CC BY
23
ОНКОЛОГИЯ
ONCOLOGY
УДК: 577.27; 612.017.1:616-006
E.O. Остапчук, А. Кали, О.Ю. Юрикова, Р.Т. Тлеулиева, Ю.В. Перфильева, Н.Н. Беляев
Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Лаборатория молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии, г.Алматы, Казахстан
ИНДУКЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АНЕРГИИ NK-КЛЕТОК человека под воздействием факторов опухолевых клеток
ЛИНИИ MIAPACA2
Работа посвящена изучению влияния опухолевых клеток на экспрессию молекул, участвующих в цитолизе клеток-мишеней ЫК-клетками, важнейшими участниками противоопухолевого иммунитета. Нами было установлено, что супернатанты, а также контактное взаимодействие с клетками линии MiaPaCa2 и с культурой MiaPaCa2, обогащенной раковыми стволовыми клетками, снижают экспрессию DNAM-1, CDW7a и IFNy NK-клетками здоровых доноров, что приводит к их функциональной анергии. Ключевые слова: ЫК-клетки, цитотоксичность, опухолевые факторы.
Введение. Натуральные киллерные клетки (NK) традиционно рассматриваются как цитотоксические лимфоциты, обладающие способностью уничтожать инфицированные вирусом и трансформированные клетки организма. Многочисленные исследования свидетельствуют о снижение у онкологических больных цитолитической активности опухоль-ассоциированных и циркулирующих NK-клеток, причем, уровень этого снижения коррелирует с плохим прогнозом заболевания. Фенотип NK-клеток больных различными типами рака отличается от NK здоровых доноров. Так, было показано, что среди NK-клеток больных меланомой увеличена доля CD56bгightCD16+-клеток с регуляторной активностью и снижена доля цитотоксических CD56dimCD16+ NK, которые к тому же обладают пониженной цитотоксичностью и продукцией IFN-y. NK-клетки больных острой миелоидной лейкемией, раком молочной железы, поджелудочной железы, желудка и колоректальным раком показывали пониженную экспрессию активирующих рецепторов (CD161, NKG2D, CD16, NKp30, NKp46), сопровождающуюся снижением продукции перфорина, и повышенную экспрессию ингибирующего рецептора CD158a, что коррелировало со снижением их цитотоксичности. Также было показано, что при карциноме яичников опухоль-ассоциированные NK-клетки слабо экспрессируют активирующие рецепторы DNAM-1, 2B4, CD16 и обладают пониженной чувствительностью к ко-стимуляции клетками эритролейкемии K562 через DNAM-1 [1]. В качестве основных причин недостаточности функциональной активности NK-клеток при онкологических заболеваниях рассматривается влияние иммуносупрессорного микроокружения опухоли и растворимых и/или мембран-ассоциированных факторов, экспрессируемых опухолевыми клетками. В последнее время обсуждается состояние «расщепленной анергии» ("split anergy") NK-клеток, возникающей после контакта с опухолевыми клетками, негативными по МНС-I, в том числе и раковыми стволовыми клетками (CSC), основными опухоль-генерирующими клетками, обнаруживаемыми во многих типах опухолей [2]. A.Jewett и соавт. установили, что NK-клетки обладают естественной способностью уничтожать стволовые клетки, в том числе и CSC, после физического контакта с которыми, они теряют способность к лизису NK-чувствительных клеток-мишеней. Предполагается, что состояние анергии может возникать при лигирование рецептора CD16 на NK-клетках [3]. На сегодняшний день молекулярные и клеточные механизмы цитолитической анергии NK при раке остаются малоизученными. Очевидно, что их раскрытие поможет сделать важный шаг онкоиммунологии в развитии новых подходов к иммунотерапии рака. В настоящей работе нами были исследованы некоторые медиаторы негативного влияния опухолевых клеток, вызывающие функциональную анергию NK-клеток.
