CC BY
63Physics of the Alive, Vol. 18, No 2, 2010. C.101-105.
© Garmanchuk L. V., Yanish Yu. V., Nepiyvoda H.D., Lavrova K. V., Ostapchenko L.I
IMi.viics oHlic Alhc
n n m.pa.M>ieiMi>-<‘i‘iitcr.nrt
UDC 277.3
INFLUENCE OF EGF AND HERCEPTIN ON THE ELECTROKINETIC PROPERTIES OF MCF-7 CELLS
1Garmanchuk L.V., 2Yanish Yu.V., 1Nepiyvoda H.D., 1Lavrova K.V., 1Ostapchenko L.I.
1ESC “Institute of Biology”, Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, Ukraine 2R. E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology, and Radiobiology, Kyiv, Ukraine
Was accepted 03.02.2010
To investigate the influence of EGF and Herceptin on the electrokinetic potential and surface charge of cancer cells MCF-7. MCF-7 spheroids generation was conducted. After 72 h-incubation with EGF and Herceptin there were measured electrokinetic potential and surface charge density of two sub-populations of MCF-7 cells - spheroids and single cells fractions. Adhesion was determined by staining the cells with crystal violet. It was found that electrokinetic potential in single cells fraction higher than in spheroids. Under the influence of EGF and Herceptin Z-potential and surface charge in MCF-7 cells were reduced, compared with control. In control the surface charge value of cells had single-modal distribution for both cells sub-fractions. But EGF and Herceptin action caused three-modal distribution in spheroids fraction and on the single cells accordingly. Changes in adhesive characteristics of MCF-7 cells under the influence of EGF and Herceptin had opposite direction - increase of adhesive potential in both sub-fractions of cells was shown compared with control.
Key words: MCF-7, multicellular tumor spheroids (MTS), Z-potential, surface charge density, EGF, Herceptin.
INTRODUCTION
In our days investigation of the mechanisms associated with tumor cell migration is regarded as an important area of antitumor therapy, since cancer progression is mediated by the level of metastasis in most cases [1, 2]. It is known that in a high density of cells and deficiency of nutrients in the microenvironment, contact inhibition of cell motility, inhibition of cell proliferation by switching the majority of cells in the proliferative state of calm are characteristic of normal cells [3-5]. At the same time, the strength of intercellular communication between tumor cells is reduced.
This is supported by the high negative charge (Z-potential) of tumor cells, lack of calcium in the intercellular contact, reducing the number of desmosomes, causing the cells acquire typical locomotor phenotype. Metastatic potential of tumor cells correlates with their ability to substrate-independent growth and with low adhesive properties. It is shown that the level of adhesion molecules expression in tumor cells and their mobility degree are in reverse correlation [4, 6, 7].
It is known that one of the fast cell reactions in response to receptor binding with specific ligands is alkalization of intracellular environment by extrusion of H+ ions into the cell and influx of Na+, which are important signaling molecules. Their ion channels are expressed on different types both normal and tumor cells [2, 7]. Activated Na+ channels are involved in a number of cellular functions: proliferation, enzyme activity,
secretion, excitability, intercellular interactions, etc. They
also significantly affect the surface charge of cells caused by binding of endogenous factors. This in turn affects the value of electrokinetic potential (Z-potential) of cells. As a result, linear velocity of cells in electric field at constant pH, ionic strength and temperature of solution dispersion system, is changing.
Earlier, we established and characterized model of multicellular tumor spheroids (MTS), based on MCF-7 cells [8], which explore different aspects of tumor cells in the initial phase of tumor micro-aggregate formation, including survival, proliferation and adhesive properties of cells. According to the literature MCF-7 cells have high oncogenous and invasive potentials and capable of giving malignancies at subinoculation to nude mouse [8, 9].
Breast cancers are accompanied by electrical depolarisation of tumour epithelial cells. Electric-field-enhanced directional migration correlates well with the level of EGF receptor (EGFR/ErbB1) expression [11, 12]. Results of authors group suggest that electric signals might play a role in metastasis of breast cancers by enhancing of cell migration through the ErbB-signalling pathway [5]. EGF activation causes formation of various Erb family members homodymers and heterodymes on tumor cells, that leads to activation of cancer cells proliferation and changes in electrokinetic potential [5, 13]. Therefore, to determine participation of receptors EGFR (ErbB1) and ErbB2 in the cell migration, we conducted both activation of these complexes formation by specific ligand EGF, and blocking by ErbB2 (Her-2-neu) monoclonal antibody - herceptin.
