CC BY
10
DOI 10.31588/2413-4201-1883-239-3-95-99
УДК 616.99+619:616.99
ИНФИЦИРОВАНОСТЬ СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА У СВИНЕЙ БАКТЕРИЯМИ
РОДА HELICOBACTER
Госманов Р.Г. - д.в.н., профессор, "Поздеев О.К. - д.м.н., профессор, Нургалиев Ф.М. - к.в.н., доцент, Морозова Л.Г. - к.б.н., доцент
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» "Казанская государственная медицинская академия - филиал ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Министерства здравоохранения РФ
Ключевые слова: helicobacter suis, уреазная проба, свиньи, лабораторная диагностика Keywords: helicobacter suis, urease test, pigs, laboratory diagnostics
Сообщения об обнаружении спиралевидных бактерий в слизистой известны ещё с конца XIX в. В частности, G. Bizzozero (1893) выявил спиралевидные бактерии в париетальных клетках желудка собак, а H. Salomon (1896) установил, что эти бактерии могут передаваться от зараженных мышей кошкам и собакам. Так же следует вспомнить исследования W. Kreinitz (1905), J.L. Doenges (1938), A.S. Freedberg и L.E. Barron (1940), E.D. Palmer (1954) и др., указывающих на данный микроорганизм в своих работах. Более того, Walery Jaworski из Ягеллонского Университета (Краков) в 1899 году не только обнаружил эти бактерии в желудке человека, но и сделал обоснованное предположение об их роли в развитии гастритов [3, 6, 12].
Однако эти открытия игнорировались в течение многих лет, пока Robert Penn Warren и Barry James Marshall (1983) не открыли Campylobacter pylori (ныне Helicobacter pylori) и доказали его этиологическую значимость в развитии гастритов, опираясь на постулаты Коха. В настоящее время эту бактерия считают наиболее распространенным этиологическим агентом антрального гастрита человека и важным фактором в патогенезе рецидивов язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки [4]. Позднее было установлено, что бактерии рода Helicobacter довольно широко распространены у различных животных, а сам H. pylori может встречаться как у человека, так и у животных [3].
Впервые хеликобактеры, отличные от H. pylori, у свиней подробно описали и
охарактеризовали E.N. Mendes с соавт. (1990) и назвали его Gastrospirillum suis. В 1995 году D.M.M. Queiroz и др., рекласси-фицировали выделенную от свиней бактерию как Helicobacter heilmannii. В 1999 D. De Groote переименовал её Candidatus H. suis [12]. К сожалению, все попытки культивировать микроорганизм на питательных средах были безуспешными [6, 8, 10, 13]. После секвенирования гена 16S pPHK изолятов, было чётко установлено, что они принадлежат к роду Helicobacter. Последовательности генов 16S pPHK показали 99,7% гомологию, что указывает на то, что выделенные ранее микроорганизмы составляли один таксон и считаются идентичными [12]. В настоящее время чётко установлено, что распространенность H. suis среди свиней сильно различается в разных экспериментах, варьируя от 8,0 до 95,0 %. Тем не менее, большинство исследований указывает о высокой распространенности носительства (60% и более) [6, 7, 9, 10, 12]. Необходимо отметить, что H. suis остается трудно культивируемым микроорганизмом in vitro, что очень сильно затрудняет его лабораторную диагностику и постановку диагноза и до настоящего времени, в России подобных исследований не проводили. С этой целью нами было предпринято изучение распространенности H. suis и характера морфологических изменений слизистой оболочки желудка свиней в Республике Марий Эл.
