CC BY
12
УДК 616.921.5:616.9-092.9
А.А.Сергеев, О.В.Пьянков, О.К.Демина, О.Г.Пьянкова, Е.И.Рябчикова, А.П.Агафонов, А.Н.Сергеев ИнфЕкцИонныЕ свойства штАммов вируса гриппа птИц A/H5N1
в экспериментах на мышах
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово
Исследованные штаммы вируса гриппа птиц A/H5N1 (ВГП), выделенные на территории России и стран СНГ, по вирулентности для мышей при интраназальном и аэрозольном заражении могут быть разделены на 3 группы: высоковирулентные [50 % аэрогенная летальная доза (АЛД50) - <3,0 lg 50 % эмбриональных инфицирующих доз, (ЭИД50)] - A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Chicken/Crimea/04/2005, A/Chicken/0msk/06, A/Chicken/Krasnodar/02/06, A/Chicken/Dagestan/06; средней степени вирулентности [ЛД50 (АЛД50) - 3,0-4,5 lg ЭИД50] - A/Duck/Kurgan/08/2005; авирулентные [ЛД50 (АЛД50) - >4,5 lg ЭИД50] - A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005. Отмечена высокая степень корреляции (г = 0,89) между показателями вирулентности штаммов, полученными при интраназальном и аэрозольном инфицировании мышей. Первичными клетками-мишенями у мышей, респиратор-но инфицированных ВГП, является реснитчатые клетки воздухоносных путей и пневмоциты 1 и 2-го порядка.
Ключевые слова: вирус гриппа птиц A/H5N1, мышь, интраназальное заражение, аэрозольное инфицирование, 50 % летальная доза, респираторный тракт, клетка-мишень вируса.
A.A.Sergeev, O.V.P'yankov, O.K.Demina, O.G.P'yankova, E.I.Ryabchikova, A.P.Agafonov, A.N.Sergeev
Infectious Properties of Avian Influenza A/H5N1 Virus Strains Studied by means of Experiments on Mice
State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector", Koltsovo
The studied strains of avian influenza virus A/H5N1 (AIV), isolated in the territory of the Russian Federation and CIS countries, can be classified into three groups according to their virulence for mice after intranasal and aerosol challenging: highly virulent strains [50 % aerosol lethal dose (ALD50) - <3,0 lg 50 % embryonic infection doses (EID50)] - A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Chicken/ Crimea/04/2005, A/Chicken/0msk/06, A/Chicken/Krasnodar/02/06, A/Chicken/Dagestan/06; strains with mid-level virulence [LD50 (ALD50) - 3,0-4,5 lg EID50] - A/Duck/Kurgan/08/2005; and non-virulent strains [LD50 (ALD50) - >4,5 lg EID50] - A/Turkey/Suzdalka/ Nov-1/2005 and A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005. Registered is the high degree of correlation (r = 0,89 ) between the indexes of virulence of the strains, obtained by means of intranasal and aerosol challenging of mice. The primary target-cells in mice, respiratory-infected by AIV, are the respiratory tract ciliated cells and pneumonocytes of I, II types.
Key words: Avian Influenza Virus A/H5N1, mouse, intranasal challenging, aerosol challenging, 50 % lethal dose, respiratory tract, target-cell for virus.
К июню 2011 г. общее количество подтвержден- вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ
ных случаев заболевания человека, вызванного виру- «Вектор» Роспотребнадзора: A/Turkey/Suzdalka/Nov-
сом гриппа птиц (ВГП) A/H5N1, составляло 556, при 1/2005; A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005; A/Chicken/
этом примерно 60 % заболевших погибли [13]. По Kurgan/05/2005(H5N1); A/Duck/Kurgan/08/2005(H5N1);
данным Всемирной организации охраны здоровья A/Chicken/Crimea/04/2005(H5N1); A/Chicken/0msk/06
животных, птичий грипп H5N1 стал эндемическим (H5N1); A/Chicken/Krasnodar/02/06(H5N1); A/Chicken/
в некоторых странах, например, Китай, Индонезия, Dagestan/06(H5N1). Все штаммы на 2-3-м пассажах
Вьетнам и Египет [13]. (от источника выделения) при культивировании на
Для разработки новых высокоэффективных про- куриных эмбрионах (КЭ) были наработаны до кон-
тивогриппозных лечебно-профилактических препара- центрации 7,5-8,5 lg 50 % эмбриональных инфици-
тов и диагностических тест-систем необходимо иметь рующих доз в 1 мл (ЭИД50/мл) и хранились до ис-
информацию о степени чувствительности к различ- пользования в экспериментах в низкотемпературной
ным штаммам ВГП A/H5N1 мышей, которые широко морозильной камере при минус 70 °С.
