CC BY
61
УДК:616-006.81-091.818
индукция Апоптозд клеток меланомы лигандом TsPO РК11195
С.Н. Гырылова, А.В. Комина, Т.Г. Рукша
ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития», кафедра патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1; e-mail: [email protected]
Изучалась возможность активации апоптоза в клетках меланомы SK-MEL1 кожи после лечения специфическим TsPO лигандом РК11195 в различных концентрациях (10 ¡imol/L, 100 nmol/L и 10 nmol/L.). Показано, что повышение уровня экспрессии TsPO с параллельным увеличением уровня апоптоза в культуре клеток SK-MEL-1 после лечения TsPO лигандом РК11195 в наномолярной концентрации 100 nmol/L говорит о возможности использования TsPO в качестве новой патогенетической мишени для активации апоптоза клеток меланомы кожи.
Ключевые слова: меланома кожи, лиганд TsPO, апоптоз.
TRANSLOCATOR PROTEIN LIGAND PK11195 INDUCE APOPTOSIS IN CUTANEOUS MELANOMA CELLS
S.N. Gyrylova, A.V Komina, T.G. Ruksha Krasnoyarsk State Medical University, Krasnoyarsk 1, Partizan ZheleznyakSteet, 660022-Krasnoyarsk, e-mail: [email protected]
Apoptosis activation was studied in melanoma cells SK-MEL1 treated with TsPO-specific ligand PK11195 in different concentrations (10 imol/L, 100 nmol/L and 10 nmol/L). The increase in TsPO expression levels with increase in apoptosis levels were detected after TsPO ligand PK11195 treatment in concentration 100 nmol/L. These data show that TsPO can be used as a new therapeutic target in melanoma apoptosis activation.
Key words: cutaneous melanoma, TsPO ligand, apoptosis.
Меланома кожи является агрессивным злокачественным новообразованием, стремительный рост заболеваемости которой в последние десятилетия регистрируется во всем мире среди белого населения, включая страны с исторически низким уровнем этой патологии [5]. В структуре всех опухолевых заболеваний кожи меланома составляет 3-5 % и, таким образом, занимает лишь третье место по частоте встречаемости, но именно это новообразование является главной причиной смерти больных с онкопатологией кожи [1].
Несмотря на наблюдающуюся тенденцию к улучшению диагностики меланом на ранних стадиях заболевания и меланом in situ, снижения смертности при этой патологии не наблюдается.
Возможно, это связано с биологически агрессивным поведением опухоли с самого начала ее гразвития. Кроме того, метастазирующая меланома прогностически крайне неблагоприятна и резистентна ко всем видам противоопухолевой терапии [3]. Считается, что в основе этого лежит особая устойчивость клеток меланомы к апоптоз-индуцирующим стимулам. Клетки меланомы имеют низкий уровень спонтанных апоптозов in vivo в сравнении с другими
опухолевыми клетками и резистентны к индуцированному лекарственными препаратами апоптозу in vitro [4, 7]. Данные особенности биологического поведения меланомы обусловливают необходимость дальнейшего изучения особенностей реализации апоптоза при данном новообразовании.
Известно, что нарушение проницаемости митохондриальных пор является одним из ключевых событий в развитии апоптоза. Высвобождение апоптотических факторов из митохондриального межмембранного пространства в цитоплазму, формирование «апоптосом» и активация эффекторных каспаз являются необратимыми событиями на пути развития клеточной гибели [6].
Митохондриальные поры (МП) являются мультипротеиновым комплексом, локализованным между наружной и внутренней митохондриальной мембраной. Они формируются несколькими белками: митохондриальной гек-сокиназой, TsPO, вольтажзависимым анионным каналом (VDAC) на наружной мембране, креа-тинкиназой в межмембранном пространстве, переносчиком адениннуклеотидов (ANT) на внутренней мембране и циклофиллином D
в матриксе [8]. Открытие поры инициирует апоптотическую гибель клеток, в то время как фармакологическое ингибирование предотвращает развитие клеточной смерти.
Показано, что TsPO, как один из компонентов митохондриальных пор, может модулировать их функционирование путем увеличения продолжительности открытия, что ведет к снижению мембранного потенциала [2, 8]. К классическим лигандам, связывающим TsPO и предположительно модулирующим его функционирование. относятся PK11195. В 1999 г. было показано, что специфический лиганд TsPO - РК11195 - может индуцировать апоптоз в тимоцитах. Позднее было выявлено, что более чем в двадцати различных типах клеток TsPO может демонстрировать проапоптотические эффекты. Более того, обнаружено, что TsPO обладает способностью потенцировать эффекты других проапоптоти-ческих, в том числе противоопухолевых препаратов [8].