Garmanchuk L.V., Yanish Yu.V., Nepiyvoda H.D., Lavrova K.V., Ostapchenko L.I.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Cell lines. MCF-7 - breast adenocarcinoma cell line, courtesy given by Dr. І. Gut (Ludwig Cancer Institute, London) were used. MCF-7 cells were incubated in DMEM medium (Sigma, USA) supplemented with 10% FBS (Sigma, USA), 2 mM L-glutamine and 40 ^g/ml gentamycin. Cell lines were cultured at the standard conditions at 37оС in humidified atmosphere with 5% CO2 [8]. Native EGF obtained from submandibular mouse glands, as described before [14], Herceptin (Roshe, Franche) were used.
Experiment scheme. MCF-7 spheroids (MTS) generation was conducted as described previously [8]. MTS were cultured at the standard conditions. After ashiveing spheroids concentration 2 million/ml, medium was substituted by serum-free with addition of EGF or Herceptin. MTS were cultured with agents during 72 h.
Electrokinetic potential of MCF-7 cells in electric field was measured using an original device containing special glass capillary with plain walls, allowing to use small volumes of studied cell suspensions and minimizing external influence on electrophoretic mobility of cells at the standard conditions in 0.1 М phosphate buffer at pH 7.15 and 20°С [15], as described previously [7]. The distance between platinum electrodes was 5 cm, and voltage was 100 V. The value of electrokinetic potential (EKP or Z) was counted, according to the equation of M. Smolukhovsky by the formula:
Z-=14*U mV,
where U is electrophoretic mobility expressed in ex-systemic units, as the relation of the linear speed of cell migration v in electric field determined experimentally (^m/s) to the voltage of the field (V/cm). The surface density of the charge was counted via value of Z-potential using equation of Quincke-Helmholtz according to which: Z = qsdc-5/ea,
where qsdc is the surface density of the charge, C/m2; 5 (width of double electric layer (DEL)) is a constant equal to 10-10 m; єа an absolute dielectric permeability that is equal to the product of electric constant, and dielectric permeability of water є0 ■ єН20 at 37 °С.
Adhesion was determined by the percentage of cells attached to the substrate after staining with crystal violet at optical absorption (X=535nm), measured using
multiwell spectrophotometer (Synergy HT, BioTek) [16].
Statistical analysis of the results was performed using descriptive methods, by Student’s t-criterion and by the method of nonlinear regression.
RESULTS AND DISCUSSION
As one may see from Fig.1 electrokinetic potential in light cells fraction, represented by single cells, 1,25 times higher (p<0,05) than in spheroids fraction. While higher values of surface charge density of tumor cells were associated with their capability to metastasis, which coincided with the results of our observations. It was also revealed substantial and statistically significant (p <0.05) decrease in the absolute value of the surface charge density.
20 1 18 -16 -
10 -
a. 8
6 -
4 -
T ■ MTS
□ single cells
Control
EGF
Herceptin Agents
Fig. 1. Influence of EGF (10 ng/ml) and Herceptin (1.5 mkg/ml) on value of electrokinetic potential (Z, mV) in the MTS and single cells sub-fractions of MCF-7 of MCF-7 cells * - p < 0.05 compared to the control.
The value for the surface charge of cells, defined by the Quincke-Helmholtz equation, had single-modal distribution in control for both cells sub-fractions. But it had three-modal distribution in single cells fraction under the influence of EGF and in MTS fraction under the action of Herceptin, respectively (see table 1).
Table 1.
Distribution of cells by surface charge density
14
12
2
0
Surface charge density (q х 10-2C/m2) Intervals of surface charge values
0-5 5-10 >10
Control MTS>50 cells - 9,8 ± 0,41 - - 9,В ± 0,41 (100%) -
single cells -11,04 ± 0,15 - - -11,04 ± 0,15 (100%)
EGF (10 ng/ml) MTS>50 cells -б,31 ± 0,5В* -2,1±0,1 (15%) -б,В5±0,35 (В0%)* -10,2±0,1 (5%)
single cells -7,7 ± 0,б1** - -7,7 ± 0,б1** (100%) -
Herceptin (1.5 mkg/ml) MTS>50 cells -б,14 ± 0,2* - -б,14 ± 0,2* (100%) -
single cells -В,53± 0,В1** 3,72±0,3 (23%) -9,7б±0,07 (б2%) 10,В2±0,42 (15%)
* ** p<0.05 compared to the control: *-MTS-sub-population; **-single cells sub-population.
