CC BY
37
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
55
создание условий и поощрение творчества и новаторства и т.д. У администрации поликлиники остаются функции перспективного планирования, координации работы всех подразделений, контроля качества оказания медицинской помощи.
Результаты работы отделений ВОП поликлиники с середины 1990-х годов по настоящее время показывают эффективность применения холонического подхода в управлении медицинской организацией. Существенно (более чем на 30%) снизился уровень вызовов скорой медицинской помощи, стабилизировался уровень госпитализации (160-165 на 1000 жителей), внедрены новые принципы лечения пациентов с бронхиальной астмой и артериальной гипертензией, вдвое снизился показатель младенческой смертности и т.д.
Созданные условия для функционирования системы оказания первичной медико-санитарной помощи позволили:
- отработать основные принципы организации работы врача общей практики на базе многопрофильной поликлиники;
- создать механизмы организационно-финансового взаимодействия между врачами общей практики, врачами-специалистами, медицинскими организациями города и области, страховыми медицинскими организациями;
- реализовать принципы медико-экономического подхода к дифференцированной оплате труда;
- внедрить в работу городской поликлиники ресурсосберегающие технологии;
- отработать элементы ответственности ВОП за оказание медицинской помощи пациентам на всех этапах оказания медицинской помощи;
- совершенствовать методику профилактического направления в деятельности ВОП с выявлением пациентов с факторами риска развития хронических социально-значимых заболеваний;
- разработать программное сопровождение деятельности городской поликлиники, позволяющее решать организационно-финансовые вопросы, управлять структурными изменениями и качеством медицинской помощи;
- разработать принципы организации самостоятельной работы медицинских сестер.
В результате повышения уровня внутренней самоорганизации системы оказания медицинской помощи в городской поликлинике, наделению полномочиями по принятию самостоятельных решений минимальных холонов, были отработаны принципы взаимодействия поликлиники со стационарами и другими медицинскими организациями по догоспитальной подготовки пациентов, созданию условий для долечивания пациентов в амбулаторных условиях после проведенного оперативного лечения и т.д.
Таким образом, использование принципов холони-ческого подхода к функциональной организации деятельности медицинской организации амбулаторного звена позволило создать условия для повышения качества оказания медицинской помощи и рационального использования уже имеющихся ресурсов, а также для перспективного развития отрасли в целом за счет высокой самоорганизации внутри каждого медицинского учреждения.
Литература
1. Виттих, В.А. Эволюционное управление сложными системами // Известия научного центра РАН, 2000. - Т. 2. - № 1. - С. 53-65.
2. Суслин, С.А., Федосеева, Л.С., Назаркина И.М. Современные организационные подходы к оказанию медицинской помощи в условиях городской клинической поликлиники // Главврач. 2014. - № 7. - С. 25-30.
3. Koestler, A. The Ghost in the Machine // London: Arcana books. 1989.
ИНФОРМАТИВНЫЙ КЛЕТОЧНЫЙ АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И НОВЫЙ ЦИТОАНАЛИЗАТОР НА ИХ ОСНОВЕ
Сухенко Евгений Пантелеевич
Канд. физ.-мат. наук, г. Москва Беляков Владимир Константинович
Доктор мед. наук, профессор, г. Москва
АННОТАЦИЯ
Интенсивно развивающиеся направления клеточной медицин и клеточных биотехнологий нуждаются в оперативном получении все более подробной информации о клеточных и субклеточных структурах и элементах, о меняющейся функциональности клеток и внутриклеточных процессах. Для ее получения необходимо расширение существующего набора аналитических методов и создание методов повышенной информативности. Предлагаемая аналитическая технология использует и развивает электрокинетические методы - электрофорез и диэлектрофорез, выполняемые в оперативном режиме на одном препарате. Представлен образец цитоанализатора, обсуждаются его возможности и анализируемые клеточные характеристики.
Ключевые слова: клеточный и субклеточный анализ, аналитические технологии, клеточный электрофорез, диэлектрофорез, оперативные и экспресс-анализы, клеточная медицина, биотехнологии
1. Введение
Исследование свойств живых клеток представляет собой сложную комплексную задачу, которая по многим причинам не имеет однозначного методического решения. В силу этого существует спектр биологических, химических, физических, физико-химических и других методов,
которые, дополняя друг друга, позволяют весьма широко описать свойства клеток.
Исследователями используются десятки различных свойств клеток, например, размер, форма, плотность, заряд, цвет, подвижность, индекс пролиферации и т.д., характеризующиеся средними значениями, среднеквадратическими отклонениями, дисперсией и др. Перечень,
56
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
измеряемых параметров клеток постоянно расширяется, так как непрерывно продолжается их исследование, внедряются все новые и новые фундаментальные и технологические достижения.
