CC BY
23УДК: 618.2:612.115:546.172.6-31-57.085.2
ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ У НЕБЕРЕМЕННЫХ И БЕРЕМЕННЫХ ЖЕНЩИН ПОД ВЛИЯНИЕМ ОКСИДА АЗОТА IN VITRO
Клычева М. М., Назаров С. Б., Кузьменко Г. Н., Ситникова О. Г.
ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Минздрава России, 153045, г. Иваново, Россия
Для корреспонденции: Клычева Майя Михайловна, младший научный сотрудник лаборатории клинической биохимии и генетики ФГБУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова» Минздрава России, E-mail: maya.klycheva@yandex.ru
For correspondence: junior researcher of laboratory of clinical biochemistry and genetics, Ivanovo Research Institute of Maternity and
Childhood named V. N. Gorodkov, E-mail: maya.klycheva@yandex.ru
Information about authors:
Klycheva M.M. orcid.org/0000-0002-1725-8505
Nazarov S.B. orcid.org/0000-0003-1545-7655
Kuzmenko G.N. orcid.org/0000-0001-5772-9271
Sitnikova O.G. orcid.org/0000-0003-2604-0724
РЕЗЮМЕ
Исследование проведено на 20 образцах крови практически здоровых женщин (1 группа) и 50 образцах крови женщин с физиологически протекающей беременностью в срок гестации 38-40 недель (2 группа). Для выявления особенностей свертывания плазмы крови у женщин использовали метод тромбоэластографии. Небеременные и беременные женщины были классифицированы в зависимости от изменения значения показателя R после стимуляции донатором оксида азота SIN-1 in vitro. Относительное изменение показателя R тромбоэластограммы - Д R (у.е.) после инкубации с SIN-1 составило -13,1 [-25,5; 8,52]. Установлено, что способность тромбоцитов реагировать на антиагрегатное действие оксида азота in vitro различается у небеременных и беременных женщин. Выявлены индивидуальные особенности действия донатора оксида азота SIN-1 у небеременных женщин и женщин с физиологической беременностью на свертывание плазмы крови in vitro. Результаты исследований ТЭГ в плазме крови демонстрируют более сильный коагуляционный потенциал в подгруппе женщин с угнетающим действием донатора оксида азота как среди небеременных и беременных женщин.
Ключевые слова: физиологическая беременность, свертывание крови, оксид азота.
INDIVIDUAL FEATURES OF CHANGE OF INDICATORS OF BLOOD COAGULATION IN NONPREGNANT AND PREGNANT WOMEN UNDER THE INFLUENCE OF NITRIC OXIDE IN VITRO
Klycheva M. M., Nazarov S. B., Kuzmenko G. N., Sitnikova O. G.
Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood named V.N. Gorodkov, Russia
SUMMARY
The study was conducted on 20 blood samples of healthy women (group 1) and 50 blood samples of women with physiological pregnancy in the gestational age 38-40 weeks (group 2). To identify the characteristics of blood plasma coagulation in women used a method of thromboelastography. Nonpregnant and pregnant women were classified according to changes in the values of the index R after stimulation with a nitric oxide formula like SIN-1 in vitro. The relative index R of tromboelastogramma - Д R (in.e.) after incubation with SIN-1 amounted to -13,1 [-25,5; 8,52]. It is established that the ability of platelets to respond to effect the action of nitric oxide in vitro differs in nonpregnant and pregnant women. Identified individual characteristics of the actions of the nitric oxide formula SIN-1 in nonpregnant women and women with physiological pregnancy on the coagulation of blood plasma in vitro. The results of the studies of TEG in plasma exhibit a more powerful coagulation capability in a subgroup of women with a depressing effect of donator of nitric oxide as among nonpregnant and pregnant women.
Key words: physiological pregnancy, blood clotting, nitric oxide.