Цель исследования: оценить влияние культивируемых клеток опухолевой линии MiaPaCa2, на цитолитическую активность и фенотип NK-клеток.
Материалы и методы. В ходе исследования использовали венозную кровь здоровых доноров (ср. возраст 47,3±19,4 лет, n=23). Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием на Histopaque-1,077 (Sigma-Aldrich, США) 20 мин при 3000g 4оС и отмывали средой RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США). Также использовали клеточные линии эритролейкемии K562 и рака поджелудочной железы MiaPaCa2, полученные из ATCC (American Type Culture Collection, USA).
Во всех экспериментах клетки культивировали в концентрации 2х106 кл./мл, в полной культуральной среде (ПКС), содержащей RPMI-1640, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Sigma-Aldrich, США) при 37оС и 5% СО2 в СО2-инкубаторе.
Для изучения влияния клеток опухолевой линии на цитолитическую активность и фенотип NK-клеток, мононуклерную фракцию клеток крови ко-культивировали в течение 18 ч в ячейках 96-луночного планшета с адгезированными в виде монослоя клетками MiaPaCa2, после чего неадгезированные клетки отбирали и исследовали на функциональную активность и фенотип. Для оценки участия раковых стволовых клеток в этом процессе родительскую линию MiaPaCa2 (Par) до ко-культивирования с мононуклеарными клетками обогащали CSC (Par-TT) путем стимуляции рекомбинантными человеческими цитокинами TGF-p и TNF-a (10 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, США) [4]. Для оценки влияния растворимых опухолевых факторов на NK-активность мононуклеарные клетки культивировали в супернатантах культур Par с добавлением 10% FBS или в ПКС присутствии анти-CD16 антител (АТ) (3 мкг/мл) в течение 18 ч.
Фенотип и экспрессию цитолитических молекул NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии в гейте CD3-CD56+ после поверхностного мечения флуоресцентно-меченными АТ согласно протоколам фирм-производителей (DNAM-1-APC, 2B4-FITC, CD69-FITC, NKp30-APC, NKp44-APC, NKp46-APC, NKp80-FITC, CD107a-APC (Miltenyi Biotech, Германия); CD3-FITC, CD3-PE, CD56-PE, CD56-PerCP, KIR2DL2/L3-PE, NKG2D-APC (Biolegend, США)), затем фиксировали Cytofix Fixation buffer (BD Biosciences, США). Для анализа внутриклеточных молекул клетки дополнительно пермеабилизировали 30 мин в растворе CytoFix/CytoPerm (BD Biosciences, США), отмывали раствором Perm/Wash Buffer (BD Biosciences, США) производили внутриклеточное окрашивание АТ (IFN-y-PE, perforin-APC, granzyme-B-PE (Miltenyi Biotech, Германия)) и анализировали на цитофлуориметре FACS Calibur с использованием программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences).
Об изменении функциональной активности NK-клеток судили по экспрессии перфорина и гранзима-В, IFN-y, и CD107a после культивировании мононуклеаров с Par, Par-TT, супернатантом Par или анти-CD-16 АТ, а также без или с дополнительным 4-часовым ко-культивированием мононуклеаров с K562 в соотношении эффектор:мишень 30:1 в присутствии АТ CD107a-APC. По истечению 1 ч инкубации в культуру добавляли 1мкл/мл брефелдина А
Вестник КазНМУ №3-2017
109
(Biolegend, USA). Спустя еще 3 ч клетки собирали, отмывали солевым фосфатным буферным раствором, производили окрашивание соответствующими АТ и анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии. Полученные данные обрабатывали методами математической статистики. Рассчитывали средние арифметические величины и стандартные отклонения. Достоверность различия Р рассчитывали по критерию Стъюдента с уровнем значимости Р<0,05. Результаты и обсуждения. Ранее нами было показано снижение цитотоксичности NK-клеток после их инкубации в присутствии супернатантов Par-TT, и прямого контакта с клетками этой линии [4]. Для изучения механизма этого явления мы изучили влияние контакта NK-клеток с этими
культурами клеток на экспрессию рецепторов и молекул, участвующих в регуляции и непосредственном цитолизе клеток-мишеней. Цитометрический анализ экспрессии большинства активирующих и ингибирующих клеточных рецепторов (NKG2A, KIR2DL1, KIR2DL2, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80, CD69) NK-клетками после контакта с Par и Par-TT не выявил существенных отличий от NK-клеток, не подвергавшихся воздействию опухолевых факторов. Однако преинкубация NK-клеток с культурой клеток Par, Par-TT, а также с супернатантом Par приводила к достоверному снижению доли NK-клеток, экспрессирующих активирующий рецептор DNAM-1 (рисунок 1А). Аналогичное действие оказывали анти-CD16 АТ.