В этой связи целью данного исследования было определение возможности активации TsPO-опосредованного апоптоза клеток меланомы кожи путем воздействия специфическим TsPO лигандом РК 11195.
Материал и методы
Клеточное культивирование. Человеческая культура клеток меланомы кожи SK-MEL-1 (American Type Cells Collection) была любезно предоставлена Московским НИИ медицинской экологии. Клетки выращивались в среде RPMI 1640 с 10 % содержанием фетальной бычьей сыворотки с добавлением 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина при 37°C в CO2 инкубаторе (5 % CO2). Клетки рассеивались в чашки Петри с плотностью 2-4*106 кл/мл за 24 ч до начала эксперимента. К суспензии клеток добавлялся TsPO лиганд РК11195 (Sigma) в концентрации 10 ^mol/L, 100 nmol/L и 10 nmol/L. В контрольной группе клетки оставались без лечения. Через 72 ч клетки центрифугировали в течение 10 мин со скоростью 1,5 тыс/об., клеточный осадок промывался в холодном фосфатно-солевом буфере.
Оценка уровня апоптоза. Выраженность апоптоза оценивалась с помощью окраски
акридиновым оранжевым/бромистым этидием (Gerbu Biothechnick GmbH, MP Biomedicals Inc.). Определялся процент апоптотических клеток с ядром, окрашенным (полностью или фрагментарно) в оранжевый цвет. Ядра живых клеток окрашивались в зеленый цвет. Визуализация проводилась с помощью флюоресцентного микроскопа Primo Star (Carl Zeiss MicroImaging GmbH), подсчитывалось число апоптотических клеток на 100 визуализируемых клеток.
Иммуноцитохимическое исследование. После промывания клетки переносили на стекла и высушивали в парах формалина для фиксации в течение 30 мин. После этого проводилось окрашивание согласно стандартным методикам с кроличьими моноклональными антителами к TsPO (Trevigen, разведение 1:400). Для визуализации использовалась система детекции Ready-to-Use (Novocastra) и диаминобензидин (Novocastra) в качестве хромогена. Подсчет положительно окрашенных клеток производили при увеличении х400 с помощью микроскопа Olympus BX-41. Определяли процент положительно окрашенных клеток на 100 клеток.
ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). Для определения уровня экспрессии TsPO использовался метод ПЦР в реальном времени. Для этой цели из клеток меланомы после инкубации с РК11195 и клеток контрольной группы выделяли РНК с помощью набора для выделения РНК «Рибо-золь-В» (AmpliSens) в соответствии с инструкцией производителя, после выделения РНК осуществлялась реакция обратной транскрипции с использованием комплекта реагентов «Реверта» (AmpliSens). Синтезированную в результате обратной транскрипции кДНК непосредственно использовали для постановки ПЦР в реальном времени, применяя специфичные праймеры к TsPO и ß-актину в качестве эндогенного контроля (TaqMan, Applied Biosystems). Амплификацию и детекцию осуществляли методом ПЦР в реальном времени на приборе StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Качественные результаты РТ ПЦР были проанализированы по методу сравнения ACt, который определяет амплификационный цикл, во время которого флюоресценция образца стала достоверно выше базального сигнала. Мы выполняли соответствующую оценку TsPO
Таблица
Уровни апоптоза и экспрессии TsPO в клетках меланомы SK-MEL1 после инкубации с РК11195 по результатам иммуноцитохимического исследования
Контроль После инкубации с РК11195 в концентрации
10 ^mol/L 100 nmol/L 10 nmol/L
Число TsPO положительных клеток 8 % 85,8 %* 81,4 %* 68 %*
Число апоптоз-положительных клеток 5 % 26,6 %* 26 %* 24 %*
Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,001).
сигналов путем их нормализации к сигналам от Р-актина. Для достоверного сравнения уровня экспрессии мРНК TsPO в контроле и после лечения РК11195 использовали t-критерий Стьюдента. Программа термоциклирования осуществлялась при следующих условиях: Hold 50°C - 2 мин, Hold 95°C - 10 мин, 45 циклов: 95°C - 15 сек, 60°C - 1 мин.
Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью t-критерия Стью-дента.
