурамилпептиды; липополисахарид; митоген-активируемые про-теинкиназы; ядерный фактор kB; ингибиторы
Статья получена 18.10.2023. Принята в печать 21.11.2023.
Для цитирования: Масютина А.М., Муругин В.В., Пащенков М.В. Ингибиторы внутриклеточных сигнальных путей подавляют воспалительный ответ, вызванный синергически действующими веществами бактериальной природы. Иммунология. 2024; 45 (1): 21-32. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-21-32
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Постановка экспериментов и анализ результатов - Масютина А.М., Муругин В.В.; планирование экспериментов, анализ результатов и написание статьи - Пащенков М.В.
Для корреспонденции
Пащенков Михаил Владимирович -доктор медицинских наук, заведующий лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Masyutina A.M.1, Murugin V.V.1, Pashenkov M.V.1, 2
Intracellular signaling pathway inhibitors suppress inflammatory response induced by synergistically acting bacterial substances
1 National Research Center Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997 Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Combined activation of NOD-like and Toll-like receptors of innate immune cells is a potent pro-inflammatory stimulus that may underlie the systemic inflammatory response in bacterial sepsis.
Aim - to evaluate the possibility to suppress pro-inflammatory cytokine production by macrophages activated with NOD1 and TLR4 agonist combination using inhibitors of NF-kB-dependent and mitogen-activated protein kinase (MAPK)-dependent signaling pathways.
Material and methods. Macrophages generated from healthy donor monocytes were stimulated with NOD1 and TLR4 agonists separately or simultaneously. The activity of NF-kB-dependent and MAPK-dependent signaling pathways was suppressed using low-molecular-weight kinase inhibitors that were added before or after commencement of cell activation. As read-outs, we measured mRNA expression of pro-inflammatory cytokines TNF, IL6, IL12B and IL23A using RT-PCR as well as secretion of TNF, IL-6 and IL-23 using ELISA.
Results. Inhibition of NF-kB-dependent and MAPK-dependent signaling pathways allowed to prevent or interrupt expression and production of TNF, IL-6 and IL-23 by macrophages activated by a potent pro-inflammatory stimulus, a NOD1 + TLR4 agonist combination. Most effective was simultaneous inhibition of both signaling pathways. We also show contribution of NF-kB-dependent and MAPK-dependent signaling pathways to synergistic enhancement of IL12B gene expression.
Conclusions. These results obtained can be utilized when developing novel approaches to anti-inflammatory therapy of severe bacterial infections.
Keywords: macrophages; NOD1; TLR4; muramyl peptides; lipopolysaccharide; mitogen-activated protein kinases; nuclear factor-kB; inhibitors
Received 18.10.2023. Accepted 21.11.2023.
For citation: Masyutina A.M., Murugin V.V., Pashenkov M.V. Intracellular signaling pathway inhibitors suppress inflammatory response induced by synergistically acting bacterial substances. Immunologiya. 2024; 45 (1): 21-32. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-1-21-32 (in Russian)
Funding. This work was supported by the Russian Science Foundation grant No. 21-15-00211.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Conducting experiments and analysing results - Masyutina A.M., Murugin V.V.; designing experiments, analysing results and writing the article - Pashenkov M.V.
For correspondence
Mikhail V. Pashenkov -MD, PhD,
Head of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Введение
Инфекционные заболевания остаются одной из важнейших проблем медицины. Так, по оценке Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), число случаев сепсиса в мире в 2017 г. составило 49 млн, из них 11 млн завершились гибелью пациентов [1]. Среди пациентов отделений интенсивной терапии частота сепсиса достигает 25 %, летальность при сепсисе - 40 % [1, 2].
Повреждение клеток, тканей и органов при инфекционных заболеваниях обусловлено двумя основными факторами: самим возбудителем и иммунным ответом на него. Высоковирулентные микроорганизмы оказы-
вают выраженное повреждающее действие на клетки, но при этом они стремятся ингибировать адаптивный и врожденный иммунный ответ хозяина или ускользнуть от него [3-6]. Однако при инфекциях, вызванных низковирулентной флорой, ведущим повреждающим фактором становится иммунный ответ, в том числе системное воспаление, обусловленное избыточной активацией клеток врожденного иммунитета [7-9]. На экспериментальных моделях таких состояний показано, что ингибирование индукционной фазы врожденного иммунного ответа, а также нейтрализация отдельных эффекторных провоспалительных цитокинов, в част-
ности фактора некроза опухолей (ФНО), уменьшает тяжесть полиорганной недостаточности [10-12]. В клинической практике для борьбы с системным воспалительным ответом традиционно применяются глюкокор-тикостероиды, однако данные об их эффективности при сепсисе противоречивы [13], что требует поиска других, более действенных средств подавления избыточного воспалительного ответа.
Большинство микроорганизмов обладают несколькими патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП) и при инфицировании организма хозяина активируют несколько паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) клеток врожденного иммунитета. В частности, при бактериальных инфекциях происходит одновременная активация рецепторов, распознающих фрагменты пептидогликана (NOD1 и/или NOD2) и представителей семейства Toll-подобных рецепторов, распознающих липополисахариды грам-отрицательных бактерий (TLR4), липопептиды грам-положительных бактерий (TLR2 в сочетании с TLR1 или TLR6), бактериальные нуклеиновые кислоты (TLR7, TLR8, TLR9). Во многих парах NOD-TLR возникает синергическая кооперация, при которой эффект сочетания агонистов существенно превышает сумму эффектов отдельно взятых агонистов [14-17]. На примере активации макрофагов человека сочетанием агонистов NOD1 и TLR4 -рецепторов, играющих главную роль в распознавании грамотрицательных бактерий [18, 19], - мы показали, что синергические эффекты затрагивают сравнительно небольшую группу генов, в число которых входят гены основных провоспалительных цитокинов - IL12B и IL23A (кодируют субъединицы ИЛ-23), IL1B, IL6, TNF [20]. Синергическая кооперация ПРР, приводящая к усилению продукции провоспалительных цито-кинов, является одной из вероятных причин гипер-ергического врожденного иммунного ответа при тяжелых инфекционных заболеваниях, в частности при сепсисе [21, 22].
Экспрессия генов провоспалительных цитокинов в клетках врожденного иммунитета, активированных агонистами ПРР, регулируется несколькими семействами факторов транскрипции (ФТ), в том числе NF-kB (nuclear factor-кВ), AP-1 (activation protein-1), EGR (early growth response), C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein), SP (specificity protein) [23-25]. По некоторым данным, наличия сайтов связывания NF-kB и AP-1 в промоторе достаточно для синергического усиления экспрессии репортерного гена при сочетанной активации NOD- и Toll-подобных рецепторов в моноци-тарных клетках THP-1 [26].
В данной работе мы оценили влияние ингиби-рования NF-kB- и AP-1-зависимого сигнальных путей на экспрессию провоспалительных цитокинов, индуцированную сочетанием агонистов NOD1 и TLR4 в макрофагах человека. Для блокирования сигналинга с участием NF-kB использовали PF-184 - низкомолекулярный ингибитор р-субъединицы 1кВ-киназы (IKKP). Эта киназа фосфорилирует ингибиторные белки IkB,
что приводит к их деградации и является необходимым условием для транслокации ФТ семейства NF-kB в ядро.
Активаторами ФТ семейства AP-1 являются мито-ген-активируемые протеинкиназы (МАПК) p38a/ß, ERK1/2 и JNK1/2/3. Для подавления активности p38 и JNK использовали вещества VX-745 и SP600125 соответственно; активность ERK подавляли путем инги-бирования вышележащих киназ MEK1/2 с помощью вещества PD98059.