Материал и методы исследований. Образцы слизистой были получены при плановом забое на убойном пункте в
Республике Марий Эл (20 голов свиней). Желудки вскрывали продольно вдоль большой кривизны, содержимое удаляли, поверхность слизистой оболочки аккуратно промывали стерильным физиологическим раствором. Состояние слизистой оболочки оценивали по методике предложенной J.J.C. Hessing (0 до 5), где 0 соответствует неповрежденной слизистой оболочке; 1 - указывает на умеренный гиперкератоз, охватывающий менее 50% поверхности; 2 - соответствует тяжелому гиперкератозу с охватом более 50% поверхности; 3 - показывает на наличие гиперкератоза и несколько небольших эрозий (менее 5, площадью 2,5 см ); 4 - указывает на гиперкератоз и обширные эрозии (более 5 и / или более 2,5 см ); 5 - соответствует гиперкератозу и наличию очень больших эрозии (более 10 эрозий или более 5 см ) и / или язвы [11]. Затем готовили мазки-отпечатки слизистой фундального и ан-трального отделов желудка для первичной микроскопии. Для дальнейшей работы в условиях лаборатории от каждого желудка с соблюдением правил асептики отбирали по три образца слизистой антрального отдела желудка. Полученный материал помещали в пробирки с транспортной средой (тиогликолевой). Его транспортировку осуществляли в течение 2-3 часов в термосумке с хладоэлементом.
В лаборатории проводили посев на селективную питательную среду (5% кровяной агар, ванкомицин 5 мг, триметоприм 25 мг, амфотерицин В 2,5 мг). Все три фрагмента желудка помещали на одну
Рисунок 1 - Язва желудка свиньи
чашку Петри и тщательно растирали их по поверхности питательной среды стерильным шпателем. После проведения посева остатки образцов слизистой снимали с чашки бактериологической петлей и каждый из фрагментов помещали в отдельную пробирку с тестом на уреазную активность. Чашки Петри с посевами помещали в анаэростат, создавая микроаэрофильные и капнофильные условия. Инкубирование проводили 5 суток при 37о С. После инкубирования проводили визуальную оценку роста колоний. Подозрительных колоний (мелкие, круглые, блестящие, гладкие, прозрачные, «росинчатые» колонии диаметром 1 -3 мм) подвергали исследованию в биохимических тестах, микроскопиро-вали, оценивали подвижность методом раздавленной капли для подтверждения принадлежности к хеликобактерам.
Результаты исследований. После забоя свиней производили вскрытие желудков, удаляли содержимое и оценивали состояние слизистой оболочки. При визуальном осмотре желудков свиней отмечали наличие или отсутствие пораженных участков слизистой оболочки в фундальной и антральной областях желудка. Только в одном случае были обнаружены эрозии в пилорической части желудка. Оценивая состояние слизистой оболочки желудков по J.J.C. Hessing были получены следующие результаты: 0 - 2 (10%); 1 - 4 (20%); 2 - 6 (30%); 3 - 4 (20%); 4 - 3 (15%); 5 - 1 (5%) образцов слизистой желудка свиней (Рис.1).
Рисунок 2 - Мазок отпечаток слизистой оболочки желудка синьи. 1 - Извитые формы бактерий
Уреазную активность выявляли используя С1о-1еБ1. Образец биоматериала из транспортной среды помещали в пробирку с реагентами. Все пробирки (опытные и контрольную) инкубировали при 37о С. Учет результатов С1о-теста производили через 1 час, 3 часа и 24 часа. В 17 пробах зарегистрировали положительный результат, наблюдали изменение желтой окраски среды на малиново-красный.
При микроскопии изготовленных мазков-отпечатков слизистой фундального и антрального отделов желудка на фоне окрашенной слизи обнаруживали более интенсивно окрашенные изогнутые и спиралевидные грамотрицательные палочки, диаметром от 0,2 до 0,8 мкм и длиною от 2 до 5 мкм (Рис. 2). Характерные микроорганизмы этим методом были обнаружены в 8 образцах слизистой оболочки из 20 желудков свиней. Все эти образцы были получены из желудков с патологоанатомиче-скими изменениями соотнесенных к группам 2, 3, 4 и 5. В материале от свиней с неповрежденной слизистой оболочкой желудка и умеренным гиперкератозом хели-кобактерии микроскопическим методом не
Заключение. В литературе указывается, что причинами патологии в желудке у свиней (гастриты, эрозии, язвы) являются нарушения в кормлении, содержании и эксплуатации животных. Например, отравления вызванные микотоксинами, растительными или другими ядами, загрязнение инородными предметами, неправиль-
обнаружили. На селективной питательной среде из 20 проб на 10 чашках Петри к 5 дню выросли мелкие, диаметром 0,5 мм, круглые, выпуклые, прозрачные, влажные колонии. Данный рост колоний характерен для хеликобактерий. В мазках из колоний, при окраске по Граму обнаруживали извитые формы в виде C и S, а так же кокко-видные клетки. Извитые формы в препарате «раздавленная капля» были подвижны. Оценивали уреазную активность выросших культур.
