CC BY
20Заключение: Полученные результаты говорят о том, что обогащенные и обедненные по CD133 культуры по-разному реагируют на добавление исследованных факторов, в частности, культура G01 CD133+ является более устойчивой, что подтверждает наличие у нее свойства стволовости. Найденная комбинация аптаме-ра bi- (AID-1-T) с индукторами нейральной дифференцировки LDN-193189, SB431542, Purmorphamine и нейротрофическим фактором BDNF способствует полному ингибированию пролиферации опухолевых стволовых клеток глиомы, что при клиническом применении может снизить вероятность рецидивов глиобластомы.
Список литературы:
1. Batash R. Glioblastoma Multiforme, Diagnosis and Treatment; Recent Literature Review/Batash R., Asna N., Schaffer P., Francis N., Schaffer M.//Current Medicinal Chemistry — 2017. — Т. 24 — № 27 — С. 3002—3009.
2. Delgado-Lopez P. D. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities/Delgado-Lopez P. D., Corrales-Garcia E. M.//Clinical and Translational Oncology — 2016. — Т. 18 — № 11 — С. 1062—1071.
3. Singh S. K. Identification of human brain tumour initiating cells/Singh S. K., Hawkins C., Clarke I. D., Squire J. A., Bayani J., Hide T., Hen-kelmanR. M., Cusimano M. D., Dirks P. B.//Nature — 2004. — Т. 432 — № 7015 — С. 396—401.
4. Brescia P. CD133 is essential for glioblastoma stem cell maintenance/Brescia P., Ortensi B., Fornasari L., Levi D., Broggi G., Pelic-ci G.//Stem Cells — 2013. — T. 31 — № 5 — С. 857—69.
УДК 612.821
Корягина А. А.1, Спивак Ю. С. 1, Буянова А. А.1, Большаков А. П.1, Дашинимаев Э. Б.2, Гуляева Н. В.1, Степаничев М. Ю.1
1 ФГБУН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия
2 ФГБУН Институт биологии развития им. Н. Н. Кольцова РАН, Москва, Россия
Koryagina A. A.1, Spivak Yu. S. 1, Buyanova A. A.1, Bolshakov A. P.1, Dashinimaev E. B.2, Gulyaeva N. V.1, Stepanichev MYu.1
1 Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology RAS, Moscow, Russia
2 Kol'tsov Institute of Developmental Biology, RAS, Moscow, Russia E-mail: koraljona3@gmail.com
ИНАКТИВАЦИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ХОЛИНАЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9
CHOLINE ACETYLTRANSFERASE GENE INACTIVATION USING THE CRISPR/CAS9 SYSTEM
DOI
Аннотация: Холинергические нейроны ядер переднего мозга обладают способностью синтезировать два классических медиатора: ацетилхолин (АХ) и гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК). Для исследования роли холинергических нейронов, в основном, используются различные токсины, действие которых приводит к повреждению и гибели нервных клеток. Такой подход не позволяет выделить функциональную роль каждого из медиаторов в исследуемых процессах. Поэтому для понимания вклада каждого из этих медиаторов в функции мозга необходимо наличие моделей, которые позволяют инактивировать одну нейромедиаторную систему при относительной сохранности второй. В ходе выполнения работы планируется разработать подход на основе системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 для локального ингибирования синтеза АХ в нейронах, при сохранности структуры и функциональных свойств самих клеток.
Ключевые слова: холинацетилтрансфераза, мозг, CRISPR/Cas9, геномное редактирование
Abstract: Forebrain cholinergic neurons can release two neurotransmitters: acetylcholine (ACh) and gamma-aminobutyric acid (GABA). Previously, role of cholinergic neurons was studied using various toxins that lead to damage and death of neurons. However, this approach does not allow to differentiate the functional role of each of two neurotransmitters. To shed light upon the individual neurotransmitter contribution to brain function it is necessary to develop models for inactivation of one neurotransmitter with saving another. In current work, we planned to develop a system on the basis of genome editing CRISPR/Cas system for local inhibition of ACh synthesis in neurons which makes it possible to preserve structures and functional properties of neurons.