Клетка является основой строения всех животных, растений и многих микроорганизмов. Многое о строении клетки в целом и отдельных ее компонентов уже известно. Всестороннее исследование клетки является актуальным для изучения патогенеза многих заболеваний, разработки новых эффективных процессов для нужд биотехнологии. Именно в клетках начинаются патологические изменения, приводящие к возникновению заболеваний. Ведь любая болезнь - это, в конечном итоге, сбой в работе клеток. Клетки также являются основой многих процессов в биотехнологии.
Современные естественные науки благодаря разработке и применению принципиально новых подходов, электроники и компьютерной техники, совершенствованию уже известных методов исследования позволяют перейти на более высокий уровень изучения организации и функционировании клеток - динамику взаимодействия с окружающей средой (электролитом, совокупностью окружающих биологических и других частиц). Среди таких подходов следует выделить использование электрического поля.
Изучение клетки с помощью постоянного электрического поля позволило описать целый ряд очень важных ее характеристик таких, как заряд, дзета-потенциал, трансмембранный потенциал и др. Трансмембранный потенциал позволил исследовать в клетке нестационарные физико-химические градиенты и транспорт ионов через клеточную мембрану. В постоянном электрическом поле на клетку действует сила F = q.E, которая пропорциональна величине его заряда (q), а также напряженности (E) внешнего электрического поля [1, 2, 3]. Указанное выражение положено в основу классического метода электрофореза, принадлежащего к разряду электрокинетических явлений. Электрофорез или микроэлектрофорез - направленное движение коллоидных частиц или ионов под действием внешнего электрического поля, в результате действия силы F со стороны электрического поля все компоненты электролита, биочастицы, которые обладают зарядом q (ионы, молекулы, белки, молекулярные и клеточные структуры), приходят в поступательное движение вдоль силовых электрических линий. Направление и скорость движения, электрофоретическая подвижность клетки являются важными источниками информации об
ее строении, процессах, протекающих как внутри, так и вокруг нее [2, 3, 4]. Структура и функция клетки тесным образом связаны с распределением зарядов на поверхности мембраны, которые способны перемещаться как по ее поверхности, так и через мембрану [5, 6, 7].
Современная теория электрофореза в целом хорошо описывает поведение биочастиц и клетки в постоянном электрическом поле. На его основе удалось создать ряд уникальных технологий: фильтрации, сепарации, переноса вещества из одной области в другую, разделения белков по массе, изучения свойств отдельных клеточных структур (например, мембраны), а также клетки в целом [2, 3, 4, 8].
Еще более широкие возможности в изучении свойств биочастиц предоставляет исследователям использование переменного электрического поля средних и высоких частот. Они связаны, прежде всего, с возможностью исследования характеристик электрических нейтральных биочастиц в неоднородном переменном электрическом поле (НПЭП) через их поляризацию в широком частотном диапазоне [9-11]. Внешние электрические поля способны вносить возмущение в электронные оболочки атомов и молекул. Возмущение сопровождается смещением атомов молекул и их электронных оболочек относительно положения своего равновесия на незначительную величину dx в пространстве. В результате, поляризация создает то, что называют индуцированным дипольным моментом d = q dx частицы. Это физическое явление - основа поляризации электрических зарядов и носит всеобщий фундаментальный характер. Поляризация в большей или меньшей степени характерна для всех без исключения веществ. Количественное описание поляризации достигается введением феноменологического коэффициента пропорциональности a - поляризуемости, который связывает между собой отклик частицы и вызывающее его воздействие напряженности электрического поля (E). Поляризуемость отражает индивидуальность вещества, распределение зарядов по всему объему. Характеризация биочастиц (клеток, бактерий, вирусов и д.р.) по признаку поляризуемости отражает присущую им биологическую уникальность через системное распределение атомно-молекулярных структур по всему их объему. Хорошо известно, что структура и функция клеток, бактерий, вирусов тесным образом связаны между собой. Такая связь указывает на наличие корреляции между величиной поляризуемости и функциями биочастиц.
Рисунок 1. Опытный образец цитоанализатора «Биони-КЭА»
Движение биочастиц, помещенных в жидкий ди- который, как и электрофорез, относится к разряду элек-электрик (например, воду), при наложении НПЭП полу- трокинетических явлений. В научной литературе широкое
чило название “диэлектрофорез” (dielectrophoresis) [9, ll],
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
57
распространенное получили сокращения для диэлектрофореза - ДЭФ, DEP, соответственно, на русском и английских языках, и МЭФ, MEF для микроэлектрофореза.