+супернатант Par
+анти-С016
* * *
*l
а 5 10 15 20 25 % С D 3"CD 56+ D N AM -1+ клеток
5 10 15 20 % CD3"CD56+IFNy+ клеток
О 5 10 15 20
% CD3~CD56+CD107a+ клеток
Рисунок 1 - Влияние инкубации с клетками Par и Par-TT, супернатантом Par и анти-CD16 АТ на экспрессию DNAM-1 CD3-CD56+ NK-клетками (А), а также CD107a и IFNy в цитолитическом тесте CD3-CD56+ NK-клетками (Б). Данные представлены в виде M±SD при
*P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0005
Далее мы изучили влияние опухолевых факторов и действия анти-CD16 АТ на уровень дегрануляции и экспрессию цитолитических молекул NK-клетками в стандартном цитотоксическом тесте против клеток К562. При всех вариантах воздействия наблюдалось уменьшение уровня дегрануляции (экспрессии CD107a) и продукции №N7 NK-клетками по сравнению с контрольными NK в цитолитическом тесте (рисунок 1Б).
Изучая NK-клетки в цитотоксическом тесте, мы не обнаружили достоверных различий в уровне
внутриклеточного гранзима-B и перфорина, обеспечивающих цитолиз клеток-мишеней, после ко-культивирования с клетками Par, Par-TT (данные не показаны). Интересно, что снижение экспрессии гранзима-B в сравнении с контрольными NK без дополнительной инкубации с клетками линии К562 наблюдалось после ко-культивирования с клетками Par, Par-TT и после воздействия анти-CD16 АТ, а перфорина после воздействия Par-TT (n=3) (рисунок 2).
Рисунок 2 - Влияние инкубации с клетками Par и Par-TT, супернатантом Par и aHra-CD16 АТ на экспрессию гранзима-B (Gr-B) и перфорина (Perforin) CD3-CD56+ NK-клетками. Данные представлены в виде M±SD при *P<0,05 и **P<0,0005
Заключение. В результате проведенных экспериментов мы установили, что молекулярный механизм приобретения анергии NK-клетками связан со снижением экспрессии активирующего рецептора DNAM-1. Более того, анергия NK-клеток не связана с изменением продукции цитолитических гранул в ответ на присутствие клеток-мишеней, а скорее зависят от механизмов дегрануляции этих молекул (снижение CD107a), а также от снижения продукции IFNy, что может быть одной из причин общего снижения потенциала врожденного противоопухолевого иммунитета и прогрессивного роста опухоли.
Полученные данные свидетельствуют о том, что феномен возникновения анергичного состояния NK-клеток связан с действием растворимых факторов, продуцируемых опухолевыми клетками, т.к. достоверное снижение молекул цитотоксичности NK-клетками наблюдалось как после действия супернатантов Par, так и после прямого контакта с клетками Par и Par-TT. Является ли такая анергия результатом действия CSC или дифференцированных опухолевых клеток остается не ясным. Однако следует отметить, что в большей части опытов культуры Par-TT, содержащие большее количество клеток с фенотипом CSC, снижали долю NK, экспрессирующих перфорин, а также IFN-
у и способных к дегрануляции в ответ на присутствие клеток-мишеней, по сравнению с культурами Раг и их супернатантами.