INFLUENCE OF EGF AND HERCEPTIN ON THE ELECTROKINETIC PROPERTIES OF MCF-7 CELLS
As seen from the data, in the control surface charge for both cells sub-fractions (single cells and MTS) was in the same range for the whole population of moving cells. For MTS surface charge median was - 9,8 ± 0,41, and for single cells it was -11,04 ± 0,15. At the same time using of EGF and herceptin idiotypes, respectively activator and inhibitor of proliferation of cancer cells MCF-7, indirectly through erbB receptor family leads to three-modal distribution of surface charge values. Moreover EGF performed more pronounced effect on MTS fraction cells, whereas Herceptin - on the single cells (see table 1).
Influence of EGF and Herceptin on surface charge of various cells sub-fractions may be caused by action mechanism of these agents. Thus, EGF is mitogen that activates proliferation in MTS-fraction, and Herceptin is specific blokator of EGF-receptor-erbB2 heterodimers [12, 17]
Changes in the surface charge values correlate with the adhesive properties of cells exposed to EGF and Herceptin. While Z-potential and surface charge in control in both cells sub-fractions higher than under the influence of EGF and Herceptin, cells adhesion in control significantly decreased (Fig. 2).
0,7
0,б
0,5
I 0,4 0
4
5
Í1 0,3 0,2 0,1 0
control EGF Herceptin control 1 EGF [
MTS single cells
Herceptin
Fig. 2. Influence of EGF and Herceptin on adhesive potential in the MTS and single cells sub-fractions of MCF-7 cells * - p < 0.05 compared to the control.
So, under the influence of EGF adhesive potential in MTS-subpopulation in 2.85 times higher (p <0,01), compared to the control, and under the influence of Herceptin - in 3,6 times (p <0,01), respectively. Significant increase of cells adhesion to the substrate was observed also under the action of Herceptin in single cells subpopulation. It is confirmed by the results of morphological characteristics. As seen from the following photo, size and form of spheroids were changed under the influence of Herceptin: most of cells are spheroid, having a rounded shape (see fig. 3).
EGF
Herceptin
Fig. 3. Influence of EGF and Herceptin on morphological features of the MTS and single cells sub-fractions of MCF-7 cells
CONCLUSION
Thus, under the influence of EGF and Herceptin values of electrokinetic potential and surface charge in MCF-7 cells were reduced. These parameters are associated with the electrophoretic mobility of tumor cells that causes their invasive and metastatic potential. Influence of EGF on cells mobility is related with its mitogenic activity and stimulation of proliferation. While Herceptin, as blokator of EGF-receptor-erbB2 dimers,
Garmanchuk L.V., Yanish Yu.V., Nepiyvoda ttD., Lavrova K.V., Ostapchenko L.I.
inactivates asynchronous depolarization of tumor cells and thus inhibits their mobility. Three-modal distribution of surface charge in different cells sub-populations under the action of both investigated specific modulators of EGFR signaling suggests involvement of EGFR signaling pathways in the ability of tumor cell to migration and invasion.
References
1. Abbott A. Biology’s new dimension// Nature/-2003.-Vol.424. - P.870-872.
2. Brauner T., Hulser D. F. Tumor cell invasion and gap junctional communication. II. Normal and malignant cells confronted in multicell spheroids.// Invasion Metastasis.-1990.- Vol. 10.- P.31-48.
3. Matsumoto. K., Ziober B., Yao C., Kramer R. Growth factor regulation of integrin-mediated cell motility// Cancer Metastasis Rev.-1995.- Vol. 14.-P.205-217.
4. Lauffenburger D. A., Horwitz A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process.// Cell.-1996.- Vol. 84.-P.359-369.
5. Pu J., McCaig C. D., Cao L., Zhao Z., Segall J. E., Zhao M. EGF receptor signalling is essential for electric-field directed migration of breast cancer cells // J. of Cell Science. - 2007. - Vol. 120, No 19. - P.3395-3403.
6. Mycielska M.E., Djamgoz M.B.A. Cellular mechanisms of direct-current electric field effects: galvanotaxis and metastatic disease // J Cell Science.- 2004.- Vol. 117. -P. 1631-1639.
7. Garmanchuk L.V., Pyaskovskaya O.N., Yanish Yu.V., Shlyakhovenko V.A., Dasyukevich O.I., Solyanik G.I. Influence of aconitine-containing herbal extract BC1 on proliferative and electrokinetic characteristics of endothelial cells// Exp Oncol.- 2005. - Vol.27, No 4.-P.262-266
8. Garmanchouk L.V., Perepelytsina O.M., Sidorenko M.V., Ostapchenko L.I. Growth Kinetics of 2- and 3-D Cell
Models as Influenced by the Microenviroment// Cytology and genetics.- 2009.- Vol.43, No.5. - P 305-309.