Результаты и обсуждение
Для определения экспрессии TsPO после лечения клеток меланомы кожи специфическим лигандом РК11195 в концентрациях 10 imol/L, 10 и 100 nmol/L проводилось иммуноцитохими-ческое окрашивание клеток моноклональными антителами к TsPO. Уровень экспрессии определялся процентом положительно-окрашенных клеток. При этом наблюдалось золотистокоричневое окрашивание цитоплазмы. Показано, что после лечения TsPO лигандом РК11195 во всех концентрациях происходило достоверное увеличение уровня экспрессии белка в сравнении с контрольной группой (таблица).
Анализ экспрессии TsPO с помощью ПЦР в реальном времени в клетках меланомы кожи после воздействия лигандом РК11195 во всех концентрациях выявил также повышение уровня экспрессии мРНК, но при этом достоверное увеличение экспрессии в 3 раза происходило только после лечения РК11195 в концентрации 100 nmol/L (р<0,05). Таким образом, мы подтвердили результаты иммуноцитохимического исследования и выявили изменения уровня экспрессии TsPO в клетках меланомы кожи SK-MEL-1.
Однако при анализе полученных данных было отмечено, что РК11195 в концентрации 10 imol/L
максимально увеличивал уровень белка ТsРО в клетках меланомы, при этом экспрессия мРНК была минимальной по сравнению с другими концентрациями РК11195. Этот факт можно объяснить тем, что микромолярная концентрация РК11195 могла вызвать ингибирование экспрессии TsPO на уровне транскрипции мРНК, но при этом оказывать стимулирующий эффект на процесс рибосомальной трансляции белка TsPO. Для подтверждения данных изменений требуются дополнительные исследования.
Кроме того, был проведен анализ изменения уровня апоптоза в клетках меланомы кожи после воздействия лигандом РК11195. Было определено пятикратное повышение уровня апоптоза после лечения РК11195 во всех концентрациях, при этом значения опытной группы достоверно отличались от значений контрольной группы (таблица). Полученные данные о применении специфического лиганда РК11195 в качестве проапоптотического агента в составе комбинированной терапии злокачественных опухолей, в том числе меланомы кожи, дают надежду на успешное преодоление механизмов химиорезистентности. Повышение уровня экспрессии TsPO с параллельным увеличением уровня апоптоза в культуре клеток SK-MEL-1 после лечения TsPO лигандом РК11195 в наномо-лярной концентрации 100 птої^ указывает на возможность использования ТзРО в качестве патогенетической мишени для активации апоп-тоза клеток меланомы кожи.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности (ККФН и НТД доп. согл. № 07/10 от 30.09.10).
ЛИТЕРАТУРА
1. Пак Д.Д., Белова Е.А., Лазутина Т.Н. Исследование сторожевых лимфатических узлов у больных с меланомой кожи // Российский онкологический журнал. 2008. № 4. С. 22-28.
2. DecaudinD., CastedoM.,NematiF. etal. Peripheral Benzodiazepine Receptor Ligands Reverse Apoptosis Resistance of Cancer Cells in Vitro and in Vivo // Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 1388-1393.
3. Garbe C., Eigentler T.K. Diagnosis and treatment of cutaneous melanoma: state of the art 2006 // Melanoma Res. 2007. Vol. 17. P. 117-127.
4. Hersey P. Apoptosis and melanoma: how new insights are effecting the development of new therapies for melanoma // Curr. Opin. Oncol. 2006. Vol. 18. P. 189-196.
5. Losina E., Walensky R.P., GeUer A. et al. Visual Screening for Malignant Melanoma.A Cost-effectiveness Analysis // Arch. Dermatol. 2007. Vol. 143. P. 21-28.
6. Naghma Khan, Farrukh Afaq, Hasan Mukhtar. Apoptosis by dietary factors: the suicide solution for delaying cancer growth // Carcinogenesis. 2006. Vol. 28 (2). P. 233-239.
7. Soengas M.S., Lowe S.W. Apoptosis and melanoma chemoresist-ance // Oncogene. 2003. Vol. 22. P. 3138-3151.
8. Veenman L., Papadopoulos V, GavishM. Channel-Like Functions of 18-kDa Translocator Protein (TSPO): Reguation of Apoptosis and steroidogenesis as Part of the Host-Defense Response // Current Pharm. Des. 2007. V. 13. P. 2385-2405.
Поступила 16.11.10
