CC BY
35
Ингибиторный эффект фоскарнета и ацикловира на репродукцию вируса герпеса человека 6 типа в культуре клеток
А. В. МЕЛЬНИЧЕНКО, Н. Д. ЛЬВОВ, Г. А. ГАЛЕГОВ
Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Москва
Inhibitory Effect of Foscarnet and Acyclovir on Reproduction of Human Herpesvirus 6 in Cell Culture
A. V. MELNICHENKO, N. D. LVOV, G. A. GALEGOV
D. I. Ivanovsky Institute of Virology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Представлены результаты изучения противовирусного действия двух практически значимых препаратов — фоскарнета (фосфономуравьиная кислота, фоскавир) и ацикловира на репродукцию вируса герпеса 6 типа (ИИУ-6) в эксперименте на чувствительной лимфобластоидной клеточной линии И8Б-2. Установлено преимущество препарата ФМК в сравнении с ацикловиром. Ацикловир является малоэффективным препаратом в отношении НИУ-6-инфекции: ХТИацв=0,9 и использование его в клинической практике нецелесообразно, а препарат ФМК (ХТИфмк=10) и подобные ей вещества обладают выраженным противовирусным действием.
Ключевые слова:: вирус герпеса человека 6 типа (HHV-6), ацикловир, фосфономуравьиная кислота — фоскарнет, противовирусное действие in vitro.
Two practically important antiviral agents, i. e. foscarnet (phosphonoformic acid, foscavir) and acyclovir, and their inhibitory effect on reproduction of human herpesvirus 6 (HHV-6) were investigated in an experiment with sensitive lymphoblastoic cell line HSB-2. Phosphonoformic acid (PFA) was shown advantageous vs. acyclovir. In a model of HHV-6 infection acyclovir was low active (chemotherapeutic index of 0.9) and its use in clinical practice is not useful, whereas PFA (chemoterapeutic index of 10) and similar agents showed significant antiviral activity that indicated the necessity of their further investigation.
Key words: human herpesvirus 6, acyclovir, phosphonoformic acid (foscarnet), in vitro antiviral activity.
Вирус герпеса человека 6 типа (HHV-6 —Human herpesvirus type 6) — один из новых лимфопролиферативных представителей семейства Herpesviridae. HHV-6 является этиопатогеном rozeola infantum (exanthema subitum) внезапной экзантемы — широко распространённого заболевания детей раннего возраста, характеризующегося высокой лихорадкой и кожной сыпью, индуцирующее, как правило, первую лихорадку в жизни ребёнка и тяжёлые лимфопролиферативные и иммунодефицитные заболевания у взрослых (лимфомы, ангиоиммуноблас-тоидная лимфоаденопатия, лимфоидная лейкемия, саркоидоз и др). [1, 2] До настоящего времени нет лекарственных средств для лечения этих видов патологий человека. Поэтому изучение ингибирования репродукции HHV-6 с помощью различных соединений является актуальной задачей.
Для изучения особенностей ингибиторного эффекта современных противовирусных химиопрепаратов на репродукцию вируса герпеса чело-
© ^пле^ив aвтoрoв, 2009
Адрес для кoррeспoндeнции: 123098 Moсквa, ул. Гамалеи, 1б. Институт вирyсoлoгии им. Д. И. Ива^вс^™
века б типа бы^го прoaнaлизирoвaнo действие ациктовира (АЦВ) и тринaтриeвoй толи фoсфoнo-муравьижй кислoты (ФМК, Фoскaрнeт, Фoскa-вир). Ациктовир — как этaлoнный препарат, представитель группы ана^тов нyклeoзидoв, m^ora применяемый в терапии герпесвирус^й инфекции (ГИ), а ФМК (фoскaрнeт) (нeoргaничeскoe ^единение) — как препарат с другим мexaнизмoм прoтивoвирyснoгo действия — ингибитор активісти вирусжй ДHK-пoлимeрaзы.
