CC BY
67
Имплантат - носитель клеточного материала из пористого проницаемого титана
В.И. Итин1, ГА. Прибытков 2, И.А. Хлусов 2, Л.В. Загребин 3, С.С. Шестов 3
10тдел структурной макрокинетики Томского научного центра СО РАН
2 Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск
3 ООО «Центр информационно-клеточной медицины», Москва
V.I. Itin1, G.A. Pribytkov2, I.A. Khlusov2, L.V. Zagrebin 3, S.S. Shestov 3 Implant-Carrier of Cells Made of Porous Permeable Titanium
1 Structural Macrokynetic Department of Tomsk Scientific Senter (SD RAS);2 Institute of Physics Durability and Materialresearch, Tomsk; 3 Information-Cellular Medicine Center Lmd., Moscow
В работе проведен анализ свойств нового материала для изготовления имплантатов — пористого титана. Показано, что материал обладает достаточными механическими свойствами. Поглощение биологической жидкости составляло 7,5%. Материал совместим с живыми клетками. При культивировании клеток костного мозга мыши и фетальных человеческих гепатоцитов в условиях дексто-ровской системы и In vivo у мышей, такой имплантат функционирует как очаг гемопоэза в течение всего срока наблюдений — до 9 мес. Получены данные о депрессирующем влиянии на рост и развитие лимфом. Таким образом, данный материал можно рассматривать как перспективный носитель для клеток в трансплантологии и создания «искусственных органов».
Ключевые слова: пористый титан, культура клеток, имплантат-носитель.
В настоящее время клеточная и тканевая трансплантация рассматривается как перспективный метод лечения широкого спектра патологии, включая онкологические и он-когематологические заболевания. Тем не менее, существуют проблемы клеточной терапии [строгий отбор пациентов, иммунные реакции хозяина, расселение трансплантированных клеток в организме, быстрая их элиминация, краткосрочный эффект лечения), которые можно решить либо минимизировать с помощью применения носителей-инкубаторов для клеточного материала. Они позволяют ставить вопрос о возможности создания, выращивания и имплантации искусственных органов, пролонгации терапевтических эффектов трансплантированных клеток.
6-й мировой конгресс по биоматериалам, состоявшийся в США в 2000 г., обозначил различные направления поиска материалов для конструирования носителя, например, полимеры, керамику, металлы. В практике наших лечебных учреждений активно используется пористый титан, обладающий наиболее оптимальными физико-химическими и биомедицинскими свойствами. В связи с этим экспериментальное и клиническое тестирование пористого титана [ПТ) как перспективного носителя для формирования гибридных имплантатов и искусственных органов представляет несомненный интерес.
Одно из основных направлений в проблеме создания функциональных неорганических материалов и конструкций для лечения различных заболеваний и травм связано с разработкой и исследованием искусственных аналогов тканей и отдельных органов, в частности, имплантатов, которые являются носителями [scaffold) клеточного материала, в первую очередь, стволовых клеток. Введение в организм такого имплантата-носителя повышает эффективность трансплантации клеточного материала по сравнению с инъекционным
The article presents the analysis of properties of a new material for implant production - porous titanium. It is demonstrated that the material possesses adequate mechanical characteristics. The absorption of biologic fluid was 7.5%. The material is compatible to living cells. While mouse bone marrow cells and fetal human hepatocytes were being cultured under Dextor system conditions and in vivo in mice such an implant functioned as a source of hemopoesis within the whole period of observation - up to 9 months. The data on depressing influence on growth and development of lymphomas were obtained. Thus, the material given can be considered as a perspective carrier for cells in transplantation and artificial organ creation.
Key words: porous titanium, cells culture, implant-carrier.
назначением, позволяет пролонгировать терапевтические эффекты трансплантированных клеток.
Для создания имплантатов-носителей [scaffold-технология] могут быть использованы различные материалы: графит, полимеры, керамика, металлы и их сплавы [1-6]. В связи со спецификой различных клеток и тканей организма каждый вид искусственных материалов может найти свою нишу. В частности в качестве имплантата-носителя клеточных культур применяют пористые проницаемые металлические материалы с памятью формы, например, пористый никелид титана [7-8], полученный методом самораспространяющегося высокотемпературного синтеза [9].
В состав этого сплава входит около 50 ат.% никеля. Известно, что никель является токсичным элементом, обладает аллергенной и канцерогенной активностью и около 15% людей характеризуются повышенной чувствительностью к нему. Этот металл в виде ионов 1\Л2+ оказывает сильное хе-миотоксическое действие на клетки организма и является биокатализатором, ускоряющим процесс деструкции протеинов плазмы крови. При имплантации никеля в организм достоверно установлены канцерогенная активность иона \|2+ и широкая зона воспалительных процессов, связанных с растворением никеля в тканевых жидкостях.