Оксид азота (N0) является важным биологическим медиатором, опосредующим множество физиологических и патофизиологических процессов. Основная функция N0 связана с вазодилятацией и торможением процесса агрегации и адгезии тромбоцитов и выступает в качестве вещества, улучшающего микроциркуляцию за счёт расслабления гладких мышц сосудов и улучшения реологических свойств крови [1]. Донаторы оксида азота тормозят увеличение Са2+ в тромбоцитах, индуцирован-
ное агонистами и приводят к снижению агрегации [2]. Различные донаторы оксида азота, в том числе 3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1), ингибируют агрегацию тромбоцитов как цГМФ-зависимыми, так и цГМФ-независимыми путями [3, 4, 5]. SIN-1 является активным метаболитом молсидомина. Молсидомин в настоящее время является основным клинически актуальным представителем сиднониминов - класса лекарственных препаратов, аналогичных нитратам по своему
клинико-гемодинамическому действию, однако характеризующихся иной химической структурой. В молекулярном механизме действия сидноними-нов имеется немаловажное отличие от соответствующего механизма действия нитратов, а именно - отсутствие вовлечения сульфгидрильных групп для активации цАМФ - гуанилатциклазного комплекса [6].
Сохранение стабильной функции тромбоцитов зависит и от целостности реагирования на химически активные стимулы, тормозящие агрегацию. Как известно, различная способность тромбоцитов реагировать на антиагрегантное влияние NO, связана с изменениями в сигнальной системе NO/ цГМФ [7].
Целью работы явилось уточнение функциональных характеристик гемостаза у женщин с физиологической беременностью в зависимости от индивидуальной чувствительности тромбоцитов к действию донатора оксида азота SIN-1 в эксперименте in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на базе ФГБУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Исследование проведено на 20 образцах крови практически здоровых женщин (1 группа) и 50 образцах крови женщин с физиологически протекающей беременностью в срок гестации 38-40 недель (2 группа). Для анализа брали стабилизированную цитратом венозную кровь. В эксперименте использовали донатор оксида азота 3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1, Acros Organics). Для выявления особенностей свертывания плазмы крови у женщин использовали метод тромбоэластографии, динамично отображающий процесс коагуляции крови. Исследование проводили на анализаторе гемостаза ТЭГ 5000 (Haemoscope Corporation, USA). В две кюветы для тромбоэластографа вносили по 320 мкл богатую тромбоцитами плазму (PRP). В кювету № 1 добавляли 10 мкл физиологического раствора, а в кювету № 2-10 мкл раствора SIN-1 (0,8 мг/мл). Затем инкубировали образцы плазмы крови в термостате (37 ° С) в течение 1 часа. После инкубации проводили рекальцификацию плазмы крови 0,2 М раствором хлорида кальция и запись тромбоэластограммы. Тромбоэластограмму оценивали по параметрам образования сгустка: R (мин) - время с момента, когда образец был помещен в анализатор, до момента образования первых нитей фибрина; K (мин) - время с момента начала образования сгустка до достижения фиксированного уровня прочности сгустка (амплитуда 20 мм); angle а (о) - угол, построенный по касательной к тромбоэластограмме из точки образования сгустка; MA (мм) - максимальная амплитуда (наиболь-
ший диаметр сгустка); ТМА (мин) - время достижения максимальной амплитуды (рис. 1).
тромбоэластограммы.