Настоящее сooбщeниe тсвяще^ сравнитель-жму изучению OTyx известньж прoтивoгeрпeтичe-скж препаратов — ациктовира и тринaтриeвoй co-ли фocфoнoмyрaвьинoй киототы (фocкaрнeтa) на рeпрoдyкцию вируса герпеса б типа в культуре клеток (in vitro). Цитотокcичecкoe и прoтивoвирycнoe действие препаратов изучали на эксперименталь-жй мoдeли для кyльтивирoвaния вируса — сус-пeнзиoннoй клеточтой линии HSB-2, вторая на-ибoлee чувствительная для HHV-б.
Материал и методы
Клетки. В рaбoтe иcпoльзoвaли лимфoблacтoиднyю перевиваемую клеточную линию HSB-2. K^eiM кyльтивирoвaли в
Концентрация препарата Плотность клеточной Жизнеспособность % ННУ-6 положительных
в мкг/мл суспензии, млн/мл_________________________клеток в %________________________клеток в нРИФ
3 сут 5 сут 9 сут 3 сут 5 сут 9 сут 3 сут 5 сут 9 су
ФМК
10 1,2 0,98 0,6 74 40 11 28 64 75
20 1,18 1,0 0,87 75 63 24 27 58 61
40 1,1 1,3 1,4 78 65 43 18 24 38
80 1,1 2,1 1,8 88 74 71 14 20 35
160 1,0 1,8 1,5 90 78 80 8 10 6
АЦВ
10 1,3 0,85 0,3 60 26 12 28 66 89
20 0,98 0,7 0,3 43 31 22 26 58 78
40 0,5 0,6 0,3 34 25 17 18 45 64
80 0,31 0,26 0,23 13 10 6 27 39 45
160 0,23 0,14 0,08 11 8 7 13 27 43
Контроль клеток 2,02 2,5 2,0 92 94 88 — — —
Контроль вируса 1,46 0,8 0,1 68 24 8 31 67 94
концентрации 5х105 кл/мл в среде КРМ1-1640 с добавлением 10—15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ Ь-глутами-на и 100 мкг/мл гентамицина в виде суспензии, в атмосфере, содержащей 5% СО2 и 98% влажности при температуре 37°С.
Вирус. Вирус герпеса человека 6 типа вариант А (НИУ-6А) штамм 08, полученный из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.
Препараты. Фосфономуравьиная кислота в виде тринат-риевой соли (ФМК) получена из Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва.
Ацикловир (9-(2гидроксиэтоксиметил)гуанин, ациклогу-анозин, Зовиракс, АЦВ) производства ОЫхо'МЪИсоше, Великобритания.
В эксперименте использовались следующие концентрации препаратов: ФМК — от 25 до 800 мкг/мл и АЦВ — от 10 до 160 мкг/мл. Перед внесением в культуру клеток рабочие растворы ФМК и АЦВ стерилизовали путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («МйИроге», США).
Исследование цитотоксичности препаратов. В лунки культуральных 24-луночных планшетов («СоБ1аг») помещали по 1,8 мл суспензии клеток Н8В-2 в концентрации 5х105 кл/мл, после чего в соответствующие лунки добавляли по 0,2 мл исследуемых препаратов в различных концентрациях или полную ростовую среду. Учет результатов проводили через 24, 48, 72, 96 ч культивирования клеток. Результаты опыта оценивали по снижению темпов роста культуры (подсчитывали плотность клеточной популяции — определение концентрации клеток с помощью красителя на основе 0,1% кристаллвиолета и лимонной к-ты) и по уменьшению % жизнеспособных клеток (определяли путём подсчёта клеток, прокрасившихся 0,5% трипановым синим). Для каждого препарата определяли ТЦД50 — цито-токсическую дозу, вызывающую 50% изменения морфологии ткани и нарушения поглощения клетками красителя на 50% по сравнению с контролем.