Keywords: choline acetyltransferase, brain, CRISPR/Cas9, genome editing
Холинергические нейроны ядер переднего мозга представляют собой уникальные клетки, обладающие способностью синтезировать два классических медиатора: ацетилхолин (АХ) и гамма-ами-номасляную кислоту (ГАМК) [1]. Показано, что эти клетки вовлечены в процессы, ассоциированные с регуляцией ритмической активности нейронов неокортекса и гиппокампа [2]. Кроме того, активность этих клеток важна для обучения и формирования памяти. Для исследования роли, которую играют холинергические нейроны в том или ином процессе, в основном, используются различные токсины, действие которых приводит к повреждению и гибели нервных клеток [3,4]. Поскольку холинергические нейроны могут быть источником двух медиаторов, гибель клеток не позволяет выделить функциональную роль каждого из медиаторов в исследуемых процессах. Поэтому для понимания вклада каждого из этих медиаторов в функции мозга необходимо наличие моделей, которые позволяют инактивировать одну нейромедиаторную систему при относительной сохранности второй. Подобная модель не только позволит исследовать роль одной из сохранившихся медиаторных систем, но и выявить особенности функционирования нейронов с частично утраченным фенотипом. В ходе выполнения работы предполагается разработать подход, благодаря которому будет возможно локально ингибировать синтез АХ в нейронах, при сохранности структуры и функциональных свойств самих клеток. Такое исключение холинергической составляющей позволит пронаблюдать изменения в нейронах и их проекционных областях в отсутствие действия других повреждающих факторов.
Целью настоящей работы является разработка и создание системы на основе CRISPR/Cas9 для удаления части гена, кодирующего холинацетилтрансферазу (CHAT) и приводящего к инактивации этого гена, в головном мозге мыши и проверка ее функциональности на клетках нейробластомы.
Методика: Работа включала в себя эксперименты, проведенные на культуре клеток нейробластомы мыши NB41A3 и Neuro2A, полученных из Российской коллекции клеточных культур (ИЦ РАН, С.-Петербург, РФ), и на мышах линии C57B1/6 (ООО "Кро-линфо", Московская обл., РФ). Культивацию клеток NB41A3 проводили в среде F10, содержащей 10 % сыворотки FBS и смесь антибиотиков и антигрибковых препаратов, а клеток Neuro2A — в среде DMEM, содержащей 10 % сыворотки FBS. Дифференцировку клеток осуществляли добавлением фактора роста нервов (nerve
growth factor, NGF) в концентрации 20 нг/мл в течении 48 ч. Клетки фотографировали через 48 ч с помощью инвертированного микроскопа Keyence (Keyence Corporation of America, USA) в условиях фазовоконтрастного освещения. Оценку морфологических показателей дифференцировки проводили с использованием программы FIJI (NIH, USA). Для оценки наличия маркеров холинер-гической трансмиссии использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), иммуноблотинг и иммуногистохическое окрашивание клеток.
Для доставки системы CRISPR/Cas9 в клетки использовались плазмиды pAAV-EFS-myc-SpCas9, pAAV-U6-gRNA-CMV-GFP, отвечающие за экспрессию белка SpCas9 и гидовых РНК, соответственно. Для оценки работоспособности этой системы проводили котранс-фекцию клеток Neuro2A вышеуказанными плазмидами с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) согласно протоколу производителя. Клеточная популяция, экспрессирующая GFP, была отобрана методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS). Далее методом ПЦР проводили амплификацию фрагмента гена CHAT, включающего делецию, клонирование этого фрагмента, отбор клонов и секвенирование по Сэнгеру.
Наработку и очистку AAV проводили согласно протоколу Grieger et. al [5], с минимальными модификациями. Коротко, клетки HEK293TN растили в среде DMEM с добавлением 10 % FBS до кон-флюентности 60—80 %, за 1 ч до трансфекции среду меняли на бессывороточную, далее клетки котрансфицировали плазмидами pHelper, pAAV2/9n-Rep/Cap и целевыми плазмидами pAAV с ITR. В качестве трансфицирующего агента использовали разветвленный PEI (Sigma-Aldrich, USA). Через 4 ч после трансфекции проводили смену среды на DMEM с FBS. Через 72 ч клетки механически собирали и лизировали методом заморозки/разморозки. Гомогенаты очищали от дебриса центрифугированием. Далее вирусные векторы очищали с использованием ультрацентрифугирования в градиенте йодиксанола.