Нас интересовали два вида эффектов ингибиторов: 1) собственно подавление экспрессии IL6, IL12B, IL23A и TNF, индуцированной агонистами NOD1, TLR4 и их сочетанием; 2) подавление синергического усиления экспрессии цитокинов при сохранении или частичном ингибировании ответа на отдельные агонисты. Экспрессию мРНК цитокинов IL6, IL12B, IL23A и TNF оценивали через 4 ч после добавления агонистов - время, когда эффекты синергизма в отношении этих мРНК наиболее выражены [14, 20]. Уровни соответствующих цитокинов в супернатантах также оценивали в более поздние сроки, учитывая отставание секреции белков от экспрессии их мРНК.
Материал и методы
Реактивы. Синтетический агонист NOD1 - лау-роил-Э-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота (C12-iE-DAP, далее С12), высокоочищенный агонист TLR4 - липополисахарид (ЛПС) E. coli O111:B4 были закуплены у фирмы InvivoGen (США), реком-бинантный человеческий гранулоцитарно-макрофа-гальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) -у Miltenyi Biotec (ФРГ). В качестве полной культу-ральной среды (ПКС) использовали RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина (все Thermo Fisher Scientific, США). Ингибиторы PF-184, VX-745, PD98059, SP600125 были закуплены у фирмы Tocris (США). Рабочие концентрации ингибиторов были подобраны в предварительных экспериментах и составили: для PF-184 - 5 мкМ, для трех остальных - 10 мкМ. Коктейль ингибиторов VX-745, PD98059 и SP600125 в концентрациях 10 мкМ далее называется МАПКи.
Доноры крови. Для экспериментов получали венозную гепаринизированную кровь от здоровых доноров. Исследование было одобрено локальным Комитетом по этике ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России», протокол 10/2017. Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании.
Культивирование и стимуляция макрофагов.
Макрофаги получали путем культивирования моноцитов крови с ГМ-КСФ в течение 6 сут, как описано ранее [20], после чего пересевали в 24-луночные планшеты по 100 тыс. клеток/400 мкл ПКС. На следующие сутки меняли среду на свежую ПКС. Через 2 ч добавляли C12 (1 мкг/мл), ЛПС (10 нг/мл), их сочетание либо равный объем ПКС (отрицательный конт-
роль). Далее клетки инкубировали в течение 1 и 4 ч (для оценки уровней мРНК), либо 3 и 24 ч (для оценки уровней цитокинов в супернатантах и жизнеспособности макрофагов).
Ингибиторы применяли по трем схемам. По схеме 1 ингибиторы или ПКС (контроль) вносили за 15 мин до внесения агонистов NOD1 и/или TLR4. По схеме 2 ингибиторы или ПКС вносили через 1 ч после добавления агонистов. По схеме 3 ингибиторы вносили за 15 мин до внесения агонистов, через 3 ч после начала стимуляции супернатанты полностью удаляли, заполняли лунки свежей ПКС, добавляли те же агонисты до первоначальной концентрации и инкубировали еще 21 ч, после чего оценивали уровни цитокинов в супер-натанте и жизнеспособность клеток.
ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ПЦР-РВ). Относительную экспрессию (ОЭ) мРНК IL6, IL12B, IL23A и TNF определяли с помощью ПЦР-РВ по методике, описанной ранее [14]. ОЭ нормировали на мРНК GAPDH.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Уровни ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 в культуральных супернатантах определяли с помощью тест-систем фирмы eBioscience/ Thermo Fisher (США) в соответствии с инструкцией производителя.
Оценка жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста. По истечении требуемого времени культивирования к клеткам добавляли МТТ-реагент (Merck, США) до конечной концентрации 0,3 мг/мл. Через 4 ч удаляли супернатант, гранулы МТТ-формазана растворяли в диметилсульфоксиде. Численность жизнеспособных клеток в лунке определяли полуколичественно по разности оптической плотности (ОП) при 492 и 670 нм.
Статистическая обработка данных. Для каждого показателя П в каждом экспериментальном образце вычисляли индекс стимуляции (ИС) по формуле ИС
= П /П, где П
агонист 07 а
- значение показа-
теля после стимуляции агонистом или их сочетанием, П0 - базальное значение показателя в той же временной точке у того же донора. Эффекты агонистов или их сочетания считали биологически значимыми при ИС > 2.
Взаимное влияние агонистов NOD1 и TLR4 оценивали по индексам потенцирования (ИП):
ИП = Ответ
, / (ОтветС12 + ОгаеГлПсХ
где Ответ = ИС - 1.
агонист агонист
ИП для данного гена/точки/ингибитора рассчитывали только при наличии биологически значимого ответа на сочетание агонистов. Отрицательные ответы приравнивали к 0. Если ответ на оба отдельно взятых агонистов равнялся 0, то значением ИП считали значение ответа на С12 + ЛПС. Достоверность отличий ИП от 1 оценивали с помощью парного /-теста. Эффект сочетания агонистов на измеряемый показатель считали синергическим при ИП > 1 (р < 0,05 в парном /-тесте),
аддитивным при отсутствии достоверных отличий ИП от 1, инфрааддитивным при 0,5 < ИП < 1 и достоверном отличии ИП от 1 (p < 0,05).
Эффекты ингибиторов на индуцибельные показатели - экспрессию и продукцию цитокинов - представляли в виде остаточных значений (ОЗ) измеряемых показателей:
ОЗ = [(П б + - П0) / (П - П0)] х 100 %.
Lv ингибитор+агонист 0' v агонист U'J
Если этот показатель значимо не изменялся при стимуляции данным агонистом в отсутствие ингибиторов (ИС < 2), то значения ОЗ не рассчитывали. При сравнениях в парах «опыт-контроль» использовали парный /-тест, различия считали значимыми при p < 0,05.
Все результаты в таблицах и на графиках представлены в виде M ± с.
Результаты
Цитокиновый ответ макрофагов при активации рецепторов NOD1 и TLR4
При сочетанной стимуляции макрофагов агонистами NOD1 (C12) и TLR4 (ЛПС) в течение 4 ч наблюдалось синергическое усиление экспрессии мРНК генов TNF, IL6, IL12B, IL23A, о чем свидетельствуют значения ИП, существенно и достоверно превышающие 1 (рис. 1А). В более поздние сроки также происходило синергическое увеличение уровней ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 в супернатантах макрофагов (рис. 1Б).
Влияние предварительного ингибирования IKKß и МАПК на экспрессию и продукцию цитокинов (схема 1)
Согласно схеме 1 (см. раздел «Материал и методы»), ингибиторы киназ вносили за 15 мин до начала активации макрофагов. Ингибитор IKKß PF-184 примерно на 70-75 % подавлял экспрессию TNF, индуцированную как отдельно взятыми агонистами NOD1 и TLR4, так и их сочетанием (табл. 1). Влияние PF-184 на экспрессию IL6, IL12B и IL23A было более выраженным; так, индукция гена IL12B практически отменялась (табл. 1).
Ингибиторы MEK/ERK- и JNK-зависимого сигнальных путей (PD98059 и SP600125) не оказывали биологически значимого ингибирующего влияния на экспрессию мРНК цитокинов (остаточная экспрессия > 50 %), тогда как ингибитор p38 (VX-745) значимо подавлял только экспрессию IL6 и IL12B при стимуляции ЛПС и сочетанием C12 + ЛПС (данные не представлены). Поскольку разные по составу комплексы AP-1 и, следовательно, разные МАПК могут частично замещать друг друга [27], мы заблокировали одновременно все три МАПК-зависимых пути с помощью коктейля ингибиторов (МАПКи). Коктейль оказал сравнительно слабое влияние на экспрессию цитокинов, индуцированную C12 (например, полностью отсутствовал эффект на С12-индуцированную экспрессию
Э
s з
i?