используются в качестве модельных животных при Животные. В исследованиях использовали ин-
разработке препаратов и тест-систем [4, 8, 9]. тактных беспородных разнополых белых мышей ICR
В связи с этим целью работы являлось изучение массой 14-16 г, полученных из питомника ФБУН ГНЦ
на мышах инфекционных свойств различных штам- ВБ «Вектор». Животных содержали на стандартном
мов вируса гриппа птиц A/H5N1, выделенных на рационе с достаточным количеством воды согласно
территории России и стран СНГ. ветеринарному законодательству и в соответствии с
требованиями по гуманному содержанию и исполь-Материалы и методы зованию животных в экспериментальных исследова-
ниях [3]. Наблюдение за инфицированными мышами Вирус. В работе использовали восемь высоко- осуществляли в течение 16 сут с момента заражения.
патогенных штаммов ВГП подтипа H5N1, выделен- Методы инфицирования мышей. Интрана-
ных в России и странах СНГ, которые были полу- зальное заражение мышей проводили традиционным
чены из Государственной коллекции возбудителей методом с применением седативных средств с после-
дующим определением 50 % летальной дозы (ЛД50) вируса для этих животных [1].
Эксперименты по аэрозольному инфицированию мышей проводили аналогично методике, описанной ранее [5]. Минутный объем дыхания мышей, зависящий от их веса, рассчитывали по формуле Гайтона [7]. Зная концентрацию вирусного аэрозоля в камере (по результатам титрования вируса в пробах из аэрозольных пробоотборников), минутный объем дыхания животных и время инфицирования (экспозиции), определяли для мышей дозы заражения ВГП. С учетом результатов наблюдения за гибелью животных получали зависимость доза-эффект (по гибели мышей) и определяли 50 % летальную дозу при аэрозольном способе заражения (АЛД50) мышей для различных штаммов ВГП.
Специфичность гибели животных. Факт гибели мышей вследствие гриппозной инфекции подтверждали при определении наличия вируса гриппа в гомогенатах их легких.
Вирусологический анализ проб. Определение концентрации и наличия жизнеспособного вируса в образцах тканей животных и аэрозольных пробах проводили традиционным методом путем введения вируссодержащей жидкости в аллантоисную полость 9-суточных КЭ кросса Хайсекс Браун генетической линии Род-айленд с последующей регистрацией наличия вируса в реакции гемагглютинации [2].
Электронно-микроскопические исследования. Образцы легких отбирали через 5 сут после интрана-зального заражения одним из штаммов ВГП (A/Chic-ken/Suzdalka/Nov-11/2005; A/Chicken/Kurgan/05/2005; A/Duck/Kurgan/08/2005) в дозе 10 ЛД50. При этом по
3 животных умерщвляли методом цервикальной дислокации. После вскрытия животных иссекали трахею и легкие, фиксировали 4 % параформальдегидом при
4 °С в течение 48 ч. Обработку образцов проводили, как описано ранее [4]. Срезы готовили на микротоме Райхерт-Янг (Австрия) и исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония), фотосъемку проводили с помощью цифровых камер Jeol и Veleta (SIS, Германия).
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами [1]. При этом
Вирулентность штаммов вируса гриппа птиц (ВГП) А/Н5Ш для мышей при интраназальном и аэрозольном заражении с определением ЛД50 и АЛД50 соответственно
Штамм ВГП (H5N1) Показатели вирулентности ВГП для мышей:
ЛД5п0ё эид,0) M±I95* АВД 0g ЭИД,0) M±I95*
A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 >6,5 >5,0
A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 >6,5 4,9±0,5
A/Duck/Kurgan/08/2005(H5N1) 4,2±0,4 3,8±0,6
A/Chicken/Kurgan/05/2005(H5N1) 1,2±0,3 2,2±0,0
A/Chicken/Crimea/04/2005(H5N1) 1,3±0,3 -0,7±0,0
A/Chicken/0msk/06(H5N1) 2,2±0,3 3,2±0,2
A/Chicken/Krasnodar/02/06(H5N1) 1,7±0,3 1,3±0,9
A/Chicken/Dagestan/06(H5N1) 2,7±0,5 1,8±0,7
*Средняя величина (М) и доверительный интервал (¡95) с уровнем надежности 95 %.
определение 50 % доз вируса проводили при использовании метода Спирмена - Кербера.