Обобщенные результаты макроскопических, биохимических, микроскопических и культуральных исследований представлены в таблице 1.
Как видно из представленных данных таблицы индикация бактерии рода Helicobacter в слизистой оболочке желудков свиней разными методами дает схожие результаты и частично совпадает с макроскопической картиной. Наиболее чувствительным методом исследования явился уреазный тест (85%), менее чувствительными методами оказались выделение на питательной среде (50%) и микроскопический метод (40%).
ная подготовка кормов (горячие или очень холодные), влияние стрессовых факторов, генетическая предрасположенность отдельных пород [1,5]. С другой стороны ряд авторов указывает, что патологии в желудке у свиней (гастриты, эрозии, язвы) связаны с присутствием в желудке хелико-бактерий H. suis, H. pylori и др. [6, 7, 11,
Таблица 1 - Обнаружение и выделение бактерий рода Helicobacter в слизистой оболочке желудков свиней._
Оценка состояния слизистой оболочки по Hessing J.J.C. Количество желудков с патологией отнесенных в группу согласно оценке Уреазный тест Количество проб, в которых обнаружены извитые формы бактерий под микроскопом Количество проб, в которых выделены хеликобактерии на питательной среде
+ - + - + -
0 2 0 2 0 2 0 2
1 4 4 0 0 4 1 3
2 6 5 1 2 4 3 1
3 4 4 0 3 1 3 3
4 3 3 0 2 1 2 1
5 1 1 0 1 0 1 0
Итого (%) 20 17 (85) 3 (15) 8 (40) 12 (60) 10 (50) 10 (50)
Примечание: + положительно; - отрицательно.
12]. В других исследованиях, связь между хеликобактерной инфекцией и наличием язвенной болезни у животных выяснить до конца не удается, что требует дополнительных исследований [1, 2].
Результаты нашей работы показали, что в отобранных образцах из желудков свиней с патоморфологическими признаками гастрита и язвами обнаружены микроскопическими, культуральными и биохимическими методами характерные бактерии для рода Helicobacter. Во всех случаях материал был взят из участков с видимыми патологиями на слизистой оболочке желудков, что косвенно подтверждает этиологическую роль бактерии рода Helicobacter в этих заболеваниях.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бабкина, Т.Н. Язвенная болезнь в историческом аспекте / Т.Н. Бабкина, А.В. Козлова // Матер. междун. науч.-практич. конф.: «Актуальные проблемы и методические подходы к диагностике и лечению профилактике болезней животных» -ФГБОУ ВО «Донской государственный аграрный университет». - 2018. - С. 6-11.
2. Госманов, Р.Г. Комплексная лабораторная диагностика хеликобактериоза у свиней / Р.Г. Госманов, Ф.М. Нургалиев, Р.М. Нургалиев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -2013. - Т. 215. - С. 77-81.
3. Иванов, А.В. Хеликобактеры животных и их значение в патологии человека / А.В. Иванов, ОК. Поздеев, Ю.В. Ва-леева // Ветеринарный врач - 2010. - № 6. - С. 17-21.
4. Маев, И.В. Инфекция Helicobacter pylori: монография / И.В. Маев, А.А. Самсонов, Д.Н. Андреев. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 256 с.
5. Щербакова, Г.Г. Внутренние болезни животных [Электронный ресурс] : учебник / под общ.ред. Г.Г. Щербакова, А.В. Яшина, А.П. Курденко, К.Х. Мурза-
гулова. - Санкт-Петербург : Лань, 2014. -720 с.; URL: http://e. lanbook.com/ book/52621 (дата обращения: 12.01.2019)
6. Baele, M. Isolation and characterization of Helicobacter suis sp. nov. from pig stomachs / M. Baele // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. -2008. - 58. - Р. 1350-1358.