Несмотря на тот факт, что сплавы на основе никелида титана не подвергаются заметной коррозии, так как при пассивации в биологических жидкостях на их поверхности образуется слой, содержащий небольшое количество никеля, проблему их биосовместимости нельзя считать решенной.
Рекомендуемые в качестве материала носителей клеточного материала нержавеющая сталь и кобальт-хромовые сплавы [3] также оказывают сильное влияние на клеточные и внутриклеточные процессы. При превышении содержания железа выше физиологической нормы нарушаются
окислительно-восстановительные процессы в тканях, а ионы железа обладают цитотоксическим действием [11 ]. Ион хрома Сг+ имеет очень малый ионный радиус [0,47 А), легко проникает внутрь клетки через клеточные мембраны и взаимодействует с ДНК, вызывая мутации [10]. Ионы кобальта Со+ совместно с ионами хрома и/или никеля при высоких концентрациях приводят к некрозу клеток. Выживаемость клеток при содержании 400мг/моль никеля или кобальта равна нулю [11], в результате тест LCso [критерий цитотоксичности химических веществ) для этих элементов отсутствует.
Таким образом, сплавы, содержащие никель, кобальт и хром оказывают отрицательное воздействие на жизнеспособность клеточного материала.
Использованию титана в медицине посвящено огромное количество публикаций, в которых показана его биоинертность, причем увеличение содержания титана в организме на несколько порядков не оказывает аллергенного, канцерогенного или токсического воздействия [11]. В частности, не обнаружено цитотоксического эффекта при взаимодействии пористого титана с культурой клеток костного мозга [12]. Этот результат полностью подтверждает данные [13], полученные ранее в условиях in vitro при взаимодействии сплавов титана с культурой спинномозгового узла новорожденных крыс. Оказалось, что ионы титана не влияют на клеточные мембраны. Индекс биофункциональности В титана и его сплавов медицинского назначения заметно выше, чем других материалов, особенно керамик [В = а /Е, где а - предел выносливости, г. Е- модуль Юнга).
В настоящей работе предлагается в качестве материала имплантата-носителя клеточного материала взамен нержавеющей стали, кобальт-хромовых сплавов и сплавов на основе никелида титана использовать пористые проницаемые материалы на основе спеченного титана.
Материал и методы исследования
Использовали порошок титана с размером частиц менее 160 мкм и со следующим содержанием основных примесей [% вес): Fe < 0,330; О < 0,080; N < 0,033. После сушки в вакуумном сушильном шкафу при 300°С в течение 2 часов порошок спекали в вакууме 133-10"5 Па при различных температурах в интервале 1000-1300°С в течение
4 часов.
Вид порового пространства и химический состав спеченного титана изучали методами растровой электронной микроскопии и микрорентгеноспектрального анализа [Phillips SEM515 с приставкой EDAX EKOHIV).
Спеченные образцы в виде цилиндров диаметром 8 и высотой 12 мм испытывали на одноосное сжатие при скорости деформации 1 мм/мин, на испытательной машине «In-stron 5582» с реверсивным устройством.
Для тестирования гидрофобных и гидрофильных свойств пористого титана использованы конструкции с размерами 3,3^3,6x16 мм с общей пористостью 58% и размером пор около 100 мкм. Жидкостью насыщались интактные изделия, а также после насыщения 96° этанолом и отжига в пламени спиртовки. В качестве биологических жидкостей применялись: 1 - сбалансированный фосфатный буфер Дульбекко без ионов кальция и магния [жидкая среда); 2 -полная культуральная среда [ПКС) для клонирования клеток, включающая 1% метилцеллюлозы, 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 94% среды RPMI-1640 [полувязкая среда).
Степень насыщения образцов жидкостью определяли весовым способом. Масса исходных титановых изделий варьировала в пределах 329-442 мг.
Клетки костного мозга вымывали из бедренной кости мышей СВА/CaLac средой RPMI-1640 с 5% эмбриональной
телячьей сыворотки [ЭТС), разводили полной культуральной средой [без гидрокортизона) до требуемой концентрации жизнеспособных нуклеаров. Затем во взвесь миелокарио-цитов помещали ПТ. Через 24 часа ПТ переносили в другие пробирки, определяли число заселившихся в него клеток и выращивали в течение 6 недель при 37° С и 5% СО2 в культуральной среде следующего состава: 12,5% ЭТС, 12,5% лошадиной сыворотки, 300 мг/л L-глутамина, 2,5 х 10-5 М
2-меркаптоэтанола, 10-6 гидрокортизона гемисукцината и 75% RPMI-1640. Каждую неделю меняли половину среды [1 мл).