Результаты и обсуждение
Важными параметрами, используемыми при разработке новых лечебно-профилактических препаратов и тест-систем, являются параметры, характеризующие чувствительность хозяев к вирусу. В связи с этим были проведены сравнительные исследования чувствительности мышей к различным штаммам ВГП при интраназальном и аэрозольном заражении, результаты которых представлены в таблице. Через 5-10 сут после заражения у животных регистрировали ряд клинических признаков заболевания (взъе-рошенность, сниженная двигательная активность, конъюнктивит) и летальный эффект. Проведенный корреляционный анализ взаимосвязи между показателями ЛД50 и АЛД50, полученными при разных способах заражения животных, свидетельствует о высокой степени корреляции между этими данными (коэффициент корреляции - г = 0,89). Кроме того, наблюдали существенные различия по вирулентности штаммов ВГП для респираторно зараженных мышей. По данному показателю исследуемые штаммы были разделены на 3 группы: высоковирулентные (ЛД50 и АЛД50 - <3,0 lg ЭИД50) - A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Ch5i0cken/Crimea/04/250005, A/Chicken/0msk/06, A/ Chicken/Krasnodar/02/06, A/Chicken/Dagestan/06; средней степени вирулентности (ЛД50 и АЛД50 - 3,0-4,5 lg ЭИД50) - A/Duck/Kurgan/08/20055;0 авируле50нтные (ЛД50 и АЛД50 - >4,5 lg ЭИД50) - A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005.
В наших предварительных исследованиях по изучению динамики накопления ВГП в организме респираторно зараженных мышей был зарегистрирован первичный очаг размножения патогена в дыхательном тракте (слизистая полости носа, легкие). При этом максимальное накопление вируса наблюдалось в легких через 5 сут после инфицирования этих животных - (5,6±0,6) lg ЭИД50/г. Учитывая это обстоятельство, электронно-микроскопическому изучению в этот период подвергали легкие мышей, интрана-зально инфицированных одним из штаммов ВГП (A/ Chicken/Kurgan/05/2005, A/Duck/ Kurgan/08/2005 и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005) в дозе 10 ЛД50. При этом была выявлена репродукция ВГ в реснитчатых клетках бронхиального эпителия (рисунок). Ядра зараженных клеток имели характерную для репродукции вируса гриппа морфологию [4]. Почкование вируса происходило на апикальной мембране клеток, вирионы локализовались между ресничками и микроворсинками. Кроме этого, репродукция ВГ была зарегистрирована в альвеолоцитах 1 и 2-го порядка.
Известно, что различные штаммы ВГП А/Н5Ш, выделенные как от птиц, так и от людей, при экспериментальном инфицировании мышей без предварительной адаптации вызывают либо заболевание, либо инфекционный процесс, носящий бессимптомный характер [6, 8, 10]. Нами также было отмечено, что чувствительность мышей (показатели ЛД50 и АЛД50) к ис-
Зараженная вирусом гриппа Н5№
(штамм A/CЫcken/Suzdalka/Nov-11/2005) реснитчатая клетка эпителия бронха мыши через 1 сут после инфицирования:
1 - просвет бронха; 2 - цитоплазма реснитчатой клетки;
3 - базальные тельца ресничек. Белыми стрелками показаны вирусные частицы, черными - микроворсинки, серыми - реснички
пользованным в работе штаммам ВГП А/Л5Ш при респираторном заражении также существенно различалась. В то же время все штаммы проявляли одинаково высокую вирулентность для кур при внутривенном введении (внутривенный индекс патогенности, ГУРГ -от 2,7 до 3,0) и интраназальном заражении (ЛД50 - от 0,3 до 1,2 ^ ЭИД50). Полученные нами результаты могут быть использованы для анализа взаимосвязи генетической структуры ВГП и его патогенных свойств. Зарегистрированный коэффициент высокой степени корреляции между показателями вирулентности штаммов, полученными при интраназальном и аэрозольном инфицировании мышей, и близкие их значения свидетельствуют, вероятно, о существенном сходстве механизмов течения инфекционного процесса у этих животных при данных способах заражения, несмотря на то, что эти способы инфицирования отличаются по месту преимущественной первичной локализации в респираторном тракте мышей вводимого вирусного материала [при интраназальном заражении - в основном слизистая носовой полости, а при аэрозольном (для используемого нами полидисперсно-го аэрозоля с медианно-массовым аэродинамическим диаметром частиц 1 мкм) - в равной степени легкие и верхние отделы респираторного тракта]. Отчетливый тропизм вируса гриппа H5N1 к легким отмечается во многих опубликованных работах, посвященных этому патогену [9, 12, 13]. Проведенное нами электронномикроскопическое изучение легких мышей, инфицированных штаммами ВГП, выделенными в России и странах СНГ, позволило выявить размножение вируса в реснитчатых клетках респираторного тракта мышей (так же, как и у человека) [11, 14]. Анализируя всю вышеприведенную информацию, высоковирулентные для мышей штаммы ВГП могут быть использованы в экспериментах на мышах для оценки эффективности разрабатываемых противогриппозных лечебнопрофилактических препаратов и работоспособности создаваемых тест-систем.