Исследование анти-ИИУ-в активности препаратов. С целью изучения влияния ФМК и АЦВ на репликацию ННУ-6А (штамм 08) в культуре клеток инфицировали чувствительную клеточную линию Н8В-2 вируссодержащей суспензией, множественность инфицирования составляла 0,1ТЦПД/кл. Эксперименты проводили в тех же объёмах и условиях культивирования, что и при исследовании цитотоксичности препаратов. После адсорбции вируса (1 час) клетки отмывали и вносили препараты в различных концентрациях. На 3-, 5-, 7-, 9-й день инкубации проводили учёт результатов. Противовирусное действие веществ оценивали по ряду показателей: подсчёт количества жизнеспособных клеток в суспензии, % жизнеспособных клеток, % ННУ-6 положительных клеток в реакции непрямой иммунофлюоресценции (нРИФ).
Для каждого препарата определяли величину ИД50-дозу, ингибирующую репродукцию вируса на 50%. Для оценки перспективности препаратов как возможных химиотерапевтических средств в исследованиях рассчитывали ХТИ-химиотера-певтический индекс, который наиболее статистически достоверно характеризует специфическую противовирусную активность препарата.
ХТИ=ТЦД50/ИД50. Если ХТИ < 1, то это практически неактивное вещество в отношении исследованного вируса, если ХТИ > 8 — то препарат обладает сильным противовирусным действием.
Результаты и обсуждение
В результате проведённых исследований обнаружено, что ФМК в концентрациях 25—100 мкг/мл не оказывает токсического влияния на физиологическое состояние клеток. При 200 мкг/мл ФМК слаботоксична, причем токсичность выражается лишь в снижении темпов роста культуры и незначительном снижении % жизнеспособных клеток. Только при концентрации 400—800 мкг/мл наблюдался цитопатический эффект, что отражалось на
3—4-й день наблюдения снижением (р<0,0017) как плотности клеточной суспензии на 75%, так и жизнеспособности клеток на 67% при концентрации ФМК 800 мкг/мл. 50% цитотоксическая доза ТЦД50 для ФМК составила 500 мкг/мл.
При исследовании цитотоксичности АЦВ было установлено, что в концентрациях 10—40 мкг/мл препарат оказывает слабый токсический эффект на
4-й день, однако при 80—160 мкг/мл уже на первые сутки в клеточной суспензии отмечался выраженный токсический эффект, статистически достоверное (р<0,0005) снижение показателей как плотности клеточной суспензии на 77%, так и снижение на 84% жизнеспособности клеток. ТЦД50 ацикловира составила 90 мкг/мл.
Данные исследования противовирусного действия ФМК и АЦВ на вирус представлены в таблице.
В результате изучения противовирусного действия препаратов показано, что АЦВ оказывает незначительное ингибиторное действие на
репликацию вируса в клетках при концентрации 80—160 мкг/мл, но при этом отмечается выраженный цитотоксический эффект. Процент HHV-6(+) клеток в нРИФ на протяжении всего срока наблюдения при 160 мкг/мл снижается в среднем на 61% по сравнению с контролем вируса, но при этом число жизнеспособных клеток резко уменьшается — к 9 дню на 95%. ИД50 для АЦВ составила 100 мкг/мл. Исследование более высоких концентраций АЦВ в дальнейших экспериментах представлялось нецелесообразным, поскольку в этих концентрациях отмечается выраженный токсический эффект на клеточную культуру.
Установлено, что ФМК оказывает значительное ингибиторное действие на репродукцию вируса. Так, в концентрациях 20 мкг/мл к 5 дню отмечается снижение (р<0,0003) HHV-6(+) клеток в нРИФ на 42%, а при 160 мкг/мл к 10 дню наблюдения вируспродуцирующие клетки не обнаруживаются в нРИФ. При этом количество клеток (1,5х106) и процент жизнеспособности (80%) остаются практически на уровне контрольных (2х106) и 88% на 9-й день эксперимента. ИД50 ФМК составила 50 мкг/мл.
В результате, величина ХТИ для АЦВ составляет 0,9, а для ФМК — 10. Таким образом, в наших исследованиях АЦВ оказался малоэффективным препаратом в отношении HHV-6, а фосфономуравьиная кислота проявляла выраженное противовирусное действие.