Подсчитывали число ядросодержащих, а также жизнеспособных миелоцитов в культуральной среде, оценивали морфологию клеток. Количество коммитированных прекурсоров грануломоноцитопоэза [КОЕ-ГМ) и гранулоцитопоэза [КОЕ-Г) в жидкой фазе определяли методом колониеобра-зования в метилцеллюлозной культуре при клонировании миелоцитов в течение 7 суток. В качестве стимуляторов роста применяли супернатант стимулированных ФГА сплено-цитов мыши [10%) в комбинации с рекомбинантным Г-КСФ человека [6 нг/мл).
«Искусственную эмбриональную печень» человека создавали in vitro путем засевания фетальных клеток печени 11-й недели гестации в конечной концентрации 20*106 на 1 пластину из ПТ. Под эфирным наркозом по одному «искусственному органу» имплантировали каждой из 20 3-месячных мышей линии AKR/JY. 20 животных составляли контрольную группу. Через 4 дня после трансплантации и на 4, 5, 7 и 9-й месяцы у мышей изучали состояние системы крови [костный мозг, периферическая кровь, тимус, селезенка), что требовалась для определения эффективности работы имплантатов и причин гибели животных.
Статистическую обработку результатов осуществляли согласно t-критерию Стьюдента и Т-критерию Вилкоксона. Интегральный показатель [ИП), характеризующий снижение [< 100%) либо увеличение [> 100%) суммы изучаемых показателей относительно их исходных величин, вычисляли как описано ранее.
Результатыы и их обсуждение
Микроструктура и деформационное поведение
пористого материала
Исследование рельефной топографии поверхности частиц порошка титана показывает, что они относятся к типичному губчатому морфологическому типу, при этом на гладких поверхностях частиц видны округлые выросты разных размеров [рис. 1). После спекания порошинки образуют каркас с открытыми порами, имеющими размер в интервале 50-200 мкм. Поры характеризуются неопределенной формой с морфологически слабо развитыми поверхностями, в значительной части наследующими форму и вид поверхности исходных частиц [рис. 2). Пористость спеченного материала составляет 50-65% в зависимости от режима спекания.
Данные микрорентгеноспектрального анализа, проведенного на изломах спеченного титана, показывают, что концентрация основных примесных элементов соответствует его содержанию в исходном порошке. Таким образом, спеченный титан полностью наследует состав порошка.
Характерная кривая «напряжение-деформация», описывающая упруго-пластическое поведение спеченного титана в условиях одноосного сжатия приведена на рис. 3. На кривой отчетливо выделяются участки упругой деформации, пластического течения и резкого падения нагрузки после достижения максимума. Падение нагрузки соответствует разрушению цилиндрического образца вследствие появления одной или нескольких диагональных трещин.
10 20 30
Деформация, %
Рис 3. Диаграмма одноосного сжатия спеченного титана
Полученные результаты показывают, что модуль Юнга и предел прочности пористого спеченного титана соответствуют показателям для некоторых видов тканей человека, например для губчатого вещества бедренной кости (ед = 68,7 - 147 МПа] [14].
Поглощение биологических жидкостей Результаты исследований поглощения биологических жидкостей ПТ представлены в табл. 1. Интактный ПТ практически не смачивается биологическими жидкостями. Были использованы два способа смачивания: 1 - опускание в жидкость («пассивное смачивание»]; 2 - насыщение пористой структуры жидкостью с помощью автоматического дозатора («активное смачивание»]. В обоих случаях поглощение жидкостей [как раствора Дульбекко, так и ПКС] не превышало
7,5-11,7% от массы изделия, что соответствовало 29-44 мкл [75-117 мкл на 1 г пористого металла]. Большая часть жидкости стекала по поверхности изделий, глубоко не проникая в пористую структуру. Интересен тот факт, что ПКС, проявляющая одновременно гидрофильные и гидрофобные свойства, также плохо всасывалась изделиями [на уровне 10,9 масс%]. Похожие данные были получены ранее при испытании ок-сидциркониевой керамики с пористостью около 60% [15]. Поглощение биологической жидкости составляло 7,5%.
Таблица 1. Результаты поглощения биологических
жидкостей (масс%) конструкциями из пористого
титана, X ± т,р
До отжига После отжига
9,6±0,81 29,03±4,90
п = 5 п = 4
р < 0,05
Примечание. Показаны статистические различия согласно t-критерию Стьюдента.