9. Mueller-Klieser W. Multicellular spheroids.A review on cellular aggregates in cancer research.// J. Cancer Res. Clin. Oncol. -1987.- Vol.113.- P.101-122.
10. Xu F., Burg K. J. L. Three-dimensional polymeric systems for cancer cell studies// Cytotechnology.- 2007.- Vol.54.-P.135-143.
11. Wang D., Jensen R.H., Williams K.E., Pallavicini M.G. Differential protein expression in MCF7 breast cancer cells transfected with ErbB2, neomycin resistance and luciferase plus yellow fluorescent protein. Proteomics. -2004.- Vol. 4 No7.- P. 2175-2183.
12. Knowlden J.M., Hutcheson I.R., Jones H.E., Madden T., Gee J.M., Harper M.E., Barrow D., Wakeling A.E., Nicholson R.I. Elevated levels of epidermal growth factor receptor/c-erbB2 heterodimers mediate an autocrine growth regulatory pathway in tamoxifen-resistant MCF-7 cells.// Endocrinology. -2003.- Vol.144, No.3.- P.1032-44.
13. Riese D.J., Stern D.F. Specificity within the EGF family/ErbB receptor family signaling network.// Bioessays.- 1998.- Vol.20.- P.41-8.
14. Ivashchenko Yu. D., Gout I. T, Garmanchuk L. V., Osipova L. A. Purification of the epidermal growth factor with used HPLC // Exp. Oncol.-1985.-7, N 3.-P. 46-49.
15. Iensen G.L. Electrophoresis of cells. In: Immunologic methods; Frimel X, ed. Moskow: Mir,. -1979:.- P.195-208 (In Russian).
16. Butakov A.A., Oganezov V.K., Pinegin B.V., Chernousov A.D. Spectrophotometric determination of the adhesive ability of peripheral blood polymorphonuclear leukocytes // Immunology.-1991.-N5.-P.71-72.
17. Garmanchuk L.V., Perepelytsina O.M., Cheshuk V.E., Sydorenko M.V. EGFR expression and dimerization in the breast cancer resected postoperation tissue can be a negative prognostic factor // THE BREAST- 2009. - Vol.18. - P.28.
ВПЛИВ EGF ТА ГЕРЦЕПТИНУ НА ЕЛЕКТРОКІНЕТИЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ MCF-7 КЛІТИН Гарманчук Л.В., Яіііііі Ю.В., Непийвода X-Д., Лаврова К.В., Остапченко ЛЛ.
Досліджено вплив EGF та герцептину на електрокінетичний потенціал та поверхневий заряд ракових клітин MCF-7. Проводили генерування сфероїдів MCF-7. Після 72 год інкубації з EGF і герцептином вимірювали електрокінетичний потенціал та поверхневу щільність заряду двох субпопуляцій клітин MCF-7 - сфероїдів і фракції окремих клітин. Адгезію визначали фарбуванням клітин кристалічним фіолетовим. Встановлено, що електрокінетичний потенціал у фракції окремих клітин вищий, ніж у сфероїдів. Під впливом ЕФР і герцептину Z-потенціал та поверхневий заряд MCF-7 клітин зменшувався, у порівнянні з контролем. У контролі значення поверхневого заряду клітин мали одномодальний розподіл для обох субфракцій. Проте вплив EGF і герцептину спричиняв тримодальний розподіл у фракції сфероїдів та окремих клітин відповідно. Зміни адгезивних характеристик MCF-7 під впливом EGF і герцептину мали протилежний напрям - показано зростання адгезивного потенціалу в обох субфракціях клітин, порівняно з контролем.
Ключевые слова: MCF-7, мультиклітинні пухлинні сфероїди (MTS), Z-потенціал, щільність поверхневого заряду, EGF, герцептин.
INFLUENCE OF EGF AND HERCEPTIN ON THE ELECTROKINETIC PROPERTIES OF MCF-7 CELLS
ВЛИЯНИЕ EGF И ГЕРЦЕПТИНА НА ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ MCF-7 КЛЕТОК Гарманчук Л.В., Яниш Ю.В., Непийвода К.Д., Лаврова Е.В., Остапченко Л.И.