Также, мы обнаружили аналогичное изменение в экспрессии цитолитических молекул NK-клетками при воздействии на них анти-CD16 АТ, исходя из чего можно предположить, что возможным механизмом возникновения состояния расщепленной анергии NK-клеток под действием факторов, экспрессированных опухолевыми клетками, является лигирование рецептора РсуИП-рецептора CD16. Как известно, эндогенные АТ, связанные с антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью через СБ16 на NK-клетках, инициируют клеточные события, кульминацией которых является высвобождение цитотоксических гранзим-содержащих гранул и секреция №N-7. При этом известно, что экзогенные моноклональные анти-CD16 АТ вызывают анергию NK-клеток, ингибируя образование зрелых форм катепсинов С и Н, и, как следствие, снижая процессинг и активацию гранзима-В из про-гранзима [3]. Подобный сценарий, возможно, происходит и с катепсином Ь, приводящим к нарушению созревания перфорина [5] при анергии, вызванной культурой опухолевых клеток, обогащенных С5С. В свою очередь нарушение в активации
гранзима-В и перфорина может являться ключевым событием в снижении гранулозависимого клеточного лизиса анергичными NK-клетками.
Интересно, что доля NK-клеток, экспрессирующих гранзим-В и перфорин, снижалась при воздействии опухолевых факторов и анти-CD16 АТ без дополнительной стимуляции, что подтверждает опубликованные ранее данные [3] и свидетельствует о негативной роли мембран-ассоциированных молекул на опухолевых клетках в данном процессе. В то же время, мы не обнаружили различий по гранзим-В+ и перфорин+ Ж-клеткам между группами после дополнительной инкубации с К562. Можно сделать вывод о том, что при встрече с клеткой-мишенью, в анергичных NK-клетках процессинг гранзима-В и перфорина происходит с участием других энзимов (не катепсинов С и Н и, возможно, L) [5], но при этом дегрануляция цитолитических гранул не происходит. Возможно, опухолевые факторы вызывают нарушения в экспрессии молекул, участвующих в образовании полимеризованного актина и транслокации
микротубулярного организационного центра (MTOC), либо в непосредственном экзоцитозе цитотоксических гранул. Данные литературы свидетельствуют о нарушении секреции IFN-y NK-клетками при ко-культивировании с культурой клеток плоскоклеточного рака ротовой полости, родительской или обогащенного CSC, в присутствие или отсутствии анти-CD16 АТ, в то время как добавление во все культуры IL-2 повышало секрецию данного цитокина [3]. В наших экспериментах доля NK-клеток, содержащих внутриклеточный IFN-y в цитолитическом тесте снижалась при всех воздействиях. Можно предположить, что опухолевые факторы подавляют экспрессию IFN-y NK-клетками через лигирование CD16, но, при этом, стимуляция клеток IL-2 способна нивелировать этот эффект. Полученные результаты могут послужить основой дальнейшего изучения причин анергии NK-клеток при онкологических заболеваниях и поиска мишеней для коррекции данного состояния.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Levy E.M., Roberti M.P., Mordoh J. Natural killer cells in human cancer: from biological functions to clinical applications // J. Biomed. Biotech.- 2011.-Vol. 2011 ID 676198, 11 p.
2 Belyaev N.N., Abramova V.A., Transmission of "split anergy" from tumor infiltrating to peripheral NK cells in a manner similar to "infectious tolerance"//Medical Hypotheses.-2014.-Vol.82.-P.129-133
3 Magister S., Tseng H.C., Bui V.T., Kos J., Jewett A. Regulation of split anergy in natural killer cells by inhibition of cathepsins C and H and cystatin F//Oncotarget.-2015.-Vol.8,№ 6.-P.22310-22327.
