CC BY
52
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. - 2008. - Вип. 16, т. 1. - С. 34-40. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Ecology. - 2008. - Vol. 16, N 1. - P. 34-40.
УДК 577.1
О. М. Василюк, П. В. Гриценко
Дніпропетровський національний університет
ВПЛИВ РЕГУЛЯТОРІВ РОСТУ НА АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ ПЕРЕАМІНУВАННЯ В ЛИСТІ ТА КОРЕНЯХ SALIX ALBA
Проаналізовано вплив регуляторів росту рослин на активність ферментів АЛТ та АСТ в листках і коренях живців Salix alba (L.) за умов різного субстратного пророщування. Спостерігали наявність кореляційних зв’язків між фізіологічними та біохімічними показниками в листках і коренях живців Salix alba (L.).
O. M. Vasilyuk, P. V. Grytsenko
Dnipropetrovsk National University
INFLUENCE OF GROWTH REGULATORS ON ACTIVITY OF TRANSAMINATION ENZYMES IN LEAVES AND ROOTS OF SALIX ALBA
The influence of growth regulators on AlT and AsT enzymatic activity in the leaves and roots of Salix alba (L.) saplings under conditions of different substrates was analysed. The correlation between physiological and biochemical indices in the leaves and roots was observed.
Вступ
Регулятори росту рослин (РРР) природного походження набувають великого значення. Емістим С - унікальний біорегулятор широкого спектра дії з епіфітів корінців цілющих рослин. Технологія застосування передбачає обробку рослин спільно із засобами захисту. Чаркор - стимулятор укорінення зелених і здерев’янілих живців, створений на базі Емістиму С. РРР підсилюють обмінні процеси на рівні клітин і організму, доповнюють органічні мінеральні добрива в системі, підвищують коефіцієнт використання поживних елементів. За своєю ефективністю доза РРР на гектар прирівнюється до кількості NPK 20-30 кг/га діючої речовини, що відповідає 80-90 кг ваги аміачної селітри та подвійного суперфосфату, 40 % калійної солі. Під дією РРР на 20-30 % підвищується захисний рівень рослин проти хвороб, активно рубцюється пошкоджений листовий апарат, підвищується виділення нектару та пилку у соняшника та багаторічних трав. Доведено, що РРР поліпшують гормональний статус рослин, підвищують фізіологічну стійкість до стресових факторів [і; 8; 14; 16; 19].
В умовах радіаційного забруднення встановлено, що вміст 90Sr та 137Cs у зерні ячменю та силосній масі кукурудзи зменшувався на 18-35 % при застосуванні Емістиму С та Зеастимуліну. Кращими РРР за умов недостатнього забезпечення ґрунтів поживними речовинами визнано ті, що створені в Україні і рекомендовані до застосовування як обов’язковий агрозахід. Розрахунками інституту “Агроресурси” Міністерства аграрної політики доведено, що використання РРР дозволяє додатково отримати продукції при вкладенні однієї гривні в технологію: пшениці - на 16,0 грн., яч-
© О. М. Василюк, П. В. Гриценко, 2008 34
меню - на 9,8 грн., кукурудзи - 12,3 грн., цукрових буряків - б3,3 грн., картоплі -197,0 грн. Використання РРР для деревних культур із метою відновлення водоохоронних зон і лісів по урізу води та перешкоджання заростання повітряно-водною рослинністю малих степових річок з утворенням небажаного вектора зміни біогеоценозу та його гідробіологічних складових недостатньо, тому науковий пошук у даному напрямку набуває великого практичного значення.
Об’єкт досліду - верба біла (Salix alba (L.)), невибаглива деревна культура. Мета роботи - оцінити активність аланінамінотрансферази (АЛГ) та аспартатамінотрансфе-рази (АСГІ’) у листках і коренях живців, для вкорінення яких використовували воду та пісок із внесенням РРР. Відомо, що у білковому обміні рослин значну роль відіграють реакції переамінування аспарагінової та глютамінової кислот. В умовах дії чинників навколишнього середовища відбувається зміна вектора білкового синтезу, пов’язаного із ферментами переамінування АЛT та АС^ У зв’язку з цим необхідно визначити роль ферментів переамінування в адаптації рослин до зміни факторів середовища. Вивчення адаптивної реакції трансфераз на зміни умов довкілля на цій культурі, порівняно з іншими, проведене недостатньо детально [2-5; 9; 10; 11; 21-28].