ч и s
15105-
C12 ЛПС
TNF ИП=3,6 ± 1,3***
А ЖЯ.
+ -- +
20 ! 151050-
C12 ЛПС
IL6
ИП=8,3 ± 7,1** т
*АА #
V
ъ
4
V
- - +
20-, 15105 -0-
C12 ЛПС
IL12B
ИП=4,7 ± 1,5***
AAA JL
V
» V
- + -- - +
151050-
C12 ЛПС
IL23A
ИП=6,7 ± 4,3***
J M :
- + - + - - + +
6000 -,
ФНО
ИП3ч=1,6 ± 0,4** ИП24ч=3,3 ± 1,0***
V '
! 4000-
§ 2000©
0J
С12 ЛПС
т
А ТТ I* ▼
+-+ -++
+ - + - + +
3 ч
24 ч
8000-,
1Î 6000-
s
4000-
- И 2000-
0-
С12
ЛПС
ИЛ-6
- + -- - +
24 ч
1500 -,
! 1000
Л И
500 0
С12 ЛПС
ИЛ-23
V
аа ▼
+-+
24 ч
Рис. 1. Показатели экспрессии и секреции цитокинов макрофагами при раздельной и сочетанной стимуляции рецепторов NOD1 и TLR4
А - относительная экспрессия мРНК после стимуляции агонистом NOD1 (С12) и/или агонистом TLR4 (ЛПС) в течение 4 ч; Б - уровни цитокинов в супернатантах после стимуляции теми же агонистами в течение 3 и 24 ч. ИП - индексы потенцирования; указаны достоверности отличия от 1 (парный t-тест). Горизонтальные линии в группах - средние значения.
0
ИП24ч=4,5 ± 2,4*
ИП24ч=7,9 ± 4,9*
IL12B), однако подавление экспрессии цитокинов при индукции ЛПС или сочетанием C12 + ЛПС было гораздо более выражено (табл. 1).
При одновременном ингибировании IKKß и МАПК агонист-индуцированная экспрессия генов цитокинов подавлялась более чем на 98 % (табл. 1). Ответ на отдельно взятые агонисты NOD1 и TLR4 для генов
TNF и IL6 полностью отменялся, для IL12B и IL23A сохранялся на минимальном уровне; также сохранялся минимальный ответ всех генов на сочетание агонистов NOD1 + TLR4 (на 2-3 порядка ниже, чем в отсутствие ингибиторов).
Ингибиторы IKKß и МАПК также эффективно подавляли секрецию ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23, индуциро-
Таблица 1. Остаточные значения экспрессии мРНК цитокинов (%) при стимуляции макрофагов C12 и/или ЛПС и добавлении ингибиторов за 15 мин до начала стимуляции
Ген Ингибитор Агонист
C12 ЛПС C12 + ЛПС
TNF PF-184 29,1 ± 15,2*** 24,8 ± 15,2*** 32,3 ± 20,9***
МАПКи 61,5 ± 18,8** 23,0 ± 11,3*** 32,2 ± 14,3***
PF-184 + МАПКи -0,15 ± 1,8*** -1,3 ± 2,3*** 0,55 ± 0,44***
IL6 PF-184 4,0 ± 36,6*** 1,0 ± 2,3*** 1,2 ± 0,85***
МАПКи 48,2 ± 130,3 3 9 ± 4 1*** 4,0 ± 2,3***
PF-184 + МАПКи -7,7 ± 21,0*** 0,06 ± 0,18*** 0,06 ± 0,08***
IL12B PF-184 0,23 ± 0,26*** 0,03 ± 0,58*** 0,11 ± 0,06***
МАПКи 113,9 ± 31,4 54,9 ± 43,3* 29,4 ± 9,8***
PF-184 + МАПКи 0,61 ± 0,24*** 0,53 ± 0,91*** 0,14 ± 0,06***
IL23A PF-184 3,5 ± 3,8*** 2,3 ± 2,1*** 3,0 ± 2,2***
МАПКи 20,5 ± 6,9*** 14,2 ± 5,6*** 12,5 ± 3,8***
PF-184 + МАПКи 1,4 ± 2,0*** 1,5 ± 3,0*** 0,42 ± 0,31***
Примечание. Время стимуляции - 4 ч; число экспериментов - от 6 до 10 для каждого условия. Здесь и в табл. 2-5: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** -р < 0,001 при сравнении со значением показателя при том же виде стимуляции в отсутствие ингибиторов, принятымза 100 % (парный 1-тест). ЛПС - липополисахарид.
Таблица 2. Остаточные значения уровней цитокинов (%) в супернатантах макрофагов при стимуляции С12 и/или ЛПС и добавлении ингибиторов за 15 мин до начала стимуляции
Цитокин (время стимуляции) Ингибитор Агонист
C12 ЛПС C12 + ЛПС
ФНО (3 ч) PF-184 13,0 ± 5,7*** 9 4 ± 2 9*** 22,6 ± 11,7***
МАПКи 0,41 ± 0,82*** -0,23 ± 1,1*** 1,7 ± 0,45***
PF-184 + МАПКи 0,5 ± 1,8*** -0,69 ± 1,12*** -0,17 ± 0,25***
ФНО (24 ч) PF-184 9,3 ± 6,7*** 2,2 ± 16,7*** 20,8 ± 11,9***
МАПКи -1,4 ± 5,0*** -7,7 ± 17,6*** -0,75 ± 1,4***
PF-184 + МАПКи -3,3 ± 5,9*** -7,5 ± 14,6*** -0,43 ± 1,3***
ИЛ-6 (24 ч) PF-184 11 ± 4 4*** -1,5 ± 3,7*** 1,0 ± 2,0***
МАПКи 5,0 ± 6,5*** 1,6 ± 3,2*** 3,5 ± 2,1***
PF-184 + МАПКи 8,9 ± 12,3*** 0,77 ± 2,5*** -0,28 ± 0,36***
ИЛ-23 (24 ч) PF-184 1,9 ± 12,7*** 50,6 ± 78,3 0,05 ± 0,62***
МАПКи 27,3 ± 30,0** 30,1 ± 36,9* 15,4 ± 13,4***
PF-184 + МАПКи -2,0 ± 2,2*** 23,9 ± 36,6** 2,5 ± 3,5***
Примечание. Время стимуляции - 3 и 24 ч; число экспериментов n = 6.
ванную как отдельными агонистами, так и их сочетанием (табл. 2). Одновременное ингибирование IKKß и МАПК оказывало наибольший эффект. Интересно, что коктейль МАПКи почти полностью подавлял секрецию ФНО (см. табл. 2), несмотря на неполное ингибирование экспрессии соответствующей мРНК (см. табл. 1), что может быть связано с участием МАПК в активации не только транскрипции, но и трансляции цитокинов [28, 29]. Секрецию ИЛ-12р70 не оценивали, так как макрофаги в данных условиях не вырабатывают этот цитокин, поскольку не экспрессируют ген IL12A, кодирующий р3 5-субъединицу ИЛ-12 (данные не представлены).