В другой серии опытов образцы из пористого титана смачивали 96° этиловым спиртом и отжигали в пламени спиртовки. После отжига результаты смачиваемости улучшились в 3-4 раза [см. табл. 1). В данном тесте жидкость активно входила в поры изделий. В случае применения раствора Дульбекко поглощение жидкости достигало 14,9-33,7 масс%. При использовании полувязкой ПКС данный показатель оставлял 32,4-35,1 масс% [323-351 мкл на 1 г пористого титана).
Полученные результаты показывают, что пористый титан наиболее пригоден как матрица для клеток при условии его отжига в пламени спиртовки.
Биологическая совместимость с клеточным
материалом
Поскольку гибридные имплантаты предполагают комбинацию биоматериала [-ов) и живых клеток для длительного нахождения в организме, на первом этапе мы изучили влияние ПТ на жизнедеятельность клеток in vitro и in vivo. Длительное культивирование клеток костного мозга [ДККМ] согласно модели, предложенной М. Dexter, оказалось удобной системой для изучения.
Результаты показали, что через 6 недель инкубации на ПТ in vitro доля выживших клеток костного мозга, продуцируемых из ячеек носителя в жидкую среду, варьировала в пределах 58-82%, что соответствовало цифрам 1 -й недели инкубации [рис. 4). При этом культура отдельных клеток на ПТ приобретала свойства, сближающие ее с нативной
тканью. Так, молодые, близкие по своим пролиферативным и дифференцировочным потенциям к стволовым, клетки [например, клетки-предшественники гранулоцитопоэза и гра-нуломоноцитопоэза, КОЕ-Г, КОЕ-ГМ] находятся внутри пор и плохо выходят в окружающую среду [так называемый костномозговой барьер] [рис. 5].
90
60
30
Рис. 4. Количество жизнеспособных клеток на пористом титане в условиях дексторовской культуры
1 -я 2-я 3-я 4-я 5-я
Н е д е л и
6-я
□ cells number ■ viable cells
40
30
20
10
0
Рис. 5. КОЕ-Г, КОЕ-ГМ выявляющиеся в жидкой фазе клеточной культуры на пористом титане
Н е д е л и □ concentration Htotal count
В дальнейшем изучалось поведение гибридных имплантатов [ПТ + фетальные гепатоциты человека] в организме мышей АКЯ/иУ и реакция животных, страдающих спонтанной Т-клеточной лимфомой. Лимфома имеет свойства и гематосаркомы, и солидной опухоли, что было удобным для аппроксимации полученных данных в онкологическую практику.
Оказалось, что имплантат успешно приживается, так как за исключением первоначального нейтрофильного лейкоцитоза, обусловленного стресс-реакцией на оперативное вмешательство, в последующие 3 месяца заметных колебаний лейкоцитарной формулы не наблюдалось. Более того, через
3-4 недели после введения в организм «искусственная печень» человека начинала активно функционировать. Об этом свидетельствует 3-кратное увеличение уровня эритроцитов с фетальным гемоглобином, происходящих из эритроид-ных прекурсоров фетальной печени и в норме практически не встречающихся у взрослых мышей [табл. 2]. Одним из
положительных эффектов является постимплантационная активация эритрона реципиентов, что проявлялось в увеличении [на 274%, Р<0,05] числа ретикулоцитов в крови. Кроме того, на 26% снижалась активность опухолевого процесса, что было обусловлено, по-видимому, развитием реакции «трансплантат против опухоли». Очень важным для дальнейших исследований следует признать развитие в 33% случаев реакции «трансплантат против хозяина» [РТПХ] [табл. 3].
С одной стороны, иммунологический конфликт свидетельствует о созревании фетальных ксеногенных клеток, слабо экспрессирующих антигены главного комплекса гистосовместимости, в зрелую иммуногенную ткань. В этом случае речь уже не может идти об эмбриональной терапии, сталкивающейся с острыми этическими проблемами. С другой стороны, зафиксированный уровень РТПХ при огромном количестве пересаженного мышам клеточного материала можно считать умеренным, по-видимому, вследствие иммуноизолирующих, барьерных свойств ПТ.