Матеріал і методи досліджень
В умовах лабораторного досліду визначали активність ферментів переамінування АЛT та АСT у листках і коренях живців верби білої. Досліди виконували за наступною схемою: К1 - контроль (вода), 2 - Емістим С (вода), 3 - Чаркор (вода), 4 -Чаркор + Емістим С (вода), 5 - контроль (пісок), б - Емістим С (пісок), 7 - Чаркор (пісок), 8 - Чаркор + Емістим С (пісок).
АЛT та АСT є частиною ферментної системи, за допомогою якої утилізується аспартат. Оксалооцтова кислота (ООК), що отримується в результаті реакції кетокислоти та пірувату, утворює забарвлені сполуки з 2,4-динітрофенілгідразином, які визначаються фотометрично при довжині хвилі 54б нм [б; 7; 10; 12; 13; 18].
Унаслідок переамінування за участю АЛT (2.б. 1.2) утворюються глютамінова та піровиноградна кислоти. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється забарвлений гідразон піровиноградної кислоти, забарвлення якого пропорційне активності ферменту. У результаті переамінування за участю АСT (2.б.1.1) утворюються глютамінова та оксалооцтова кислоти. При внесенні 2,4-динітрофенілгідразину ензиматичний процес зупиняється й у лужному середовищі утворюються забарвлені гідразони оксалооцтової та піровиноградної кислот (гідразон піровиноградної кислоти утворюється за умов спонтанного декарбоксилювання оксалоацетату, має більшу оптичну густину).
Для роботи використовували наступні стандартні розчини: 1а) для визначення активності АСТ - 0,1 М фосфатний буфер (pH 7,4), 0,1 М Z-аспартат, 2 мМ а-кето-глутарат; 1б) для визначення активності АЛT - 0,1 М фосфатний буфер (pH 7,4), 0,2 М DZ-аланін, для визначення активності АЛT - 2мМ а-кетоглутарат; 2) 1 мМ 2,4-динітро-фенілгідразин; 3) 0,4 Н NaOH.
Активність ферментів АЛT та АСT визначали методом В. В. Польового та Г. Б. Максимова [18]. Активність А1 визначали в мікромолях піровиноградної кислоти в 1 мл розчину за хвилину. Активність А2 виражали в мікромолях піровиноградної кислоти за хвилину на 1 г сухої речовини, питому активність А3 - в мікромолях піровиноградної кислоти за хвилину на 1 мг білка. Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд [23] та виражали у мг/мл розчину. Отримані результати оброблені статистично за допомогою кореляційного аналізу з 95 % рівнем значущості [15].
Результати та їх обговорення
В умовах лабораторного досліду вивчали активність ферменту переамінування АЛГ в листках та коренях живців Salix alba (L.) (рис. 1). Слід зазначити, що питома активність АЛT у листках набувала вищих абсолютних показників порівняно з коренями для всіх варіантів досліду. Особливо істотні відмінності спостерігали при порівнянні серії дослідів і пророщуванні на воді (контроль 1) та піску (контроль 2). У варіантах 1-4 у листках живців, що пророщували на воді, питома активність АЛT відповідно збільшується відносно контролю 1 на 8-13 %, тоді як питома активність АЛT у коренях живців у варіантах досліду із застосуванням Чаркору та комбінації Чаркору з Вмістимом С була інгібована відносно контролю на 23 %.
1,2 1
К1 2 3 4 К2 6 7 8
Варіанти досліду
Рис. 1. Питома активність АЛТ (%) у листках і коренях живців Salix alba (L.) на фоні дії регуляторів росту:
K1 - контроль (вода), 2 - Вмістим С (вода), 3 - Чаркор (вода), 4 - Чаркор + Вмістим С (вода),
К2 - контроль (пісок), 6 - Вмістим С (пісок), 7 - Чаркор (пісок), 8 - Чаркор + Вмістим С (пісок);
И - у листі, □ - у корінні.
У серії дослідів, які проводили з піском, питома активність АЛT у листках живців знижувалась за умов композиційного внесення регуляторів росту на 17 %. Подібну тенденцію зниження активності ферменту спостерігали й у корінні верби білої для всіх варіантів досліду. Tаким чином, активність АЛT збільшувалась у листках живців при пророщуванні на воді, тоді як у коренях відбувався зворотний процес. Значних змін активності ферменту за умов пророщування на піску не спостерігалося.