Цель: Исследовать влияние EGF и герцептина на электрокинетический потенциал и поверхностный заряд раковых клеток MCF-7. Материалы и методы: Проводили генерирование сфероидов MCF-7. После 72 ч инкубации с EGF и герцептином измеряли электрокинетический потенциал и поверхностную плотность заряда двух субпопуляций клеток MCF-7 - сфероидов и фракции отдельных клеток. Адгезию определяли окрашиванием клеток кристаллическим фиолетовым. Результаты: Установлено, что электрокинетический потенциал во фракции отдельных клеток выше, чем в сфероидальных. Под влиянием ЭФР и герцептина Z-потенциал и поверхностный заряд MCF-7 клеток уменьшался, по сравнению с контролем. В контроле значение поверхностного заряда клеток имели одномодальное распределение для обеих субфракций. Однако влияние EGF и герцептина вызывало тримодальное распределение во фракции сфероидальных и отдельных клеток соответственно. Изменения адгезивных характеристик MCF-7 под влиянием EGF и герцептина имели противоположную направленность, показан рост адгезивного потенциала в обоих субфракциях клеток по сравнению с контролем.
Key words: MCF-7, мультиклеточные опухолевые сфероиды (MTS), Z-потенциал, плотность поверхностного заряда, EGF, герцептин.
Фізика живого, Т. 18, No 2, 2010. С.106-109.
© Ковальова В.А., Моргаєнко О. О., Степанов Ю.В.
IMiysies oft lie Alive
w и w.pii.s<-k4i«f-<44iU‘r.iM‘t
УДК 577.152.193:616.3
ВМІСТ ЛІПІДІВ ТА ПРОДУКТІВ ЇХ ПЕРОКСИДАЦІЇ В ПЛАЗМІ КРОВІ ЩУРІВ ЗА УМОВ СТРЕС-ІНДУКОВАНИХ ВИРАЗКОВИХ УРАЖЕНЬ ШЛУНКА
Ковальова В.А., Моргаєнко О.О., Степанов Ю.В.
ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка
e-mail: [email protected]
Надійшла до редакції 15.03.2010
Робота присвячена визначенню вмісту ліпідів у крові щурів за умов експериментального виразкоутворення. Виявлено збільшення вмісту триацилгліцеролів (ТАГ), жирних кислот (ЖК), у той час як рівень холестеролу лишався незмінний. Встановлено зростання вмісту продуктів пероксидації ліпідів: дієнових кон’югатів та шифових основ у 3 і 3,5 раза відповідно, рівня малонового діальдегіду (МДА) (спонтанного накопичення у 2,6 раза, ферментативного - в 2,1 раза, а неферментативного - в 1,9 раза, відносно контролю) у плазмі крові щурів за умов стресової моделі виразки. Виявлено зниження активності каталази у 2,9 раза. Отримані дані можуть мати практичне застосування у медицині для діагностики і прогнозу розвитку даної патології.
Ключові слова: стрес, виразка шлунка, плазма крові, ліпіди; стресс, язва желудка, плазма крови, липиды; stress, stomach ulcer, blood, lipids.
ВСТУП
Більше 170 років минуло з часу виділення виразкової хвороби в самостійну нозологічну форму, а суперечки про етіологію та патогенез цього захворювання не стихають і досі. Щорічно у нашій країні під диспансерним наглядом перебуває близько 1 млн людей з виразковим захворюванням, частота щорічних рецидивів складає 60 - 82%, а число ускладнень (у тому числі і смертельних) коливається у межах 26 - 42 % [1]. У зв’язку з цим виразкову хворобу відносять до важливих медико-соціальних проблем сучасної медицини.
Перенапруження нервової системи внаслідок дії різноманітних стресорних факторів є однією з найважливіших рис життя людини у сучасному суспільстві. Це створює підгрунтя для
виразкоутворення в осіб, що займаються напруженою інтелектуальною діяльністю, у випадках аварійних ситуацій і т. п. За умов дії стресу активуються всі системи організму, необхідні для подолання руйнівних ефектів стресового чинника. Першим етапом стрес-реакції є активація симпатичної та парасимпатичної нервової системи, це має важливе фізіологічне значення для підвищення функціональних можливостей організму та для запуску відновлювальних процесів, спрямованих на збереження гомеостазу. На другому етапі стрес-реакція реалізується за схемою: дорсомедіальна
частина мигдалевидного ядра - ерготропні ядра гіпоталамусу - грудний відділ спинного мозку -мозковий шар наднирників. Включення до стрес-реакції останньої зазначеної ланки призводить до посиленої секреції адреналіну та норадреналіну.
Одним з наслідків цього є зростання вмісту вільних жирних кислот (в результаті активації ліполізу), рівня тригліцеридів, холестеролу, що надходять у кров. Таким чином, відбувається мобілізація організму. Однак якщо стресорний чинник продовжує
здійснювати ушкоджуючу дію, яка недостатньо компенсується симпато-адреналовою реакцією, яка включає перші два етапи стрес-реакції, настає третій етап, що полягає в активації інших ендокринних механізмів: адренокортикального, соматотропного і тиреоїдного. Вагомим наслідком цього також є активація ліполізу і зростання вмісту вільних жирних кислот у крові [2].