Фосфономуравьиная (ФМК), а также фосфо-ноуксусная (ФУК) кислота обладают сходным механизмом противовирусного действия. Механизм ингибирующего действия связан с подавлением функции вирусспецифической ДНК-полимеразы путём взаимодействия ингибитора с энзимом в участке связывания с пирофосфатом. А препараты из группы аналогов нуклеозидов (например, АЦВ) с механизмом противовирусного действия, зависящего от тимидинкиназной активности инфицированной клеточной системы, оказывают слабое проЛИТЕРАТУРА
1. Мельниченко А. В. Разработка и получение диагностических тест-систем к вирусу герпеса человека 6 типа и их применение для изучения HHV-6 инфекции. Автореф. дис. к. м. н. 2002; 27.
2. Львов Н. Д., Мельниченко А. В. Вирусы герпеса человека 6, 7 и 8-го типов — новые патогенны семейства Herpesviridae. Вопр вирусол 1999; 3: 105—111.
3. Di Luca D, Katsafanas G., Schirmer E. C. The replication of viral DNA in human herpesvirus 6-infected cells. Virology. 1990; 157: 199—210.
тивовирусное действие на вирус герпеса 6 типа. Рядом авторов сообщается о значительном ингибирующем действии фосфоноуксусной кислоты в концентрациях 100—300 мкг/мл [3] и в концентрациях
5—100 мкг/мл [4] в отношении HHV-6-инфекции in vitro. Поэтому предполагается, что в HHV-6 кодируется ФМК- или ФУК-чувствительная ДНК-по-лимераза, а тимидинкиназа, необходимая для фос-форилирования ацикловира, не кодируется или ее активность недостаточна. Исследователями [5, 6] выявлена уникальная, отличная от уже известных, ДНК-полимеразная активность в HHV-6-инфици-рованных клетках. ДНК-полимераза отличалась по субстратной специфичности, чувствительности к солям.
Препарат ФМК в наших экспериментах проявил значительный ингибиторный эффект на репликацию HHV-6 в концентрациях 10—50 мкг/мл и не оказывал токсического влияния на клетки. Так, при использовании 40 мкг/мл наблюдается снижение HHV-6 положительных клеток в нРИФ на 42%. А АЦВ в концентрации 100 мкг/мл оказывал незначительное противовирусное действие, но при этом наблюдался выраженный цитотоксический эффект. Исследователи [3, 7] сообщают, что АЦВ в концентрациях 50—800 мкг/мл оказывал значительный токсический эффект на клетки и не полностью ингибировал экспрессию вируса, а в концентрациях 100—400 мкмоль (25—100 мкг/мл) только на 65% блокировал репликацию вируса.
В результате наших исследований, химиотерапевтический индекс (ХТИ) для ФМК составил 10, а для АЦВ — 0,9. Таким образом, АЦВ является малоэффективным препаратом в отношении HHV-6-инфекции in vitro и использование его в клинической практике для лечения заболеваний, вызванных вирусом герпеса 6 типа, является, по-видимому, малоцелесообразным. ФМК и подобные ей вещества, обладают выраженным противовирусным действием на HHV-6-инфекцию и требует дальнейших исследований в практике.
4. Black J. B., Lopez C., Pellet P. E. Induction of host cell protein synthesis by human herpesvirus 6. Virus Res 1991; 22: 13—23.
5. Bapat A. R., Bodner A. J., Ting R. C. Identification and some properties of a unique DNA polymerase from cells infected with human B-lym-photropic virus. J Virol 1989; 63: 1400—1403.
6. Shiraki K., Okuno T., Yamanishi K. Phosphonoacetic acid inhibits replication of human herpesvirus 6. Antiviral Res 1989; 12: 311—318.
7. Streicher H. Z., Hung C. L., Ablashi D. V. In vitro inhibition of human herpesvirus 6 by phosphonoformate. J Virol Meth 1988; 21: 301—304.