Влияние ингибиторов IKKß и МАПК на экспрессию и продукцию цитокинов активированными макрофагами (схема 2)
Чтобы оценить влияние ингибиторов на уже развившийся ответ макрофагов, их добавляли к клеткам через 1 ч после внесения агонистов (схема 2). В данных условиях влияние ингибиторов на экспрессию мРНК TNF
и IL6 в целом сохранялось, влияние на экспрессию мРНК IL12B и IL23A было несколько ослаблено по сравнению со схемой 1 (ср. табл. 3 и табл. 1). Однако сочетание ингибиторов PF-184 + МАПКи по-прежнему глубоко подавляло экспрессию мРНК всех 4 цитокинов, индуцированную сочетанием агонистов NOD1 + TLR4 (остаточная экспрессия < 5 %; см. табл. 3).
При применении по схеме 2 практически отсутствовал эффект ингибитора IKKß на секрецию ФНО (табл. 4), при этом ингибирующий эффект МАПКи и сочетания PF-184 + МАПКи сохранялся (ср. табл. 4 и табл. 2). Влияние PF-184, МАПКи и PF-184 + МАПКи на секрецию ИЛ-6 и ИЛ-23 при применении ингибиторов по схемам 1 и 2 было сопоставимым (ср. табл. 4 и табл. 2)
Влияние ингибиторов IKKß и МАПК на жизнеспособность макрофагов
При культивировании по схеме 1 с PF-184 и, особенно, с сочетанием PF-184 + МАПКи в течение 24 ч наблюдалось достоверное снижение жизнеспособности макрофагов (табл. 5). В отсутствие PF-184 коктейль
Таблица 3. Остаточные значения экспрессии мРНК цитокинов (%) при стимуляции макрофагов C12 и/или ЛПС и внесении ингибиторов через 1 ч после начала стимуляции
Ген Ингибитор Агонист
C12 ЛПС C12 + ЛПС
TNF PF-184 25,5 ± 8,1*** 18,8 ± 13,4** 39,8 ± 15,3**
МАПКи 30,6 ± 10,8** 16,9 ± 19,0* 19,4 ± 9,8**
PF-184 + МАПКи -1,3 ± 5,1*** -3,3 ± 6,9*** 0,31 ± 1,5***
IL6 PF-184 9,2 ± 44,5* 2,3 ± 3,0*** 3,5 ± 3,6***
МАПКи -6,2 ± 36,0* 5,7 ± 2,9** 6,6 ± 6,1**
PF-184 + МАПКи -5,9 ± 30,0** -0,3 ± 0,5*** 0,19 ± 0,24***
IL12B PF-184 30,4 ± 9,2*** 5,6 ± 3,1*** 6,1 ± 2,1***
МАПКи 136,8 ± 66,1 66,7 ± 4,2** 73,9 ± 45,4
PF-184 + МАПКи 11,9 ± 8,1*** 17 ± 19*** 3,1 ± 0,84***
IL23A PF-184 57,5 ± 33,8 11,8 ± 8,4*** 14,5 ± 6,1***
МАПКи 16,9 ± 1,4*** 15,4 ± 3,0*** 17,0 ± 6,5***
PF-184 + МАПКи 8,4 ± 13,5*** 1,5 ± 1,2*** 4,8 ± 5,3***
Примечание. Время стимуляции - 4 ч; число экспериментов п = 4. Иммунология ■ Том 45 ■ № 1 ■ 2024
Таблица 4. Остаточные уровни цитокинов (%) в супернатантах макрофагов при стимуляции С12 и/или ЛПС и внесении ингибиторов через 1 ч после начала стимуляции
Цитокин (время стимуляции) Ингибитор Агонист
C12 ЛПС C12 + ЛПС
ФНО (3 ч) PF-184 98,9 ± 15,8 47,6 ± 32,7* 93,5 ± 2,8*
МАПКи 11,7 ± 5,9*** 5,4 ± 2,6*** 8,2 ± 2,4***
PF-184 + МАПКи 12,4 ± 8,6*** 2,7 ± 2,0*** 8,0 ± 4,8***
ФНО (24 ч) PF-184 125,3 ± 18,9 95,3 ± 39,6 92,6 ± 44,0
МАПКи 7,1 ± 14,7** -8,5 ± 19,8** 0,66 ± 1,4***
PF-184 + МАПКи 0,56 ± 9,0*** -10,9 ± 16,8*** 0,28 ± 1,9***
ИЛ-6 (24 ч) PF-184 8,2 ± 23,3* 3,6 ± 4,3*** 6,0 ± 3,9***
МАПКи 6,5 ± 10,5*** 0,82 ± 1,5*** 7 1 ± 3 7***
PF-184 + МАПКи 4,9 ± 22,9*** -1,8 ± 2,2*** -0,07 ± 0,36***
ИЛ-23 (24 ч) PF-184 51,7 ± 68,4 11,1 ± 15,3** -0,33 ± 1,8***
МАПКи 10,0 ± 47,0 3,9 ± 5,4** 21,9 ± 14,3***
PF-184 + МАПКи -14 9 ± 14 9*** 5,7 ± 10,1*** 4,5 ± 12,6***
Примечание. Время стимуляции - 3 и 24 ч; число экспериментов n = 5.
МАПКи не влиял на жизнеспособность макрофагов. Также не было значительного снижения жизнеспособности после кратковременного воздействия ингибиторов (3 ч). Жизнеспособность макрофагов по схеме 2 не оценивали, однако можно предположить схожие результаты, так как время инкубации с ингибиторами по схемам 1 и 2 различалось незначительно.
Влияние кратковременного воздействия ингибиторов IKKß и МАПК на экспрессию и продукцию цитокинов (схема 3)
Применяемые в работе ингибиторы обладают коротким периодом полувыведения in vivo: T1/2 для PF-184 составляет ~ 1 ч, для VX-745 ~ 2 ч [30, 31]. Поэтому инкубация клеток в присутствии постоянной концентрации ингибиторов в течение 24 ч может не вполне отражать действие этих препаратов in vivo. В то же время связавшийся с мишенью PF-184 диссоциирует довольно медленно - до 12 ч [31], поэтому мы модифицировали схему применения ингибиторов так, чтобы они присутствовали в культуральной среде только в течение первых 3 ч стимуляции (схема 3). Для стимуляции использовали только сочетание C12 + ЛПС. После 3 ч культивирования в присутствии аго-нистов и ингибиторов клетки отмывали, вновь добавляли C12 + ЛПС, но без ингибиторов, и культивировали еще 21 ч. Показатели жизнеспособности клеток
при таком режиме культивирования с ингибиторами не отличались от контрольных без ингибиторов (рис. 2А).
Секрецию цитокинов по схеме 3 оценивали за период с 3 до 24 ч после начала стимуляции. Содержание ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 при данном режиме культивирования составило соответственно ~ 30, ~ 63 и ~ 98 % от их содержания при непрерывном культивировании в течение 24 ч (рис. 2Б). Таким образом, большая часть ФНО высвобождается в культуральную среду в первые 3 ч стимуляции C12 + ЛПС, а большая часть ИЛ-6 и ИЛ-23 - после 3 ч. Присутствие PF-184 в первые 3 ч стимуляции не влияло на секрецию ФНО в последующие 21 ч, но существенно снижало секрецию ИЛ-6 и ИЛ-23 (рис. 2В). Присутствие МАПКи и в особенности сочетания PF-184 + МАПКи в первые 3 ч подавляло секрецию всех трех цитокинов в последующие 21 ч (рис. 2В). Таким образом, после падения концентрации ингибиторов во внеклеточной среде их действие на продукцию цитокинов в целом сохраняется, тогда как отрицательное влияние на жизнеспособность практически исчезает.