Небеременные и беременные женщины были классифицированы в зависимости от изменения значения показателя R после стимуляции оксидом азота in vitro. Относительное изменение показателя R тромбоэластограммы - A R (у.е.) после инкубации с SIN-1 составило -13,1 [-25,5; 8,52]. Для выявления индивидуальных особенностей небеременные женщины были разделены по данному критерию по границам доверительного интервала на подгруппы с низкой чувствительностью (подгруппа 1а), а также со стимулирующим (подгруппа 1б) и угнетающим (подгруппа 1в) действием донатора оксида азота на свертывание крови. Нижняя граница нормы у небеременных женщин составила -25,5, а верхняя 8,52. По данному критерию были разделены и беременные женщины на подгруппы: подгруппа 2а - беременные женщины с низкой чувствительность к действию SIN-1; подгруппа 2б - женщины со стимулирующим действием оксида азота на свертывание плазмы крови; подгруппа 2в - женщины с угнетающим действием оксида азота на свертывание плазмы крови. После этого оценивали параметры тромбоэластограммы у этих женщин. Исключались из исследования женщины с тяжелыми формами патологии беременности и экс-трагенитальной патологии, сопровождающиеся нарушениями гемостаза; применяющие лекарственные средства, влияющих на свертывание крови и функцию тромбоцитов и с активной инфекцией.
Данные представлены в виде медианы, а также 25-го и 75-го перцентилей [Ме (25-75%)]. Результаты исследования обработаны методами непараметрической статистики с применением критерия Манна-Уитни при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты исследований ТЭГ в плазме крови демонстрируют более сильный коагуляционный
потенциал у беременных женщин в поздние сроки гестации, что является общеизвестным [8, 9]. Физиологическая гиперкоагуляция крови у здоровых беременных, достигающая максимального развития к концу III триместра, носит адаптационный характер. Запись тромбоэластограммы небеременных и беременных женщин показала, что инкубация богатой тромбоцитами плазмы с донатором оксида азота БШ-1 приводит к изменению показателей ТЭГ. При этом у женщин в двух группах БШ-1 вызывал разнонаправленное изменение показателя Д Я (у.е.) [10]. У 50 % небеременных женщин подгруппы 1а наблюдалась низкая чувствительность к оксиду азота, у 25 % БШ-1 оказывал стимулирующее действие (подгруппа 1б) и у 25 % - угнетающее действие (подгруппа 1в) на свертывание плазмы крови. Разделение по данному критерию беременных женщин не выявило достоверных изменений в соотношении статистических групп (у 48 % женщин - низкая чувствительность к
действию БШ-1, подгруппа 2а; у 29 % - стимулирующее действие Бт-1 на свертывание плазмы крови, подгруппа 2б и у 23 % - угнетающее, подгруппа 2в).
ОБСУЖДЕНИЕ
По данным исследований выявлено, что у небеременных женщин в подгруппе 1в показатели тромбоэластограммы Я и К, характеризующие время свертывания, достоверно ниже, чем у женщин подгруппы 1а (данные исследования представлены в таблице).
Возможно, это связано с более сильной активностью ферментных систем плазмы на стадии инициирования и усиления коагуляции. Время начальной активации тромбина Я у данных женщин укорочено и по сравнению с женщинами из подгруппы 1б. ТМА у женщин подгруппы 1в также укорочено, что свидетельствует об ускорении процессов образования фибрина, а МА выше, что указывает на повышенную функциональную активность тромбоцитов.
Таблица
Особенности показателей тромбоэластограммы женщин в зависимости от изменения показателя R,
под влиянием SIN-1
Группы n Параметр
женщин R, мин K, мин Angle, ° МА, мм ТМА, мин
1а 10 21,1 6,55 33,6 56,3 49,7
[16,4; 23,9] [6,00; 8,60] [27,3; 38,7] [50,6; 63,3] [44,6; 53,5]
1б 5 19,3 6,60 28,4 60,4 52,3
[15,7; 22,1] [6,20; 7,70] [27,5; 36,0] [58,8; 60,8] [48,8; 63,9]
1в 5 12,8 4,20 43,8 64,7 41,0
[8,80; 13,7]**# [3,20; 5,40]* [39,2; 48,6] [61,7; 68,8]*# [36,6; 44,3]*#
2а 48 16,8 4,50 43,9 74,6 47,7
[12,8; 21,1] [3,30; 6,30] [35,4; 48,0] [71,6; 76,7] [40,8; 53,5]
2б 23 18,6 5,45 40,1 73,0 50,7
[17,6; 19,4] [4,20; 6,20] [33,5; 42,6] [69,5; 76,3] [49,8; 57,6]
2в 29 12,2 4,70 44,5 70,3 41,8
[10,8; 16,1]—° [3,20; 6,30] [37,3; 53,1] [66,6; 74,7] [38,5; 46,1]»»»
Примечание: * - различия достоверны по сравнению с подгруппой 1а: * - р < 0,05, ** - р < 0,01; # - различия достоверны по сравнению с группой 1б: # - р < 0,05; ■ - различия достоверны по сравнению с группой 2а: ■ - р < 0,05; ◦ - различия достоверны по сравнению с группой 2б: 000 - р < 0,001.