4 Юрикова О.Ю., Остапчук E.O., Кали А., Тлеулиева Р.Т., Перфильева Ю.В., Беляев Н.Н. Влияние культивируемых клеток опухолевых линий на цитолитическую активность NK-клеток человека//Вестник КазНМУ.-2016.№4.-С.93-97.
5 Nanut M.P., Sabotic J., Jewett A., Kos J. Cysteine сathepsins as regulators of the cytotoxicity of NK and T cells//Front. Immunol. -2014.-Vol.5.-ID 616.-Р. 10.
E.O. Остапчук, А. Кали, О.Ю. Юрикова, Р.Т. Тлеулиева, Ю.В. Перфильева, Н.Н. Беляев
М.ААйтхожин атындагы молекулалъщ биология жэне биохимия институты, Молекулалыц иммунология жэне иммунобиотехнология лабораториясы, Алматы, Цазацстан Республикасы
MIAPACA2 1С1К ЛИНИЯ ЖАСУША ЭСЕР1НДЕГ1 АДАМНЫН, NK-ЖАСУШАСЫНЫН, ФУНКЦИОНАЛДЫ АНЕРГИЯ ИНДУКЦИЯСЫ
TyWh: Бул жумыс ¡сшке карсы иммунитеттщ басты белеп, табиги киллер жасушасыныц (NK) цитотоксикалык; активтштне катысушысы молекулалардыц экспрессиясына ¡сш жасушаларыныц эсерш зерттеуге арналган. Б1з супернатант жэне жасуша-жасуша эсер аркылы, MiaPaCa2 жэне MiaPaCa2 ¡сш линиасынан алынган ¡сш баганалы жасушаларымен (CSC) байытылган жасуша културасыныц сау донорлардыц перифериялы; канындагы NK жасушасыныц DNAM-1, CD107a жэне IFN-y экспрессиясын жеткшшт темендететешш аньщтадьщ.
ТYЙiндi свздер: NK жасушалар, цитолитикалы; активттк, жасушалары гак факторлары
Y.O. Ostapchuk, A. Kali, O.Yu. Yurikova, R.T. Tleulieva, Y.V. Perfilyeva, N.N. Belyaev
M.A. Aitkhozhin's Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Laboratory of Molecular Immunology and Immunobiotechnology, Almaty,
Kazakhstan
INDUCTION OF FUNCTINAL ANERGY OF NK CELLS UNDER THE INFLUENCE OF TUMOR MIAPACA2 CELL LINE CELLS
Resume: The present study investigated the influence of tumor cells on expression of molecules participating in cytotoxic activity of NK cells, an essential component of anti-tumor immunity. Herein we show that supernatants and cell-to-cell contact with MiaPaCa2 cells, as well as cancer stem cells-enriched culture of MiaPaCa2 cause functional anergy of NK cells obtained from healthy donors. Keywords: NK cells, cytotoxicity, tumor factors.
УДК: 577.27; 612.017.1:616-006
Е.О. Остапчук1, Н.А.Омарбаева2, Е.А. Кустова3, Н.Т. Уразалиева3, Ш.Ж. Талаева2, Н.Н. Беляев1
1Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Лаборатория молекулярной иммунологии и
иммунобиотехнологии, г.Алматы, Казахстан; 2Казахский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии, Маммологический центрг.Алматы, Казахстан; 3Научный центр педиатрии и детской хирургии, г.Алматы, Казахстан.
^-Ю-ПРОДУЦИРУЮЩИЕТ-РЕГУЛЯТОРНЫЕ КЛЕТКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН И БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
10-продуцируюшиеТ-регуляторные клетки участвуют в подавлении противоопухолевого иммунитета. В данной работе показано присутствие таких клеток в периферической крови здоровых женщин. В периферической крови больных раком молочной железы было обнаружено увеличение доли 1Ь-10-продуцируюшихТ-регуляторныхклеток, экспрессирующихFoxP3, 35 и CD39.