Влияние ингибиторов IKKß и МАПК на синергическую кооперацию агонистов NOD1 и TLR4
Помимо подавления экспрессии и продукции цито-кинов как таковой, нас интересовала возможность инги-
Таблица 5. Относительное количество жизнеспособных макрофагов (%) при стимуляции С12 и/или ЛПС и добавлении ингибиторов за 15 мин до начала стимуляции (п = 5)
Ингибитор Время стимуляции, ч Агонист
C12 ЛПС C12 + ЛПС
PF-184 3 94,4 ± 3,2* 96,0 ± 4,2 94,6 ± 1,9**
24 81,6 ± 5,2** 86,4 ± 6,5** 81,4 ± 8,6**
МАПКи 3 98,8 ± 4,7 102,9 ± 7,9 103,6 ± 5,8
24 87,3 ± 10,4 95,7 ± 10,8 88,4 ± 11,5
PF-184+МАПКи 3 96,7 ± 5,3 96,1 ± 10,5 99,1 ± 6,3
24 68,5 ± 17,3* 76,5 ± 13,9* 69,4 ± 17,1*
э
120 -
х
100-
ю о ск 80-
оо G H се 60-
(U и нк з 40-
* sO 20-
0-
К графикам А и В Д-. I Схема 1 I Схема 3
PF-184 МАПКи PF-184+ МАПКи
э
8000-,
6000-
£ 4000-1 р
H
а 2000-
ФНО
- fri
ИЛ-6
I Без агонистов I02+ЛПС, 0-24 ч ИИ2+ЛПС, 3-24 ч
ИЛ-23
Э
OÏK р,
120-, 100806040200-20
ФНО
Т
PF-184 МАПКи
PF-184+ МАПКи
120-, 100 -806040200--20-
ИЛ-6
Т
я 1-а
m
Без PF-184 МАПКи PF-184+ ингиб. МАПКи
120-, 100806040200 -■ -20-
ИЛ-23
1
*** *** *** lÜttj:*!-
Без PF-184 МАПКи PF-184+ ингиб. МАПКи
Рис. 2. Сопоставление эффектов ингибиторов IKKß и МАПК при применении по схемам 1 и 3 на жизнеспособность и продукцию цитокинов макрофагами, активированными C12 + ЛПС
А - показатели жизнеспособности макрофагов через 24 ч после начала стимуляции при использовании ингибиторов по схеме 1 (в течение всего срока стимуляции) и по схеме 3 (в первые 3 ч стимуляции); Б - уровни цитокинов в супернатантах макрофагов, стимулированных C12 + ЛПС, наработанные за период с 0 до 24 чис 3 до 24 ч после начала стимуляции; В - остаточные уровни ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 через 24 ч после начала стимуляции при использовании ингибиторов по схемам 1 и 3. Число экспериментов n = 3; * -p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001 при сравнении с контролем без ингибиторов (парный t-тест).
0
*
*
бирования синергического эффекта (снижения ИП) при полной или частичной сохранности ответа на отдельные агонисты. Такую ситуацию наблюдали для мРНК IL12B (табл. 6). Коктейль МАПКи, а также сочетание PF-184 + МАПКи при добавлении за 15 мин до начала стимуляции вызывали достоверное снижение ИП через 4 ч после начала стимуляции. Достоверное снижение ИП IL12B наблюдалось также при добавлении PF-184 и PF-184 + МАПКи через 1 ч после начала стимуляции (табл. 6). Для остальных исследованных генов и секре-тируемых цитокинов достоверных изменений ИП под действием ингибиторов не отмечалось.
Таблица 6. Влияние ингибиторов IKKß и МАПК на синерги-ческую индукцию мРНК IL12B при сочетанной стимуляции рецепторов NOD1 и TLR4 в течение 4 ч
Ингибитор Время добавления ингибитора ИП
Без ингибиторов - 4,53 ± 1,38
PF-184 -15 мин 3,94 ± 4,11
МАПКи -15 мин 2,04 ± 0,56**
PF-184 + МАПКи -15 мин 2,14 ± 1,13**
PF-184 +1 ч 1,70 ± 0,36*
МАПКи +1 ч 3,80 ± 2,02
PF-184 + МАПКи +1 ч 2,67 ± 1,05*
Примечание: * - p < 0,05; ** - p < 0,01 при сравнении с ИП в отсутствие ингибиторов.
Обсуждение
Избыточная активация врожденного иммунного ответа при острых инфекционных заболеваниях может быть причиной тяжелых, в том числе системных, воспалительных реакций, приводящих к полиорганной недостаточности. Предотвращение или купирование таких реакций - одна из задач терапии.
Поскольку вещества микробного происхождения распознаются через ПРР, эти рецепторы представляются логичной мишенью при борьбе с избыточным воспалительным ответом. Из препаратов, таргетирующих ПРР, наиболее известны антагонисты и ингибиторы ТЬЯ4, которые либо конкурируют с естественным ЛПС за связывание с рецептором (эриторан), либо блокируют начальный этап внутриклеточного сигналинга (ТАК-242). В эксперименте эти препараты эффективно предотвращали развитие эндотоксинового шока, вызванного введением ЛПС [32, 33], однако в клинических испытаниях у пациентов с сепсисом не оказали влияния на летальность [33, 34]. Этот пример иллюстрирует неэффективность подхода к лечению сепсиса, нацеленного на отдельные ПРР, даже если эти ПРР играют важную роль в распознавании этиологически значимых микроорганизмов. Ранее мы выдвинули предположение, что одной из причин клинической неэффективности антагонистов ТЬЯ4 могли быть неучтенные синергические эффекты между ТЬЯ4 и другими ПРР, в частности МОБ-подобными рецепторами [35].
Более действенным представляется подход, направленный на ингибирование сигнальных путей, которые отвечают за продукцию провоспалительных цитокинов и используются не одним ПРР, а целыми их семействами. В представленной работе мы показали, что инги-бирование сигнальных путей с участием IKKß/NF-кБ и/или МАПК/AP-! позволяет эффективно подавить экспрессию и продукцию основных провоспалительных цитокинов в макрофагах, стимулированных не только отдельно взятыми агонистами NOD1 и TLR4, но и их сочетанием.
Механизмы действия ингибиторов различались: если PF-184 в первую очередь подавлял транскрипцию мРНК цитокинов, то коктейль ингибиторов МАПК действовал на этапах как транскрипции, так и трансляции. Сочетание ингибиторов IKKß и МАПК обладало синер-гическим эффектом, практически полностью блокируя цитокиновый ответ макрофагов при сочетанной стимуляции NOD1 и TLR4. С точки зрения возможного клинического применения представляется важным, что МАПКи и сочетание МАПКи + PF-184 не только предотвращали, но и прерывали уже начавшуюся продукцию цитокинов, так как были эффективны при добавлении к макрофагам через 1 ч после их активации.
Сигнальные пути с участием NF-кБ и МАПК контролируют не только продукцию провоспалительных цитокинов, но и в целом защитный ответ макрофагов, а также их адаптацию к внешним воздействиям, выживание и апоптоз. В этой связи представляется важным, что ингибирование NF-кБ-зависимого сигнального пути у мышей с острым перитонитом не влияло на механизмы антибактериальной защиты, но приводило к уменьшению повреждения легочной ткани [12]. Более того, сочетанное ингибирование трех МАПК в эксперименте приводило к существенному улучшению результатов вакцинации [36]. Таким образом, кратковременное ингибирование сигнальных путей с участием NF-kB и МАПК in vivo не только не ослабляет, но даже усиливает противоинфекционную защиту и минимизирует повреждение тканей. Что касается токсичности ингибиторов, использованных в нашей работе, она была наиболее выражена при пролонгированной (24 ч) инкубации макрофагов с сочетанием ингибиторов IKKß и МАПК. Коктейль ингибиторов МАПК в данных условиях токсичность не проявлял. Сокращение времени присутствия ингибиторов в культуральной среде до 3 ч, обоснованное данными о периоде их полувыведения in vivo, позволяет минимизировать токсичность при сохранении значительного ингибирующего действия на продукцию цитокинов.