У беременных женщин различий между подгруппами меньше. Так, у женщин подгруппы 2в с угнетающим действием БШ-1 время Я наступает быстрее по сравнению с женщинами подгруппы 2а и 2б, т.е. процесс тромбинообразования повышен. Время наступления максимальной амплитуды ТМА у женщин подгруппы 2в короче, чем у женщин подгруппы 2б, что свидетельствует о сильном коагуляционном потенциале женщин данной подгруппы. Отсутствие различий в показателях МА и ТМА среди подгрупп беременных женщин свидетельствует о повышении функциональной активности тромбоцитов у всех здоровых беременных женщин.
ВЫВОДЫ
1. Способность тромбоцитов реагировать на антиагрегатное действие оксида азота in vitro различается у небеременных и беременных женщин.
2. Выявлены индивидуальные особенности действия донатора оксида азота SIN-1 у небеременных женщин и женщин с физиологической беременностью на свертывание плазмы крови in vitro.
3. Результаты исследований ТЭГ в плазме крови демонстрируют более сильный коагу-ляционный потенциал в подгруппе женщин с угнетающим действием донатора оксида азота как среди небеременных и беременных женщин.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Клычева М. М., Назаров С. Б., Кузьменко Г. Н., Ситникова О. Г., Попова И. Г., Малышкина А. И. Влияние донатора оксида азота и адреналина на гемокоагуляцию и его особенности у женщин в поздние сроки беременности. Тромбоз, гемостаз и реология. 2015; 4(64):59-62.
2. Crane M. S, Rossi A. G, Megson I. L. A potential role for extracellular nitric oxide generation in cGMP-independent inhibition of human platelet aggregation: biochemical and pharmacological considerations. Br. J. Pharmacol. 2005; 144:849-859. doi:10.1038/ sj.bjp.0706110.
3. Priora R., Margaritis A., Frosali S., Coppo L., Summa D., Giuseppe D. D., Aldinucci C., Pessina G., Stefano A. D., Simplicio P. D. In vitro inhibition of human and rat platelets by NO donors, nitrosoglutathione, sodium nitroprusside and SIN-1, through activation of cGMP-independent pathways. Pharmacol. Res. 2011; 64:289-297. doi:10.1016/j.phrs.2011.03.014.
4. Roy B., Garthwaite J. Nitric oxide activation of guanylyl cyclase in cells revisited. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006; 103:12185-12190. doi_10.1073_ pnas.0602544103.
5. Cardoso M. H. M., Morganti R. P., Lilla S., Murad F., Nucci G. D., Antunes E., Marcondes S. The role of superoxide anion in the inhibitory effect of SIN-1 in thrombin-activated human platelet adhesion. European Journal of Pharmacology. 2010; 627:229234. doi:10.1016/j.ejphar.2009.10.060.
6. Korner A., Ol'binskaia L. I., Sizova Zh. M., Morozov Iu. A. The physicochemical properties of molsidomine preparations and their efficacy in treating IHD and circulatory failure. Ter. Arkh. 1995;67(8): 25-27.