Таким образом, все исследованные штаммы ВГП по вирулентности для мышей при интраназальном
и аэрозольном заражении могут быть разделены на 3 группы: высоковирулентные (ЛД50 и АЛД50 - <3,0 lg ЭиД50) - A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Chicken/ Crimea/0540/2005, A/Chicken/0msk/06, A/Chicken/
Krasnodar/02/06, A/Chicken/Dagestan/06; средней степени вирулентности (ЛД50 и АЛД50 - 3,0-4,5 lg ЭИД50) -A/Duck/Kurgan/08/2—5; авирулентные (ЛД50 и АЛД^ ->4,5 lg ЭИД50) - A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 и A/ Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005. Выявленными первичными клетками-мишенями у мышей, респираторно инфицированных ВГП, являются реснитчатые клетки воздухоносных путей, пневмоциты 1 и 2-го порядка.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика; 1976. 598 с.
2. Мейхи Б., редактор. Вирусология. Методы. М.: Мир; 1988. 344 с.
3. Национальный научно-исследовательский совет. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Вашингтон: Национальная Академия; 1996.
4. Онищенко Г.Г., Рябчикова Е.И., Сергеев А.Н., Дроздов И.Г. Вирус гриппа H5N1: атлас репродукции и патологических изменений внутренних органов мышей. Новосибирск: «Арта»; 2008. 208 с.
5. Сергеев А.Н., Жуков В.А., Порываев В.Д. и др. Разработка простого метода прямой оценки наличия инфекционного процесса у мышей и крыс, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа. Вопр. вирусол. 2002; 4:44-6.
6. Gao P., Watanabe S., Ito T. et al. Biological Heterogeneity, Including Systemic Replication in Mice, of H5N1 Influenza A Virus Isolates from Humans in Hong Kong. J. Virol. 1999; 73:3184-9.
7. Guyton A. Measurements of the respiratory volumes of laboratory animals. Am. J. Physiol. 1947; 150:70-7.
8. Ibricevic А., Pekosz A., Walter M.J. et al. Influenza Virus Receptor Specificity and Cell Tropism in Mouse and Human Airway Epithelial Cells. J. Virol. 2006; 80:7469-80.
9. Katz J.M., Lu X., Tumpey T.M. et al. Molecular correlates of influenza A H5N1 virus pathogenesis in mice. J. Virol. 2000; 74(22):10807-10.
10. Khanna M., Kumar P., Choudhary K. et al. Emerging influenza virus: A global threat. J. Biosci. 2008; 33(4):475-82.
11. Matrosovich M., Matrosovich T., Uhlendorff J., Garten W., Klenk H-D. Avian-virus-like receptor specificity of the hemagglutinin impedes influenza virus replication in cultures of human airway epithelium. Hum. Pathol. 2009; 40:735-9.
12. Perrone L.A., Plowden J.K., Garci'a-Sastre A. et al. H5N1 and 1918 Pandemic Influenza Virus Infection Results in Early and Excessive Infiltration of Macrophages and Neutrophils in the Lungs of Mice. PLoS Pathog. 2008; 4(8):e1000115.
13. WHO. Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO. 10 Jun 2011 [cited 11 Jun 2011]. Available from: http://www.who.int/csr/disease/avian_in-fluenza/country/cases_table_2011_06 10/en/index.html
14. Zhang Z., Zhang J., Huang K., Li K-S., Yuen K-Y., Guan Y., Chen H., Fu W. Systemic infection of avian influenza A virus H5N1 subtype. Hum. Pathol. 2—9; 40(5):735-9.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. ZaksL. [Statistic Evaluation]. M.: Statistics; 1976. 598 p.
2. Meykhi B., editor. [Virology. Methods]. M.: Mir; 1988. 344 p.
3. State Research Council. [Guidelines on maintenance and usage of laboratory animals]. Washington: National Academy; 1996.
4. Onishchenko G.G., Ryabchikova E.I., Sergeev A.N., Drozdov I.G. [Influenza Virus H5N1: atlas of reproduction and pathological changes of mice viscera]. Novosibirsk: “Arta”; 2008. 208 p.
5. Sergeev A.N., Zhukov VA., Poryvaev V.D. et al. [Development of a simple direct estimate method for the detection of the disease in mice and rats, which are aerosol-infected with influenza virus]. Vopr. Virusol. 2002; 4: 44-6.
Authors:
Sergeev A.A., P'yankov O.V., Demina O.K., P'yankova O.G., Ryabchikova E.I., Agafonov A.P., Sergeev A.N. State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector”. Kol’tsovo, Novosibirsk Region, 630559, Russia. E-mail: aasergeev@vector.nsc.ru
Об авторах:
Сергеев А.А., Пьянков О.В., Демина О.К., Пьянкова О.Г., Рябчикова Е.И., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор». 630559, Новосибирская область, п. Кольцово. E-mail: aasergeev@vector.nsc.ru
Поступила 16.07.11.