Различные схемы применения ингибиторов позволили уточнить временные рамки влияния сигнальных
■ Литература
1. Global report on the epidemiology and bürden of sepsis: current evidence, identifying gaps and future directions. World Health Organization 2020. URL: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/ 334216/9789240010789-eng.pdf
путей на экспрессию и продукцию конкретных цито-кинов. Так, ингибитор IKKP вызывал понижение выработки ФНО только при добавлении с самого начала стимуляции (см. табл. 2), тогда как через 1 ч после начала активации и позже этот ингибитор на выработку ФНО практически не влиял (см. табл. 4, рис. 2В). Однако эффект этого ингибитора на продукцию ИЛ-6 и ИЛ-23 сохранялся и в эти сроки (см. табл. 4, рис. 2В). Эти различия коррелируют с кинетикой активации соответствующих генов: ФНО является ранним цитокином и пиковые уровни его мРНК в макрофагах достигаются через 1-2 ч после начала стимуляции агонистами NOD1 и/или TLR4, тогда как пик экспрессии остальных генов приходится на более поздние сроки: IL6 - на 3-4 ч, IL23A - на 2-3 ч, IL12B - на 4 ч и позже ([14] и наши неопубликованные данные).
Ингибиторный анализ показал также гетерогенность механизмов, лежащих в основе синергического усиления экспрессии цитокинов. Хотя все четыре исследованных гена синергически отвечали на сочетанную стимуляцию NOD1 + TLR4 (см. рис. 1), ослабление синергического эффекта в присутствии PF-184 и МАПКи, выражающееся в уменьшении индекса потенцирования, наблюдалось только в отношении генаIL12B (см. табл. 6). При этом ингибиторы МАПК уменьшали ИПIL12B при их добавлении до начала стимуляции, тогда как ингибитор IKKp оказывал такой эффект только при внесении через 1 ч после начала стимуляции, что указывает на довольно короткие временные интервалы, в течение которых данные сигнальные пути вносят вклад в формирование синергического эффекта.
Таким образом, ингибирование сигнальных путей с участием NF-kB и МАПК позволяет подавить или прервать экспрессию и продукцию цитокинов макрофагами, активированными мощным провоспали-тельным стимулом - комбинацией агонистов NOD1 + TLR4. Полученные данные можно использовать при разработке новых подходов к противовоспалительной терапии при тяжелых бактериальных инфекциях.
Выводы
1. Ингибирование сигнальных путей с участием NF-kB и МАПК позволяет предотвратить или прервать экспрессию и продукцию провоспалительных цитокинов ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 макрофагами, активированными комбинацией агонистов NOD1 + TLR4. Наиболее эффективно одновременное ингибирование обоих сигнальных путей.
2. Сигнальные пути с участием NF-kB и МАПК участвуют в формировании синергических эффектов при сочетанной активации рецепторов NOD1 и TLR4 в макрофагах.
2. Lei S., Li X., Zhao H., Xie Y., Li J. Prevalence of sepsis among adults in China: A systematic review and meta-analysis. Front Public Heal. 2022; 10: 977094. DOI: https://doi.org/10.3389/FPUBH.2022. 977094
3. Park J.M., Greten F.R., Li Z.W., Karin M. Macrophage apoptosis by anthrax lethal factor through p38 MAP kinase inhibition. Science. 2002; 297 (5589): 2048-51. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1073163
4. Zhou H., Monack D.M., Kayagaki N., Wertz I., Yin J., Wolf B., Dixit V.M. Yersinia virulence factor YopJ acts as a deubiquitinase to inhibit NF-kappa B activation. J. Exp. Med. 2005; 202 (10): 1327-32. DOI: https://doi.org/10.1084/JEM.20051194
5. Lei X., Dong X., Ma R., Wang W., Xiao X., Tian Z., Wang C., Wang Y., Li L., Ren L., Guo F., Zhao Z., Zhou Z., Xiang Z., Wang J. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat. Commun. 2020; 11: 3810. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-17665-9
6. Fukao T. Immune system paralysis by anthrax lethal toxin: The roles of innate and adaptive immunity. Lancet Infect. Dis. 2004; 4 (3): 166-70. DOI: https://doi.org/10.1016/S1473-3099(04)00940-5
7. Nau R., Eiffert H. Minimizing the release of proinflammatory and toxic bacterial products within the host: a promising approach to improve outcome in life-threatening infections. FEMS Immunol. Med. Micro-biol. 2005; 44 (1): 1-16. DOI: https://doi.org/10.1016/J.FEMSIM.2005. 01.001
8. Cecconi M., Evans L., Levy M., Rhodes A. Sepsis and septic shock. Lancet. 2018; 392: 75-87. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)30696-2
9. Coburn J., Garcia B., Hu L.T., Jewett M.W., Kraiczy P., Norris S.J., Skare J. Lyme Disease Pathogenesis. Curr. Issues Mol. Biol. 2021; 42: 473-518. DOI: https://doi.org/10.21775/CIMB.042.473
10. Beutler B., Milsark I.W., Cerami A.C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 1985; 229 (4716): 869-71. DOI: https://doi. org/10.1126/SCIENCE.3895437
11. Oh S.J., Kim J.H., Chung D.H. NOD2-mediated Suppression of CD55 on Neutrophils Enhances C5a Generation During Polymicrobial Sepsis. PLoS Pathog. 2013; 9: e1003351. DOI: https://doi.org/10.1371/ journal.ppat.1003351
12. Li H., Han W., Polosukhin V., Yull F.E., Segal B.H., Xie C.M., Blackwell T.S. NF-kB inhibition after cecal ligation and puncture reduces sepsis-associated lung injury without altering bacterial host defense. Mediators Inflamm. 2013; 2013: 503213. DOI: https://doi. org/10.1155/2013/503213
13. Long B., Koyfman A. Controversies in Corticosteroid use for Sepsis. J. Emerg. Med. 2017; 53 (5): 653-61. DOI: https://doi. org/10.1016/J.JEMERMED.2017.05.024
14. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., Murugin V.V., Selezneva E.M., Pash-chenkova Y.G., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflam-matory gene expression. J. Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https:// doi.org/10.4049/JIMMUNOL.2000692
15. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M., Cavaillon J.M., Philpott D.J., Adib-Conquy M. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526286
16. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D., Playford R.J. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526296
17. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева А.В., Чулкина М., Атауллаханов Р. И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агони-стов различных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123
18. Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X., Birdwell D., Alejos E., Silva M., Galanos C., Freudenberg M., Ricciardi-Castagnoli P., Layton B., Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science. 1998; 282 (5396): 2085-8. DOI: https://doi.org/10.1126/science.282.5396.2085
19. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J., Sansonetti P.J., Mengin-Lecreulx D. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41702-8. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M307198200
20. Масютина А.М., Пащенков М.В. Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецептора. Иммунология. 2023; 44 (4): 408-18. DOI: https://doi.org/10.33 029/0206-4952-2023-44-4-408-418
21. Takada H., Galanos C. Enhancement of endotoxin lethality and generation of anaphylactoid reactions by lipopolysaccharides in muramyl-dipeptide-treated mice. Infect. Immun. 1987; 55 (2): 409-13. DOI: https:// doi.org/10.1128/iai.55.2.409-413.1987
22. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Mu-ramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-394. DOI: https://doi.org/10.1097/SHK.0b013e3181453e59
23. Falvo J.V., Tsytsykova A.V., Goldfeld A.E. Transcriptional control of the TNF Gene. Curr. Dir. Autoimmun. 2010; 11: 27. DOI: https://doi. org/10.1159/000289196
24. Litvak V., Ramsey S.A., Rust A.G., Zak D.E., Kennedy K.A., Lampano A.E., Nykter M., Shmulevich I., Aderem A. Function of C/EBP5 in a regulatory circuit that discriminates between transient and persistent TLR4-induced signals. Nat. Immunol. 2009; 10 (4): 437-43. DOI: https:// doi.org/10.1038/ni.1721
25. Gri G., Savio D., Trinchieri G., Ma X. Synergistic regulation of the human interleukin-12 p40 promoter by NFkappaB and Ets transcription factors in Epstein-Barr virus-transformed B cells and macrophages. J. Biol. Chem. 1998; 273 (11): 6431-8. DOI: https://doi.org/10.1074/ JBC.273.11.6431
26. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shche-blyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V., Stanhope-Baker P., Naroditsky B.S., Gudkov A.V., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155650
27. Seo J., Kojak D.D., Bartelt L.C., Williams C.A., Barrera A., Gersbach C.A., Reddy T.E. AP-1 subunits converge promiscuously at enhancers to potentiate transcription. Genome Res. 2021; 31 (4): 538-50. DOI: https://doi.org/10.1101/GR.267898.120
28. Waskiewicz A.J., Flynn A., Proud C.G., Cooper J.A. Mitogen-activated protein kinases activate the serine/threonine kinases Mnk1 and Mnk2. EMBO J. 1997; 16 (8): 1909-20. DOI: https://doi.org/10.1093/ emboj/16.8.1909
29. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The role of the p38-MNK-eIF4E signaling axis in TNF production downstream of the NOD1 receptor. J. Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48. DOI: https:// doi.org/10.4049/jimmunol.1600467
30. Duffy J.P., Harrington E.M., Salituro F.G., Cochran J.E., Green J., Gao H., Bemis G., Evindar G., Galullo V.P., Ford P.J., Germann U.A., Wilson K.P., Bellon S.F., Chen G., Taslimi P., Jones P., Huang C., Pazha-nisamy S., Wang Y.M., Murcko M.A., Su M.S.S. The discovery of VX-745: a novel and selective p38a kinase inhibitor. ACS Med. Chem. Lett. 2011; 2 (10): 758. DOI: https://doi.org/10.1021/ML2001455
31. Sommers C.D., Thompson J.M., Guzova J.A., Bonar S.L., Rader R.K., Mathialagan S., Venkatraman N., Holway V. W., Kahn L.E., Hu G., Garner D.S., Huang H.C., Chiang P.C., Schindler J.F., Hu Y., Meyer D.M., Kishore N.N. Novel tight-binding inhibitory factor-кВ kinase (IKK-2) inhibitors demonstrate target-specific anti-inflammatory activities in cellular assays and following oral and local delivery in an in vivo model of airway inflammation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009; 330 (2): 377-88. DOI: https://doi.org/10.1124/JPET.108.147538
32. Sha T., Sunamoto M., Kitazaki T., Sato J., Ii M., Iizawa Y. Therapeutic effects of TAK-242, a novel selective Toll-like receptor 4 signal transduction inhibitor, in mouse endotoxin shock model. Eur. J. Pharmacol. 2007; 571 (2-3): 231-9. DOI: https://doi.org/10.1016/J. EJPHAR.2007.06.027
33. Rice T.W., Wheeler A.P., Bernard G.R., Vincent J.L., Angus D.C., Aikawa N., Demeyer I., Sainati S., Amlot N., Cao C., Ii M., Matsuda H., Mouri K., Cohen Jon. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial of TAK-242 for the treatment of severe sepsis. Crit. Care Med. 2010; 38 (8): 1685-94. DOI: https://doi.org/10.1097/CCM.0b013e3181e7c5c9
34. Opal S.M., Laterre P.F., Francois В., LaRosa S.P., Angus D.C., Mira J.P. et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: The ACCESS randomized trial. JAMA. 2013; 309 (11): 1154-62. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.2013.2194
35. Pashenkov M.V., Murugina N.E., Budikhina A.S., Pinegin B.V. Synergistic interactions between NOD receptors and TLRs: Mechanisms and clinical implications. J. Leukoc. Biol. 2019; 105 (4): 669-80. DOI: https://doi.org/10.1002/JLB.2RU0718-290R
36. Lanna A., Gomes D.C.O., Muller-Durovic B., McDonnell T., Escors D., Gilroy D.W., Lee J.H., Karin M., Akbar A.N. A sestrin-dependent Erk-Jnk-p38 MAPK activation complex inhibits immunity during aging. Nat. Immunol. 2017; 18 (3): 354-63. DOI: https://doi.org/10.1038/NI.3665
■ References
1. Global report on the epidemiology and burden of sepsis: current evidence, identifying gaps and future directions. World Health Organization 2020. URL: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/ 334216/9789240010789-eng.pdf.
2. Lei S., Li X., Zhao H., Xie Y., Li J. Prevalence of sepsis among adults in China: A systematic review and meta-analysis. Front Public Heal. 2022; 10: 977094. DOI: https://doi.org/10.3389/FPUBH.2022.977094
3. Park J.M., Greten F.R., Li Z.W., Karin M. Macrophage apoptosis by anthrax lethal factor through p38 MAP kinase inhibition. Science. 2002; 297 (5589): 2048-51. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1073163
4. Zhou H., Monack D.M., Kayagaki N., Wertz I., Yin J., Wolf B., Dixit V.M. Yersinia virulence factor YopJ acts as a deubiquitinase to inhibit NF-kappa B activation. J Exp Med. 2005; 202 (10): 1327-32. DOI: https:// doi.org/10.1084/JEM.20051194
5. Lei X., Dong X., Ma R., Wang W., Xiao X., Tian Z., Wang C., Wang Y., Li L., Ren L., Guo F., Zhao Z., Zhou Z., Xiang Z., Wang J. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat Commun. 2020; 11: 3810. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-17665-9
6. Fukao T. Immune system paralysis by anthrax lethal toxin: The roles of innate and adaptive immunity. Lancet Infect Dis. 2004; 4 (3): 166-70. DOI: https://doi.org/10.1016/S1473-3099(04)00940-5
7. Nau R., Eiffert H. Minimizing the release of proinflammatory and toxic bacterial products within the host: a promising approach to improve outcome in life-threatening infections. FEMS Immunol. Med Microbiol. 2005; 44 (1): 1-16. DOI: https://doi.org/10.1016ZJ.FEMSIM.2005.01.001
8. Cecconi M., Evans L., Levy M., Rhodes A. Sepsis and septic shock. Lancet. 2018; 392: 75-87. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)30696-2
9. Coburn J., Garcia B., Hu L.T., Jewett M.W., Kraiczy P., Nor-ris S.J., Skare J. Lyme Disease Pathogenesis. Curr Issues Mol Biol. 2021; 42: 473-518. DOI: https://doi.org/10.21775/CIMB.042.473
10. Beutler B., Milsark I.W., Cerami A.C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 1985; 229 (4716): 869-71. DOI: https://doi.org/ 10.1126/SCIENCE.3895437
11. Oh S.J., Kim J.H., Chung D.H. NOD2-mediated Suppression of CD55 on Neutrophils Enhances C5a Generation During Polymicrobial Sepsis. PLoS Pathog. 2013; 9: e1003351. DOI: https://doi.org/10.1371/ journal.ppat.1003351
12. Li H., Han W., Polosukhin V., Yull F.E., Segal B.H., Xie C.M., Blackwell T.S. NF-kB inhibition after cecal ligation and puncture reduces sepsis-associated lung injury without altering bacterial host defense. Mediators Inflamm. 2013; 2013: 503213. DOI: https://doi.org/10.1155/ 2013/503213
13. Long B., Koyfman A. Controversies in Corticosteroid use for Sepsis. J Emerg Med. 2017; 53 (5): 653-61. DOI: https://doi.org/10.1016/J. JEMERMED.2017.05.024
14. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P. V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., Murugin V.V., Selezneva E.M., Pash-chenkova Y.G., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflam-matory gene expression. J Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https:// doi.org/10.4049/JIMMUNOL.2000692
15. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M., Cavaillon J.M., Philpott D.J., Adib-Conquy M. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526286
16. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D., Playford R.J. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526296
17. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M., Ataul-lakhanov R.I. Synergistic cytokine production by murine dendritic cells in response to their simultaneous activation with pairs of agonists of different innate immune receptors. Immunologiya. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123 (in Russian)
18. Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X., Birdwell D., Alejos E., Silva M., Galanos C., Freudenberg M., Ricciardi-Castagnoli P., Layton B., Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science. 1998; 282 (5396): 2085-8. DOI: https://doi.org/10.1126/science.282.5396.2085
19. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J., Sansonetti P.J., Mengin-Lecreulx D. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J Biol Chem. 2003; 278 (43): 41702-8. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M307198200
20. Masyutina A.M., Pashenkov M.V. Transcriptional response of macrophages to combined stimulation of a NOD-like and a Tolllike receptor. Immunologiya. 2023; 44 (4): 408-18. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-408-418 (in Russian)
21. Takada H., Galanos C. Enhancement of endotoxin lethality and generation of anaphylactoid reactions by lipopolysaccharides in muramyl-dipeptide-treated mice. Infect Immun. 1987; 55 (2): 409-13. DOI: https:// doi.org/10.1128/iai.55.2.409-413.1987
22. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Muramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-394. DOI: https://doi.org/10.1097/SHK.0b013e3181453e59
23. Falvo J. V., Tsytsykova A. V., Goldfeld A.E. Transcriptional control of the TNF gene. Curr Dir Autoimmun. 2010; 11: 27. DOI: https:// doi.org/10.1159/000289196
24. Litvak V., Ramsey S.A., Rust A.G., Zak D.E., Kennedy K.A., Lampano A.E., Nykter M., Shmulevich I., Aderem A. Function of C/EBPS in a regulatory circuit that discriminates between transient and persistent TLR4-induced signals. Nat Immunol. 2009; 10 (4): 437-43. DOI: https:// doi.org/10.1038/ni.1721
25. Gri G., Savio D., Trinchieri G., Ma X. Synergistic regulation of the human interleukin-12 p40 promoter by NFkappaB and Ets transcription factors in Epstein-Barr virus-transformed B cells and macrophages. J Biol Chem. 1998; 273 (11): 6431-8. DOI: https://doi.org/10.1074/ JBC.273.11.6431
26. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shche-blyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V., Stanhope-Baker P., Naroditsky B.S., Gudkov A.V., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155650
27. Seo J., Koçak D.D., Bartelt L.C., Williams C.A., Barrera A., Gersbach C.A., Reddy T.E. AP-1 subunits converge promiscuously at enhancers to potentiate transcription. Genome Res. 2021; 31 (4): 538-50. DOI: https://doi.org/10.1101/GR.267898.120
28. Waskiewicz A.J., Flynn A., Proud C.G., Cooper J.A. Mitogen-activated protein kinases activate the serine/threonine kinases Mnk1 and Mnk2. EMBO J. 1997; 16 (8): 1909-20. DOI: https://doi.org/10.1093/ emboj/16.8.1909
29. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The role of the p38-MNK-eIF4E signaling axis in TNF production downstream of the NOD1 receptor. J Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48. DOI: https:// doi.org/10.4049/jimmunol.1600467
30. Duffy J.P., Harrington E.M., Salituro F.G., Cochran J.E., Green J., Gao H., Bemis G., Evindar G., Galullo V.P., Ford P.J., Germann U.A., Wilson K.P., Bellon S.F., Chen G., Taslimi P., Jones P., Huang C., Pazhanisamy S., Wang Y.M., Murcko M.A., Su M.S.S. The discovery of VX-745: A novel and selective p38a kinase inhibitor. ACS Med Chem Lett. 2011; 2 (10): 758. DOI: https://doi.org/10.1021/ML2001455
31. Sommers C.D., Thompson J.M., Guzova J.A., Bonar S.L., Rader R.K., Mathialagan S., Venkatraman N., Holway V.W., Kahn L.E., Hu G., Garner D.S., Huang H.C., Chiang P.C., Schindler J.F., Hu Y., Meyer D.M., Kishore N.N. Novel tight-binding inhibitory factor-kB kinase (IKK-2) inhibitors demonstrate target-specific anti-inflammatory activities in cellular assays and following oral and local delivery in an in vivo model of airway inflammation. J Pharmacol Exp Ther. 2009; 330 (2): 377-88. DOI: https://doi.org/10.1124/JPET.108.147538
32. Sha T., Sunamoto M., Kitazaki T., Sato J., Ii M., Iizawa Y. Therapeutic effects of TAK-242, a novel selective Toll-like receptor 4 signal transduction inhibitor, in mouse endotoxin shock model. Eur J Pharmacol. 2007; 571 (2-3): 231-9. DOI: https://doi.org/10.1016/J.EJPHAR.2007.06.027
33. Rice T.W., Wheeler A.P., Bernard G.R., Vincent J.L., Angus D.C., Aikawa N., Demeyer I., Sainati S., Amlot N., Cao C., Ii M., Matsuda H., Mouri K., Cohen Jon. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial
Сведения об авторах
Масютина Анна Михайловна - мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: annanikolaeva.msu@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1904-6714
Муругин Владимир Владимирович - канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ajax81@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-1011-2554
Пащенков Михаил Владимирович - д-р мед. наук, зав. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
of TAK-242 for the treatment of severe sepsis. Crit Care Med. 2010; 38 (8): 1685-94. DOI: https://doi.org/10.1097/CCM.0b013e3181e7c5c9
34. Opal S.M., Laterre P.F., Francois B., LaRosa S.P., Angus D.C., Mira J.P. et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: The ACCESS randomized trial. JAMA. 2013; 309 (11): 1154-62. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.2013.2194
35. Pashenkov M.V., Murugina N.E., Budikhina A.S., Pinegin B.V. Synergistic interactions between NOD receptors and TLRs: Mechanisms and clinical implications. J Leukoc. Biol. 2019; 105 (4): 669-80. DOI: https://doi.org/10.1002/JLB.2RU0718-290R
36. Lanna A., Gomes D.C.O., Muller-Durovic B., McDonnell T., Escors D., Gilroy D.W., Lee J.H., Karin M., Akbar A.N. A sestrin-depen-dent Erk-Jnk-p38 MAPK activation complex inhibits immunity during aging. Nat Immunol. 2017; 18 (3): 354-63. DOI: https://doi.org/10.1038/ NI.3665
Authors' information
Anna M. Masyutina - Junior Researcher of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: annanikolaeva.msu@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1904-6714
Vladimir V. Murugin - PhD, Researcher of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ajax81@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-1011-2554
Mikhail V. Pashenkov - MD, PhD, Acting Head of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of the Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