В умовах модельного досліду визначали питому активність АСТ у листі і корінні живців Salix alba (L.) (рис. 2). Слід зазначити, що питома активність АСT в листках живців майже для всіх варіантів досліду (за винятком варіанта 7) перевищувала цей показник для коріння. Максимальні значення питомої активності контролю 2 стосовно АСТ у листках живців реєстрували у варіанті зі внесенням композиційно
Емістиму С та Чаркору (дослід 4 - перевищення контролю 1 на 12 %), на відміну від максимальних показників АЛТ в аналогічних варіантах досліду. У варіантах досліду
2 та 3 значення показника від контрольних достовірно не відрізнялись. Активність АСТ у корінні живців проявляла тенденцію до зниження, що співпадає з динамікою активності АЛТ.
У варіантах досліду з пророщуванням на піску питома активність АСТ у листі знижена у варіанті зі спільним внесенням регуляторів росту (на 17 %), а в інших варіантах досліду наближена до контролю 2. У корінні спостерігали підвищення питомої активності АЛТ (на 14 % при внесенні Чаркору) та інгібування активності АСТ у варіантах 6 та 8 (на 8-9 % відповідно).
1,2
К1 2 З 4 К2 б 7 8
Варіанти досліду
Рис. 2. Питома активність ACT (%) у листках і коренях живців Salix alba (L.) на фоні дії регуляторів росту:
K1 - контроль (вода), 2 - Вмістим C (вода), З - Чаркор (вода), 4 - Чаркор + Вмістим C (вода),
К2 - контроль (пісок), 6 - Емістим С (пісок), 7 - Чаркор (пісок), 8 - Чаркор + Емістпм С (пісок);
И - у листі, □ - у корінні.
В умовах модельного досліду визначали концентрацію білка в листі та корінні живців Salix alba (L.) (рис. З). У варіантах досліду з пророщуванням на воді та піску концентрація білка в листках живців достовірно від контрольних не відрізнялась. У корінні живців у варіантах досліду З та 4 концентрація білка перевищувала контроль 1 на 1б-21 % відповідно. У серії досліду з пророщуванням на піску концентрація білку перевищувала контроль 2 у варіантах б та 8 на 15-18 %. Tаким чином, у корінні живців концентрація білка коливалась залежно від варіантів досліду, тоді як у листі була наближена до контрольних показників.
Зміни питомої активності ферментів AЛT та ACT у листі та корінні живців (відповідно I та II), загальної концентрації білка та AЛT (III), загальної концентрації білка та ACT (IV) у дослідних пробах призводять до необхідності дослідити можливість існування кореляційних зв’язків між цими фізіологічними та біохімічними показниками (табл.). Між концентрацією AЛT і ACT у листі живців верби білої тільки
З7
для варіантів із використанням РРР 7 (Чаркор) та 8 (Чаркор та Емістим С) за умов пророщування на піску виявили високі коефіцієнти кореляції (-0,88) та 0,74 відповідно, що доводить наявність існування залежності між показниками, які вивчали. У коренях живців спостерігали існування суттєвих зв’язків між активністю ензимів для всіх варіантів досліду та виявили винятково позитивну кореляцію.
1,4
K1 2 3 4 K2 б 7 8
Варіанти досліду
Рис. З. Концентрація білка у листках і коренях живців Salix alba (L.) на фоні дії регуляторів росту:
K1 - контроль (вода), 2 - Вмістим C (вода), 3 - Чаркор (вода), 4 - Чаркор + Вмістим C (вода), К2 - контроль (пісок), 6 - Емістим С (пісок), 7 - Чаркор (пісок), 8 - Чаркор + Емістим С (пісок);
И -У листі, □ - у корінні.