Теоретические основы использования электрофореза и диэлектрофореза живых клеток для целей медицины и биологии описаны в литературных источниках, но их широкое применение до конца прошлого века сдерживалось отсутствием доступных, быстродействующих и надежных технических средств регистрации поведения клеток в электрических полях и автоматизированного анализа этого поведения для статистически значимых клеточных популяций.
2. Технические средства для выполнения электрокинетического клеточного анализа
Нами создан для реализации указанных целей опытный образец аппаратно-программного комплекса на основе использования современной элементной базы микроэлектроники, высококачественной микроскопии с применением цифрового видеорегистратора с КМОП матрицей, и развитых технологий обработки изображений, использующих методы параллельного программирования. Цитоанализатор «Биони-КЭА» предназначен для исследований живых клеток разных видов in vitro и ex vivo, его опытный образец представлен на рисунке 1.
Анализы с помощью цитоанализатора могут выполняться с различными целями:
1) С целью диагностики патологических состояний человека и животных (либо хода и эффективности их терапии) по текущим значениям их клеточных характеристик, сравниваемых с нормативными значениями;
2) С целью оценки чувствительности клеток к различным внешним воздействиям - в частности, к действию лекарств, токсикантов, излучений, температуры и пр., путем сравнения определяемых характеристик при наличии и отсутствии таких воздействий.
3) С целью оценки степени общей токсичности проб воды и др. сред по их воздействию на известные характеристики тестовых клеток в сравнении с показателями контрольных проб.
Комплект цитоанализатора включает:
- лабораторный микроскоп Микмед-6;
- цифровую окулярную видеокамеру DCM 130;
- компьютер со специализированным ПО;
- генератор стабилизированных напряжений ГСН-1;
- электрокинетические камеры (3 вида);
- соединительные кабели.
Воздействие электрических полей на клетки производится в капиллярных камерах, удобных для наблюдения и фиксации реакций клеток через микроскоп. Для проведения электрофореза и диэлектрофореза требуется разная пространственная структура электрических полей, поэтому для создания зон с разной структурой поля в камере используются разные пары электродов. На рисунке 2 для примера показана камера для комплексного электрокинетического анализа с нагревом препарата, разработанная в данном проекте. Основными элементами камеры являются:
- электрокинетическая ячейка из оптического стекла с электродами и спейсерами для обеспечения плоского капиллярного слоя;
- тонкое покровное стекло, размещаемое на электродах и спейсерах (на рисунке не показано);
- держатель, обеспечивающий фиксированное положение ячейки на столике микроскопа в период проведения анализа;
- электрический мини-нагреватель;
- электрический разъем держателя и проводниковые линии с упругими контактами для подведения напряжения от генератора.
Рисунок 2. Камера для комплексного электрокинетического анализа с нагревом (ККАН)
Технические характеристики камеры представлены в таблице:
Таблица 1
Технические характеристики камеры для комплексного анализа с нагревом
Наименования характеристик ККАН
Объем заправляемого препарата 40-45 мкл
Материал электродов на ячейках никель, графитовая паста
Толщина электродов для МЭФ: 35-40 мкм для ДЭФ: до 1 мкм
Зазор между электродами для МЭФ: 8 мм для ДЭФ:100-150 мкм
Температурный диапазон выполнения анализов комнатная температура, при нагреве(+30: +45)°С
58
Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
3. Технология анализа и его информативность В процессе анализа с помощью МЭФ возвратно-поступательные колебания клеток в однородном переменном поле, создаваемом электродами ячейки, записываются цифровой видеокамерой в память компьютера, затем полученный видеофайл обрабатывается специализированными программами, с автоматической выдачей результата. По характеристикам перемещений клеток, кроме средней амплитуды, пропорциональной их заряду и дзета-потенциалу, рассчитываются численные значения доли подвижных клеток относительно их общего числа, гистограмма распределения клеток по амплитудам, а также значения показателей формы гистограммы (асимметрии и эксцесса). Длительность одного анализа, включая заправку препарата, видеозапись процесса микроэлектрофореза, ее обработку и формирование отчета, зависит от возможностей компьютера и обычно не превышает 5 минут, в т.ч. длительность видеозаписи 10-15 секунд.