Виходячи із зазначених даних видно, що ліпідний склад крові є важливим біохімічним показником, на основі якого можна характеризувати функціональний стан організму, його окремих систем, а також прогнозувати розвиток патологій, у тому числі стрес-індукованих; при цьому важливо визначити характер змін різних класів ліпідів, що дозволить охарактеризувати шляхи, залучені у передачу сигналу за умов дії стресу на різних ланках та рівнях організму, та з урахуванням якого можлива оптимізація лікувальних заходів.
Метою роботи було визначити вміст нейтральних ліпідів, продуктів пероксидації ліпідів (ПОЛ), активність антиоксидантного ферменту каталази в плазмі крові щурів за умов експериментальної стресової моделі виразки.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
У дослідах використовували білих нелінійних щурів масою 180 - 200 г, яких утримували на
стандартному раціоні віварію. Для моделювання виразки шлунка у тварин, що є наближеною за етіологією та патогенезом до виразки шлунка людини, використовували модифіковану методику “імобілізаційного стресу” [3]. Для цього щурів розміщували у металевих перфорованих патронах зі скляним вікном у донній частині, де було розміщено голову тварини. Патрони розташовували у колонії вільноживучих щурів. Через 24 години щурів виймали з патронів та декапітували. Забір крові проводили при декапітації тварин у пробірки, що містили гепарин. Плазму одержували
центрифугуванням при 3000 § протягом 15 хв. Нейтральні ліпіди фракціонували методом тонкошарової хроматографії на пластинках “БогЬШ” (Росія) в системі розчинників гептан/діетиловий ефір/льодяна оцтова кислота (90:10:1) [4]. Пластинки проявляли за допомогою сірчаної кислоти. В одержаних фракціях ідентифікували холестерол, ТАГ та неетерифіковані ЖК. Інтенсивність
вільнорадикального окиснення оцінювали за накопиченням продуктів ліпідної пероксидації. Вміст дієнових кон’югатів визначали в гептан-
ізопропанольному екстракті спектрофотометричним методом, шифових основ - флюорометричним
методом [5]. Вміст МДА визначали за реакцією з
тіобарбітуровою кислотою [6]. Активність каталази в плазмі крові щурів визначали спектрофотометричним методом [5].
Вміст білка визначали за методом Лоурі. Статистичну обробку результатів та побудову графіків проводили на ІВМ РС ЕТ з використанням стандартних пакетів прикладних програм.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Ліпіди - один з найважливіших класів складних молекул, присутніх в організмі. Ліпіди виконують найрізноманітніші функції. Вони входять до складу клітинних мембран, слугують попередниками стероїдних гормонів, жовчних кислот,
простагландинів і фосфоінозитидів. У крові містяться окремі компоненти ліпідів (насичені жирні кислоти, моноєнові і полієнові ненасичені жирні кислоти), тригліцериди, холестерол, ефіри холестеролу та фосфоліпіди. Всі ці речовини не розчиняються у воді, тому в організмі функціонує складна система транспорту ліпідів. Вільні (неетерифіковані) жирні кислоти переносяться кровотоком у вигляді комплексів з альбуміном. Тригліцериди, холестерол, його ефіри, а також фосфоліпіди транспортуються у формі водорозчинних ліпопротеїнів [7].
Таблиця 1.
Вміст нейтральних ліпідів плазми крові щурів за умов стресової виразки (М±м; п=10)
Групи тварин Холестерол, мкг/мг білка Триацилгліцерол, мкг/мг білка Жирні кислоти, % відносно контролю
Контроль 14,8±1,2 1,7±0,2 100
Виразка 13,8±0,4 4,6±0,3* 149,9*
* - р<0,05 різниці достовірні по відношенню до контролю
Таблиця 2.
Вміст продуктів пероксидації ліпідів та активність каталази в плазмі крові щурів за умов стресової
Групи тварин Дієнові кон’югати, нмоль/мг білка Шифові основи, ум. од./мг білка Каталаза, нмоль Н2О2/мг білка*хв.
контроль 11,1±1,0 1,0±0,1 19,4±1,8
виразка 33,5±3,2* 3,5±0,2* 6,7±0,6*
* - р<0,05 різниці достовірні по відношенню до контролю
Таблиця 3.