7. Chirkov Y. Y., Holmes A. S., Chirkova L. P., Horowitz J. D. Nitrate resistance in platelets from patients with stable angina pectoris. Circulation. 1999; 100:129-134. doi.org/10.1161/01.CIR.100.2.129.
8. Polak F., Kolnikova I., Lips M., Parizek A., Blaha J., Stritesky M. New recommendations for thromboelastography reference ranges for pregnant women. Tromb. Res. 2011; 128:14-17. doi:10.1016/j. thromres.2011.04.007.
9. Sharma S., Uprichard J., Moretti A., Boyce H., Szydlo R., Stocks G. Use of thromboelastography to assess the combined role of pregnancy and obesity on coagulation: a prospective study. Int. J. Obstet. Anesth. 2013; 22:113-118. doi.org/10.1016/j.ijoa.2012. 12.004.
10. Кузник Б. И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии: монография. Чита: Экспресс-издательство; 2010.
REFERENCES
1. Klycheva M. M., Nazarov S. B., Kuzmenko G. N., Sitnikova O. G., Popova I. G., Malyshkina A. I. Effect of nitric oxide donator and adrenaline on hemocoagulation and its peculiaritiesat women in late pregnancy. Tromboz, gemostaz i reologiya. 2015; 4(64):59-62. (In Russ).
2. Crane M. S, Rossi A. G, Megson I. L. A potential role for extracellular nitric oxide generation in cGMP-independent inhibition of human platelet aggregation: biochemical and pharmacological considerations. Br. J. Pharmacol. 2005; 144:849-859. doi:10.1038/ sj.bjp.0706110.
3. Priora R., Margaritis A., Frosali S., Coppo L., Summa D., Giuseppe D. D., Aldinucci C., Pessina G., Stefano A. D., Simplicio P. D. In vitro inhibition of human and rat platelets by NO donors, nitrosoglutathione, sodium nitroprusside and SIN-1, through activation of cGMP-independent pathways. Pharmacol. Res. 2011; 64:289-297. doi: 10.1016/j. phrs.2011.03.014.
4. Roy B., Garthwaite J. Nitric oxide activation of guanylyl cyclase in cells revisited. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006; 103:12185-12190. doi_10.1073_ pnas.0602544103.
5. Cardoso M. H. M., Morganti R. P., Lilla S., Murad F., Nucci G. D., Antunes E., Marcondes S. The role of superoxide anion in the inhibitory effect of SIN-1 in thrombin-activated human platelet adhesion. European Journal of Pharmacology. 2010; 627:229234. doi:10.1016/j.ejphar.2009.10.060.
6. Korner A., Ol'binskaia L. I., Sizova Zh. M., Morozov Iu. A. The physicochemical properties of molsidomine preparations and their efficacy in treating IHD and circulatory failure. Ter. Arkh. 1995;67(8):25-27.
7. Chirkov Y. Y., Holmes A. S., Chirkova L. P., Horowitz J. D. Nitrate resistance in platelets from patients with stable angina pectoris. Circulation. 1999; 100:129-134. doi.org/10.1161/01.CIR.100.2.129.
8. Polak F., Kolnikova I., Lips M., Parizek A., Blaha J., Stritesky M. New recommendations for thromboelastography reference ranges for pregnant women. Tromb. Res. 2011; 128:14-17. doi:10.1016/j. thromres.2011.04.007.
9. Sharma S., Uprichard J., Moretti A., Boyce H., Szydlo R., Stocks G. Use of thromboelastography to assess the combined role of pregnancy and obesity on coagulation: a prospective study. Int. J. Obstet. Anesth. 2013; 22:113-118. doi.org/10.1016/j.ijoa.2012.12.004.
10. Кузник Б. И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии: монография. Чита: Экспресс-издательство; 2010. Kuznik B. I. Kletochnye i molekulyarnye mekhanizmy regulyatsii sistemy gemostaza v norme i patologii: monografiya. Chita: Ekspress-izdatel'stvo; 2010. (In Russ).