Таблица 2. Содержание эритроцитов с фетальным гемоглобином и ретикулоцитов (%о) у мышей после имплантации (Х±т) в периферической крови
Возраст мышей Фетальный гемоглобин Ретикулоциты
(мес.) контроль опыт контроль опыт
3 - - 8,8± 1,75 32,88± 6,58*
4 1,25± 0,37 3,19± 0,37* 10,5± 0,63 23,8± 3,65*
5 2,14± 0,49 3,83± 0,97 16,5± 2,74 19,5± 4,4
7 3,67± 1,29 7,00± 2,04 12,43±2,94 6,83± 4,94
Примечание: * - р<0,05
Оригинальные исследования
Таблица 3. Причины гибели мышей ДКИ/иУ в контрольной группе после имплантации
Г руппа Доля развития лимфом, % Общая летальность, % Летальность от иммунного конфликта, % Летальность от неизвестных причин, %
Контроль 70 50 0 10
Эксперимент 44 89 33 22
Таким образом, экспериментальный блок исследований показал, что в системах in vitro и in vivo отдельные клетки, пересаженные на ПТ, активно созревают и формируют единую тканевую структуру. Это позволяет перевести гибридные имплантаты, имеющие ПТ в качестве носителя, в разряд гибридных искусственных органов, предназначенных для временной, либо постоянной замены утраченной функции природного прототипа.
Безопасность имплантата-носителя клеточных культур из пористого титана оценена в испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий
ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов министерства здавоохранния и социального развития: «О токсикологических, санитарно-химических испытаниях, испытаниях на пирогенность, стерильность №036.0149.Р.05 от 23.06.05».
В результате испытаний показано, что имплантат-носитель для хирургического лечения внутренних органов не обладает местнораздражающим, сенсибилизирующим и токсическим действием, стерилен, соответствует требованиям, предъявляемым к изделиям, длительно контактирующим с внутренней средой организма.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Vacanti J.P., Vacanti C.A., Langer R.S. Neomorphogenesis of cartilage in vivo from cell culture. WO 901 2603; A61F2/30; A61 L27/00; C12N5/ 00. Publication data: 1 990-11 -01. Priority number: US 1 98903391 55 198-904-17.
2. Vacanti J.P.., Langer R.S., Johnson L., Griffith-Cima L. Method for implanting large volumes of cell on polymeric matrices. WO 9012604; A61L27/ 00 Publication date: 1990-11 -01. Priority number: US 19890343158 198904-25.
3. Mears D.C. Regeneration of living tissues by growth of isolated cells in porous implant and product thereof. United States Patent 4553272; A61F001/ 00 February 26.1981. November 19, 1985.
4. Caplan A.J., Haynesworth S.E. Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells. United States Patent 5197985. A61F002/28; A61K035/12 November 16, 1990. March 30, 1993.
5. Caplan A.J., Haynesworth S.E. Method for treating connective tissue disorder. United States Patent 5226914 A61F002/28; A61K035/12 November 16, 1990. July 13, 1993.
6. Fournier R.L., Goldblatt P.J., Horner J.M., Sarver J.G. Bioartificial pancreas. United States Patent 5387237 A61F002/02 A61F002/00; A61M037/00; A61M005/32 Jule 21, 1993. February 7, 1995.
7. Гюнтер В.Э., Дамбаев Г.Ц., Ходоренко B.H. и др. Носитель клеточных
культур искусственных внутренних органов. Патент РФ 2191607; 7A61L27/ 06; A61L27/56 Заявл. 2000.06.23. Опубл. 2002.10.27.
8. Дамбаев Г.Ц., Гюнтер В.Э., Загребин Л.В. и др. Имплантат для хирургического лечения заболеваний внутренних органов. Патент РФ 2143867; 7A61F2/02. заявл. 1997.11.12. 0публ.2000.01.10.
9. Итин В.И., Найбороденко Ю.С. Высокотемпературный синтез интерметаллических соединений. 1989; Томск: 214.
10. Ziats N., Miller K., Anderson J. In vitro and in vivo interaction of cells with biomaterials. Biomat. 1988; 9: 5-13.
11. Helsen J.A., Breme H.J. (ed) Metals as biomaterials. 1998; Chichester, John Willey & Sons: 498.
12. Бойко И.В., Сурков О.А., Кондратов A.A.. Вишневский В.A. Экспериментальное обоснование использования пористого титана в эндопротезировании. Ортоп., травматология и протезирование 1999; 1: 38-41.
13. Fetsch P., Bingmann D. Nervenzellen in vitro als Bioindikatoren fbr Gewebevertraglichkeit von Implantatmaterialen. Z. Zahnarztl. Implantol. 1988; 4(4): 266-9.
14. Березовский В.А., Колотилов Н.Н. Биофизические характеристики тканей человека. 1990; Киев: Наукова думка: 224.
15. Буякова С.П., Хлусов И.А., Кульков С.Н. Пористая циркониевая керамика для эндопротезирования костной ткани. Физическая мезомеханика 2004. 7(2): 127-30.
А