В экспериментах in vivo использовали мышей C57BL/6. Животных анестезировали 4 % изофлураном (30—50 мл/мин) и помещали в стереотаксическую установку. Небольшое отверстие в черепе делали с помощью стоматологического бора. Инъекцию вирусных векторов (титр 1010 vg/ul) осуществляли с использованием 10-мкл микрошприца (Hamilton, USA) в медиальную сеп-тальную область мозга (координаты от брегмы: AP +0.8, L -1, H
-4,1, угол 14°). Объем инъекции составлял 2 мкл, скорость введения 0.5 мкл/мин, в течение введения микрошприц поднимали на 0.2 мм каждые 40 секунд.
Результаты: С помощью биоинформатического анализа были подобраны последовательности гидовых РНК (гРНК), позволяющие получить делецию длиной 41 пн в 7 экзоне гена CHAT. Для подтверждения работоспособности разработанной системы инактивации гена CHAT мы планировали протестировать ее на клеточных культурах, в которых есть экспрессия белка ХАТ. Получить первичную холинергическую культуру из мыши затруднительно в виду того, что холинергических нейронов довольно мало, поэтому было решено подобрать иммортализованную клеточную культуру с признаками холинергических нейронов. Согласно каталогу Российской коллекции клеточных культур существует 2 клеточные линии ней-робластомы мыши NB41A3 и Neuro2A, в которых по литературным данным детектируется активность ХАТ и ацетилхолинэстеразы [6]. Тем не менее, нам не удалось подтвердить наличие экспрессии мРНК и белка ХАТ, в том числе после проведения дифференциров-ки клеток. Таким образом, использование этих клеточных культуры для подтверждения изменений в функционировании гена ХАТ после внесения CRISPR/Cas9 в эти клетки остается под вопросом. Однако мы использовали эти клеточные культуры для детекции де-леции в геноме. В частности, наличие делеций в 7 экзоне гена CHAT было подтверждено данными секвенирования после трансфекции клеток Neuro2A указанными выше конструкциями для экспрессии белка Cas9 и гидовых РНК.
После адаптации и отработки протоколов наработки и очистки различных серотипов рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (rAAV) конструкции на базе rAAV2, rAAV8 и rAAV9 вводили в область септо-медиального ядра мозга мыши. Для дальнейшей работы был выбран серотип rAAV9, который показал наилучший результат по заражению нейронов медиального септума, что согласуется с литературными данными [7].
В дальнейшем эксперименте использовали систему, состоящую из двух вирусов: первый нёс ДНК для экспрессии белка Cas9 и маркерного белка myc-tag, второй — пару гРНК и GFP для получения заданной делеции. Эффективность заражения этими вирусами продемонстрировали в клеточных культурах HEK293TN и Neuro 2A, по уровню флуоресценции GFP. А также было показано, что введение созданных конструкций с медиальную септальную область со-
провождалось экспрессией маркеров (белков GFP и myc-tag) в нейронах медиальной септальной области.
Заключение: Таким образом, в этой работе были созданы вирусные векторы на основе rAAV9, которые дают возможность применить методику геномного редактирования с использованием CRISPR/Cas9 для направленной модификации генов в мозге животных и культуре клеток нервной ткани. С использованием системы CRISPR/Cas9 впервые удалось получить делецию в гене, кодирующем ХАТ, в клетках нейробластомы.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 20—015—00226).
Список литературы:
1. Takács V. T. et al. Co-transmission of acetylcholine and GABA regulates hippocampal states//Nat. Commun. 2018. Vol. 9, № 1. P. 2848.
2. Mitsushima D. Hippocampal Function and Gonadal Steroids. 2012.
3. Bolshakov A. P. et al. Saporin from Saponaria officinalis as a Tool for Experimental Research, Modeling, and Therapy in Neurosci-ence//Toxins. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2020. Vol. 12, № 9. P. 546.
4. Gulyaeva N. V. et al. Molecular and Cellular Mechanisms of Sporadic Alzheimer's Disease: Studies on Rodent Models in vivo//Biochemis-try. 2017. Vol. 82, № 10. P. 1088—1102.
5. Grieger J. C., Choi V. W., Samulski R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors//Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 3. P. 1412—1428.
6. Thompson J. M., London E. D., Johnson J. E. Jr. Ultrastructural, functional and biochemical characteristics of mouse and human neuro-blastoma cell lines//Neuroscience. 1982. Vol. 7, № 7. P. 1807—1815.
7. Haery L. et al. Adeno-Associated Virus Technologies and Methods for Targeted Neuronal Manipulation//Front. Neuroanat. 2019. Vol. 13. P. 93.