Таблиця
Кореляційні зв’язки між активністю ферментів АЛТ і АСТ та концентрацією білка
Варіанти досліду I II III IV
листя коріння листя коріння листя коріння
K1 0,б3 0,84* -0,72* -0,б8 -0,42 0,78*
2 1,00 1,00* -1,00* 1,0 1,00 1,00*
3 -0,5б 0,99* -0,б0 -0,44 0,б9 0,3б
4 0,51 0,81* -0,б3 -0,50 -0,31 0,72
K2 0,б3 0,84* -0,72 -0,б8 -0,42 0,78*
б 1,00 1,00* 1,00* 1,00* -1,00* 1,00*
7 -0,88* 0,80* 0,78* 0,94* -0,59 -0,23
8 0,74* 0,75* -0,б4 0,10 -0,87* 0,11
Примітки: K1 - контроль (вода), 2 - Вмістим C (вода), 3 - Чаркор (вода), 4 - Чаркор + Вмістим C (вода), K2 - контроль (пісок), б - Вмістим C (пісок), 7 - Чаркор (пісок), 8 - Чаркор + Вмістим C (пісок).
Крім того, визначали можливість існування зв’язків між загальною активністю ферментів АЛТ, АСТ та концентрацією білка. Слід зазначити, що в листі живців спостерігали високі показники коефіцієнта кореляції між АЛТ та концентрацією білка,
тоді як у корінні дослідних варіантів 3 та 4, де застосовували РРР за умов пророщування на воді, спостерігали відсутність кореляційних ознак.
У листі живців спостерігали відсутність кореляції у контрольних пробах між ACT і концентрацією білка, тоді як існував суттєвий зв’язок між ознаками у варіантах досліду 2, б та S, де застосовували внесення РРР при вирощуванні як на воді, так і на піску. Відсутність кореляції за даними показниками в листках живців чергувалась з появою їх у коренях, що компенсувало розвиток біохімічних процесів для підтримки гомеостазу за умов зміни факторів зовнішнього середовища.
Висновок
Aктивність ферментів переамінування AЛT та ACT змінюється за умов впливу РРР, що свідчить про зміну білкового обміну в зазначених варіантах досліду. Процес адаптації рослин відбувається за рахунок активації аланінамінотрансферази і/або ас-партатамінотрансферази, що нормалізує напрямок білкового обміну. Питома активність AЛT та ACT набувала більших показників у листі живців порівняно з корінням. AЛT та ACT, як ензими азотного метаболізму, чутливі до змін субстратного забезпечення та РРР. Cпостерігали наявність кореляційних зв’язків між фізіологічними та біохімічними показниками в листі та корінні живців Salix alba (L.).
Бібліографічні посилання
1. Aнішин Д. A. Біостимулятори для соняшника / Д. A. Лнішин, C. П. Пономаренко // Захист рослин. - 1997. - № 4. - C. 14-15.
2. Aмінотрансферазна активація постачання субстратів у цикл ^ебса за умов стресу у щурів
з різною резистентністю до гіпоксії і роль оксиду азоту / H. М. ^ргалюк, О. В. Інкерт,
В. K. Рибальченко и др. // Доповіді HAHУ. - 2002. - № 9. - C. 182-188.
3. Боєчко Ф. Ф. Основні біохімічні поняття, визначення і терміни / Ф. Ф. Боєчко, Л. О. Боєчко. - K.: Вища школа, 1993. - 528 с.
4. Винниченко A. H. Эколого-физиологические механизмы адаптации растений к стрессам антропогенного происхождения / A. H. Винниченко, H. П. ^ик^инская // Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность. Хез. Междунар. конф. - Д.: ДГУ, 1995. - T. 2. - C. 5.
5. Влияние гербицидов на активность и полиморфизм аспартатаминотрансферазы /
A. H. Винниченко, H. П. Kоцюбинская, В. C. Бильчук и др. // Бюлл. Ин-та кукурузы. -1995. - № 80. - C. 14-19.
6. Гудин Т. Введение в биохимию растений / T. Гудин, Э. Мерсер. - М.: Мир, 198б. - T. 1. - 392 с.
7. Гудин Т. Введение в биохимию растений / T. Гудин, Э. Мерсер. - М.: Мир, 198б. - T. 2. - 312 с.
8. Ефективність застосування регуляторів росту для інкрустації насіння кукурудзи / З. О. Безвенюк, В. М. Tроян, В. М. Музика та ін. // Физиология и биохимия культурных растений. - 1995. - T. 27, № 4. - C. 248-253.