_________________Вміст МДА у плазмі крові щурів за умов стресової виразки (М±м; п=10)_________________________
Групи тварин Спонтанне накопичення МДА, нмоль/мг білка т-1 2+ ге аск. накопичення МДА, нмоль/мг білка АДФ+НАДН+ накопичення МДА, нмоль/мг білка
контроль 13,8±1,0 23,7±2,3 53,8±5,3
виразка 35,8±3,2* 44,4±4,0* 113,4±10,1*
* - р<0,05 різниці достовірні по відношенню до контролю
За будь-яких стресових станах (напруженнях) відбувається накопичення ліпідів у крові , при цьому накопичуються жирні кислоти, які інтенсивно починають виходити з підшкірно-жирової клітковини. Одночасно збільшується і рівень глюкози у крові. Вміст глюкози за будь-якого емоційного, психічного, фізичного збудження утворюється з глікогену
печінки, замість глікогену до печінки поступають жирні кислоти, хіломікрони. При довготривалому стресовому стані у кров інтенсивно виділяються гормони, зокрема адреналін, норадреналін. Вони не лише сприяють розщепленню жиру в підшкірно-жировій клітковині та збільшенню вмісту жирних кислот у крові, але і обумовлюють формування
Ковальова В.А., Моргаєнко О.О., Степанов Ю.В.
атеросклеротичних бляшок в результаті надмірного надходження у судини холестеролу, тригліцеридів, жирних кислот [8].
В результаті проведених нами досліджень ліпідного складу крові щурів за умов стрес-
індукованих виразкових уражень шлунка було встановлено підвищення вмісту ТАГ на 171% і ЖК на 50%, у той час як вміст холестеролу не змінюється достовірно по відношенню до контролю (табл. 1). У літературних джерелах наведено дані про зростання вмісту холестеролу за умов різних стрес-індукованих патологій на 7-14 добу після дії стресового чинника [9]. У нашому досліді ми проводили визначення вмісту ліпідів на першу добу після виразкоутворення, коли холестерол ще не потрапляє у кров. Порушення ліпідного обміну супроводжується процесами активації ПОЛ, гіперпероксидації, які негативно впливають на активність енергетичного забезпечення мембрано-клітинних структур. Перекисне окиснення ліпідів - це ланцюгові реакції, що забезпечують розширене відтворення вільних радикалів, частинок, що мають неспарений електрон, які ініціюють подальше розповсюдження перекисного окиснення. У клітині присутня розвинена система захисту від перекисного окиснення (антиоксидантна система), яка включає ферменти, які нейтралізують пероксиди та вільні радикали (каталаза, глутатіонредуктаза) і молекули «пастки» вільних радикалів та активних іонів (мембранна система вітаміну Е і селену, глутатіон, аскорбінова кислота). Найбільш розвинена антиоксидантна система у клітинах, що більше піддаються окисненню, де вищий парціальний тиск кисню, наприклад, еритроцити, лейкоцити, епітеліальні клітини. При недостатній спроможності антиоксидантної системи перекисне ушкодження ліпідів призводить до враження мембранних структур клітини, що порушує функціонування клітини і є основним механізмом її загибелі [9].
В результаті проведених досліджень було виявлено активацію процесів ПОЛ за умов стресової моделі виразки шлунка. На це вказувало значне зростання у плазмі крові щурів вмісту первинних продуктів ПОЛ - дієнових кон’югатів у 3 рази та кінцевих продуктів ПОЛ - шифових основ у 3,5 раза в порівнянні з контролем (табл. 2). Було показано також підвищення вмісту вторинних продуктів ПОЛ ТБК-активних сполук, яке проходить ферментативним та не ферментативним шляхом (табл. 3). Спонтанне накопичення МДА у плазмі крові щурів за умов виразки зросло у 2,6 раза у порівнянні з контролем. Дослідження індукованої пероксидації ліпідів показало, що за умов стресової моделі виразки переважає ферментативний шлях активації процесів ПОЛ: рівень ТБК-активних продуктів у плазмі крові зріс в 2,1 раза відносно контролю, а при неферментативному - в 1,9 раза.
Дослідження активності каталази у плазмі крові щурів за умов стресової виразки виявили її зниження в 2,9 раза у порівнянні з контролем (табл. 3).
Отримані результати свідчать, що за умов стресової моделі виразки спостерігаються порушення ліпопероксидного гомеостазу, при цьому має місце зниження показників антиоксидантної системи у плазмі крові щурів.
Таким чином, дія ульцерогенних чинників має відображення і на рівні універсальної інтегральної системі організму - крові, склад якої віддзеркалює патологічні події організму в цілому. Показники ліпідного складу крові можуть бути використані як маркери виразкового захворювання та застосовуватися у діагностичних цілях. Отримані дані вказують на доцільність дослідження в подальшому інших складових крові (білків, фосфоліпідів, окремих ЖК, показників енергетичного обміну), що дозволить з’ясувати механізми ульцерогенезу та розробити нові терапевтичні підходи в експериментальній та клінічній медицині.