7. Chloë De Witte. In-feed bambermycin medication induces anti-inflammatory effects and prevents parietal cell loss without influencing Helicobacter suis colonization in the stomach of mice / Chloë De Witte et al. // Vet Res. - 2018. - 49:35 - 16p.; URL: https://doi.org/10.1186/s13567-018-0530-1 (дата обращения: 12.03.2019)
8. Dulciene, M.M. A spiral microorganism in the stomach of pigs / M.M. Dulciene et al. // Veterinary Microbiology. - 1990. - Р. 199-204.
9. Dulciene, M.M. Association Between Helicobacter and Gastric Ulcer Disease of the Pars Esophagea in Swine / M.M. Dulciene. et al. // Gastroenterology. - 1996. - Р. 19-27.
10. Grasso, G.M. Prevalence of helicobac-ter-like organisms in porcine gastric mucosa: a study of swine slaughtered in Italy / G.M. Grasso et al. // Comp. Immun. MicrobioL infect. - 1996 -Vol. 19. - No. 3. Р. 213-217.
11. Hessing, J.J. Changes in the mucous membrane of the pars oesophageal part of the stomach - prevalence and relations to stress / J.J. Hessing et al. // Tijdschr. Diergeneeskd. -1992. - 117. - Р. 445-450.
12. Jong-Hwan, Park The high prevalence of Helicobacter sp. in porcine pyloric mucosa and its histopathological and molecular characteristics / Park Jong-Hwan, et al. // Veterinary Microbiology. - 2004. - Р. 219-225.
13. Park, J.-H. Experimental Infection of Mice with Tightly Coiled Spiral Bacteria ("Candidatus Helicobacter suis") Originating from the Pig Stomach / J.-H. Park et al. // J. Comp. Path. - 2003. - Vol. 129. - Р. 154160.
ИНФИЦИРОВАНОСТЬ СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА У СВИНЕЙ БАКТЕРИЯМИ РОДА HELICOBACTER
Госманов Р.Г., Поздеев О.К., Нургалиев Ф.М., Морозова Л.Г.
Резюме
Результаты данного исследований показали, что в отобранных образцах из желудков свиней с патоморфологическими признаками гастрита и язвами обнаружены микроскопическими, культуральными и биохимическими методами бактерии рода Helicobacter. Уреазную активность выявляли используя Clo-test, в 85% пробах зарегистрировали положительный результат. Микроскопическим методом были обнаружены хеликобактерии в 40% образцах слизистой оболочки желудков свиней. На селективной питательной среде в микроаэрофиль-ных условиях при +37 оС в 50% наблюдали рост колоний хеликобактерий. Как видно из полученных результатов, индикация бактерии рода Helicobacter в слизистой оболочке желудков свиней разными методами дала схожие результаты и частично совпадала с макроскопической картиной. Наиболее чувствительным методом исследования явился уреазный тест, менее чувствительными методами оказались выделение на питательной среде и микроскопический метод. Во всех случаях материал был взят из участков с видимыми патологиями на слизистой оболочке желудков, что косвенно подтверждает этиологическую роль бактерии рода Helicobacter в этих заболеваниях.
BACTERIA OF THE GENUS HELICOBACTER INFECTIVITY OF THE GASTRIC MUCOSA IN PIGS
Gosmanov R.G., Pozdeev O.K., Nurgaliyev F.M., Morozova L.G.
Summary
The results of this study showed that bacteria specific to the genus Helicobacter were found in the samples from the pigs' stomachs with pathomorphological signs of gastritis and ulcers with the help of microscopic, cultural and biochemical methods. Urease activity was detected using Clo-test, and a positive result was registered in 85% of the samples. Helicobacteria were discovered in 40% of samples of the mucous membrane of the pigs' stomachs by microscopic method. The growth of Helicobacter pylori colonies on selective nutrient medium under microaerophilic conditions at +37 °C was observed in 50%. From the obtained results seen the Helicobacter bacterium indication in the mucous membrane of pigs' stomachs by different methods gave similar results and partially coincided with the macroscopic picture.The most sensitive method of investigation was urease test, less sensitive methods were isolation on the nutrient medium and microscopic method. In all cases, the material was taken from areas with visible pathologies on the gastric mucosa, that indirectly confirms the etiological role of the Helicobacter genus bacterium in these diseases.