9. Коцюбинская H. П. Генетический контроль множественных форм аспартатаминотрансфе-разы у высоколизиновых мутантов / H. П. ^цю^н^ая, В. C. Бильчук, Л. В. Шупранова // Молекулярные механизмы генетических процесов. Tез. докл. VII Всесоюзн. симп. - М., 1990. - C. 155.
10. Коцюбинская Н. П. Характеристика ферментов переаминирования у мутантов кукурузы с измененным аминокислотным обменом / H. П. Kоцюбинская, В. C. Бильчук, Л. В. Шупранова // Проблемы азотистого метаболизма. Tез. докл. - Волгоград, 1990. - C. 52.
11. Коцюбинская Н. П. Эколого-биохимические аспекты адаптации культурных растений к антропогенным условиям среды. - Д.: ДГУ, 1995. - 172 с.
12. Кретович В. Л. Усвоение и метаболизм азота у растений. - М.: Шука, 1987. - 48б с.
13. Кретович В. Л. Переаминирование аспарагиновой и глутаминовой кислот в растении / В. Л. ^етович, A. A. Бундель // Доклады AH CCCP. - 1949. - T. 1б, № 5. - C. 90-94.
14. Курчий Б. A. Функционально активные группы биорегуляторов // Физиология и биохимия растений. - 1993. - T. 25, №1.
15. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 293 с.
16. Немченко В. В. Регуляторы роста для предпосевной обработки семян кукурузы /
B. В. Шмченко, H. П. Иванов // Химизация сельского хоз-ва. - 1991. - № 1. - C. 91-93.
17. Обякова Я. Aктивность аминотрансфераз, содержание белка и витамина В6 в связи с созреванием и прорастанием люпина: дис. ... канд. с-х. наук. - Минск, 1974. - 18 с.
18. Полевой В. В. Методы биохимического анализа растений / В. В. Полевой, Г. Б. Максимов. -Л.: ЛГУ, 1978. - 192 с.
19. Троян В. М. Вплив передпосівної обробки насіння фізіологічно активними речовинами на генеративний розвиток кукурудзи / В. М. Tроян, З. О. Безвенюк, T. A. Листопад // Физиология и биохимия культурных растений. - 1993. - T. 25, № 2. - C. 144-151.
20. Ферменты азотного метаболизма и адаптация растений к антропогенным условиям среды / A. H. Винниченко, H. П. Kоцюбинская, В. C. Бильчук и др. // Вестник Днепропетр. ун-ета. Биология. - Д.: ДГУ, 1995. - Вып. 2. - C. 140-149.
21. Экспрессия одноцепочечной цепи антитела к аспартатаминотрансферазе Р2 в трансгенных растениях табака / В. Л. Метт, В. A. Метт, Д. Ч. ^нг, П. Х. C. Рейнолдс // Физиология растений. - 2000. - T. 47. - C. 27-3б.
22. Bilchuk V. S. Identification of the lysine maize forms according to aspartate aminotransferase features / V. S. Bilchuk, N. P. Kotzubinskaya, Y. V. Donchenko // J. of Celluar Biochem. - 1990. -14E. - P. 275.
23. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindge beinding // Anal. Biochem. - 197б. - Vol. 72. -P. 248-254.
24. Headley C. L. Factors influencing alanine aminitransferase activity in leaves of Lalium temulenlum /
C. L. Headley, J. L. Standart // Exp. Bonany. - 1972. - Vol. 23. - P. 409-423.
25. Hitoshi M. Some properties of the amine oxidase in Vicia faba seedlings / M. Hitoshi, S. Jonezo // Plant and Cell Physiol. - 1977. - Vol. 118, N 5. - P. 1131-1137.
26. Monteira A. M. Activities of transaminases, anylases and proteases during endosperm degradation on normal and opaque-2 Zea mays L. / C. V. Maya, A. M. Monteira, J. Metivier // Anals of Botany. - Vol. 52. - P. 535-541.
27. Nitrogen metabolism enzymes and serine protease inhibitors of high lysine maize / A. N. Vinnichenko, N. P. Kotzubinskaya, V. S. Bilchuk // Abs. XIX FEBS meeting. - Roma, 1989. - P. 19б.
28. Pilet P. E. The regulation of activity aspartate aminotransferase in senescent root cekkes of lens culigris // Experientia. - 1971. - Vol. 27. - P. 880.
Надійшла до редколегії 11.02.2007