Анализ с помощью ДЭФ выполняется после МЭФ и длится примерно такое же время, при этом клетки не только перемещаются в растворе, но и могут деформироваться, агрегироваться и распадаться. Все эти трансформации записываются видеокамерой и анализируются при компьютерной обработке каждого кадра. В результате последовательного выполнения комплексного анализа выдается отчет с представлением следующего набора характеристик:
При электрофорезе При диэлектрофорезе
- средняя амплитуда колебаний клеток,
- поляризуемость клеток; пропорциональная их дзета-потенциалу;
- электрическая емкость мембраны
- доля подвижных клеток;
- проводимость мембраны;
- гистограмма распределения клеток - обобщенная жесткость; по амплитудам (график);
- обобщенная вязкость;
- асимметрия гистограммы (показатель ее - граничная частота симметричности); диэлектрофореза;
- эксцесс гистограммы (показатель ее - индекс агрегации; пирамидальности) - индекс деструкции;
Морфологические характеристики (для каждой клетки и в среднем по препарату):
- радиус клетки; - эллиптичность;
- площадь; - цвет;
- гистограммы.
Как видно, набор клеточных характеристик предоставляет достаточно новых возможностей как для научных исследований в указанных областях, так и для диагностики, контроля терапии и профилактических мероприятий в практическом здравоохранении. В частности, более подробно процедуры диагностики патологических состояний сердечно-сосудистой системы и печени, а также контроля терапии по текущим значениям клеточных характеристик изложены в монографии [12]. Представленные здесь методы и технические средства запатентованы [13-14].
4. Выводы
Представленная технология анализа и опытный образец цитоанализатора могут быть использованы для подъема на более высокий уровень качества и количества выполняемых клеточных анализов как в практической и научной медицине, так и в практике исполнения и разработки современных биотехнологий. Весьма важно и то, что стоимость анализов и представленного приборного оборудования весьма выгодно отличается от альтернативных импортных вариантов техники для клеточных анализов, поэтому описанный цитоанализатор подходит и для импортозамещения.
Список литературы
1. Духин С.С., Дерягин Б.В. Электрофорез - М.: «Наука», 1976.- 332 с.
2. Козинец Г.И., Шишов В.П. и др. Клеточный электрофорез - его теоретическое и практическое значение (обзор лит. и собств. данные) // Проблемы гематологии и переливания крови.- 1979.- № 2.- С. 4044.
3. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. Электрофорез клеток крови в норме и патологии. — Минск: Беларусь, 1974.- 143 с.
4. Donath E., Pastushenko V. Electrophoretic study of cell
surface properties: theory and experimental
applicability // J.Electroanal. Chem. and Interfac. Electrochem. - 1980.- Vol. 116. - P. 31-40.
5. Антонов В.Ф. Биофизика мембран // Соросовский образоват. журн. Сер. Биология.-1996.- № 6. - С. 412.
6. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. - М.: Наука, 1992.- 135 с.
7. Pretlow T.G., Pretlow T.P., Cell electrophoresis// Int. Rev. Cytol. - 1979. - Vol. 61. - P. 85-128.
8. Пастушенко В.Ф., Кузьмин П.И., Чизмаджев Ю.А. Диэлектрофорез и электровращение клеток: единая теория для сферически симметричных клеток с произвольной структурой мембраны // Биол. мембраны. - 1988. - Т. 5, № 1. - С. 65-78.
9. Чизмаджев Ю.А., Пастушенко В.Ф., Кузьмин П.И., Теория диэлектрофореза везикул и клеток // Биол. мембраны. - 1985. - Т. 2, № 11. - С.1147-1161.
10. Pohl H.A. Dielectrophoresis. - Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1978.-579 p.
11. Генералов В.М., Кручинина М.В. (общая редакция). Диэлектрофорез в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний. - Новосибирск: Изд-во ЦЭРИС, 2011. - 172 с.
12. Сухенко Е.П., Бакиров Т.С., Генералов В.М., и др. Пат. РФ № 2357251 Способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его вариант. - Заявка 2006100448/15 от 10.01.2006; Опубл. 27.05.2009, Бюл. № 15.
13. Сухенко Е.П., Беляков В.К. Камера для экспрессного комплексного электрокинетического анализа. - Патентная заявка 2015122045 от 09.06.2015.
ПСИХОЛОГО-ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ И МЕДИКО-СОЦИАЛЬНОЕ СОПРОВОЖДЕНИЕ ЛИЦ С ОГРАНИЧЕННЫМИ ВОЗМОЖНОСТЯМИ ЗДОРОВЬЯ В УСЛОВИЯХ ШКОЛЫ-
ИНТЕРНАТА III, IV ВИДОВ
Тимофеева Т.Б.,
заместитель директора по коррекционной работе, государственного коррекционного учреждения Ростовской области школы-интерната III, IV видов № 33 г. Новочеркасска