ВЫВОДЫ
Для стрес-індукованих виразкових уражень шлунка характерним є підвищення вмісту ТАГ, ЖК, продуктів ПОЛ та зниження активності каталази в плазмі крові щурів. Показники ліпідного обміну плазми крові є важливими характеристиками функціонального стану метаболічних систем організму, а визначення їх якісного та кількісного складу може бути використано як діагностичний маркер та прогностичний показник при різних патологічних станах, у тому числі при виразковому захворюванні.
Литература
1. Мягкова Л.П. Некоторые показатели перекисного окисления липидов фазы язвенной болезни //Рос. Журнал гастроэнт., гепатол., колопрокт. - 1996. - Т.6., №1.-С.109-110.
2. В. А. Барабой. Стресс: природа, биологическая роль, механизмы, исходы. - Киев: Фитосоциоцентр, 2006. - 424 с.
3. Гройсман С.Д., Каревина Т.Г. О влиянии атропина на стрессорные поражения слизистой оболочки желудка у крыс // Библ. указ. ВИНИТИ. Деп. рукопись №. 452/79 -1979. - № 12. - С. 131.
4. Kates M. Techniques of lipidology. Isolation, analisis and identification of lipids. - Amsterdam, Elsevier, 1986. - 464 p.
5. Орехович В.И. Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - з71 с.
6. Гаврилов В.П., Гаврилова А.Р., Майорова И.Г. Методика определения малонового диальдегида в сыворотке крови // Вопр.мед.химии.- 1987.-№1-С.118-122.
7. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи соврем. биологии. - 1993. - Т.113, №4. - С.442-455.
8. Бурлакова Е.Б. Роль эндогенных тиолов и антиокислительной активности липидов в определении резистентности организма // Пробл. природной и модифицированной радиочувствительности. - М.: Наука, 1993. - С.21-28.
9. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление
липидов в биологических мембранах. - М.: Наука,
1992. - 252 с.
СОДЕРЖАНИЕ ЛИПИДОВ И ПРОДУКТОВ ИХ ПЕРОКСИДАЦИИ В ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС ПРИ СТЕСС-ИНДУЦИРОВАННЫХ ЯЗВЕННЫХ ПОРАЖЕНИЯХ ЖЕЛУДКА
Ковалева В.А., Моргаенко А.А., Степанов Ю.В.
Работа посвящена определению содержания различных классов липидов в крови крыс при экспериментально вызванном язвообразовании. Показано увеличение содержания ТАГ, ЖК, в то время как изменения уровня холестерола не наблюдалось. Установлено увеличение содержания продуктов пероксидации липидов: диеновых конъюгатов и шиффовых оснований в 3,5 раза, уровня МДА (спонтанного накопления в 2,6 раза, ферментативного - в 2,1 раза, а неферментативного -в 1,9 раза, в сравнении с контролем) в плазме крови крыс при стресс-индуцируемойо язве. Обнаружено снижение каталазной активности в 2,9 раза. Предполагается, что липиды крови могут обуславливать структурно-функциональные изменения различных органов в результате воздействия на клеточные мембраны. Полученные данные могут иметь практическое применение в медицине для диагностики и прогнозирования развития патологий.
Ключевые слова: стресс, язва желудка, плазма крови, липиды
THE CONTENT OF LIPIDS AND PRODUCTS OF THEIR PEROXIDATION IN RATS BLOOD PLASMA UNDER STRESS-INDUCED ULCERATION
Kovalyova V.A., Morgaienko O.O., Stepanov Y. V.
The article is devoted to investigation of different types of lipids in rat blood under experimental ulceration. In our experiments, the increasing of triglycerides and fatty acids levels was observed; meanwhile the content of cholesterol was invariable. Also the level of lipid peroxidation products was established to increase - diene conjugates and Schiff bases in 3 and 3,5 times, respectively, MDA -(spontaneous accumulation in 2,6, enzymatic - in 2,1, non-enzymatic - in 1,9 times in compare with control value) in rat blood plasma under stress modal of ulceration. In addition, catalase activity was observed to decrease in 2,9 times. We suggested the possibility of blood lipids to effect on structural-functional properties of different organs through the influence on cell membranes. Data obtained can be used in medicine for diagnostics and pathogenesis prediction.
Key words: stress, ulceration, lipid, blood____________________________________________________________________
