CC BY
58
© Козлов И.Г., Тимаков МА., 2009
И.Г. Козлов1,2, М.А. Тимаков2 ИММУНОТЕРАПИЯ: ВЧЕРА, СЕГОДНЯ, ЗАВТРА
1 ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, 2 ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава, Москва
Первый смелый и очень успешный опыт вакцинации против оспы, проведенный Эдвардом Дженнером в 1796 г., привлек огромное внимание к возможности терапевтических воздействий на иммунную систему (ИС) и привел к быстрому развитию этой области в последующее столетие. Наряду с активной (вакцинация) были заложены основы пассивной иммуностимулирующей терапии (ИСТ) (антитоксин) (Э. Беринг и А. Кох, 1890) и намечены абсолютно новые для того времени принципы борьбы с инфекционными заболеваниями [1]. Спустя почти столетие после открытия Э. Дженнера в 1893 г. американский хирург Вильям Колей впервые использовал в медицинской практике неочищенный экстракт лизированных бактерий, получивший впоследствии название «Колей-токсин». С помощью данного препарата W. ^^у провел курс иммунотерапии 894 пациентам с подтвержденным диагнозом «карцинома» или «саркома» и добился 45%-го увеличения
5-летней выживаемости больных по сравнению с традиционными способами лечения. Таким образом, была намечена вторая группа заболеваний, при которых ИСТ могла значительно повысить эффективность существующих в то время методов лечения.
Трагичными для дальнейшего развития ИСТ событиями можно считать почти одновременное открытие в 30-х годах прошлого столетия антибиотиков и цитостатиков. Обе группы препаратов в силу своей очевидной эффективности вытеснили ИСТ сначала из области инфекционных заболеваний (за исключением вакцинопрофилактики), а впоследствии и из онкологии. Во многом этому способствовали «отставание» фундаментальных знаний об иммунологических механизмах защиты и отсутствие понимания роли ИС в гомеостазе организма.
Однако несколько десятилетий применения в медицине антиинфекционных этиотропных и про-
тивоопухолевых цитостатических лекарственных препаратов в очередной раз не оправдали «больших ожиданий». Безусловно, удалось достигнуть убедительного прогресса в борьбе с эпидемиями и особо опасными инфекциями, но вместе с тем и сегодня инфекционные заболевания остаются лидирующими по частоте возникновения и по-прежнему «омрачают» статистику смертности. Опять же очевидно, что применение цитостатиков в значительной степени повысило среднюю выживаемость онкологических больных и продемонстрировало возможность излечения от опухолей, но не решило проблему в целом. Самые современные схемы цитостатической терапии имеют ограничения и не гарантируют 100%-го эффекта при целом ряде опухолевых заболеваний. Параллельно со все возрастающим у инфекционистов и онкологов пониманием недостатков и ограничений имеющихся методов терапии, в экспериментальной иммунологии произошло значительное накопление информации о молекулярных и клеточных механизмах антиинфекционного и противоопухолевого иммунитета, что позволило выделить «ключевые точки», наиболее перспективные для диагностического и терапевтического использования в медицине.
Все это привело к тому, что в конце 80-х годов прошлого столетия во многих лабораториях и клиниках мира были инициированы многоплановые исследования, целью которых являлась разработка новых методов ИСТ, способных повысить эффективность имеющейся этиотропной (антиинфекционной) и цитостатической (противоопухолевой) терапии. Кроме того, ИСТ стала рассматриваться как серьезная альтернатива для пациентов с заболеваниями, резистентными к традиционному лечению [1].
Такова предыстория «ренессанса иммунотерапии», который продолжается уже более четверти века.
Стратегические направления современной ИСТ
Современная стратегия ИСТ базируется на огромном фактическом материале и подробном исследовании различных способов, с помощью которых ИС уничтожает постоянно проникающие в организм патогены или возникающие в нем опухолевые клетки. Значительным подспорьем при разработке новых методов терапевтического воздействия на ИС служит все возрастающий прогресс в области молекулярной и клеточной биотехнологии. Однако следует отметить, что пока ни в одном из направлений ИСТ не достигнуто конечного (оптимального) результата, и многие из предлагаемых способов или еще не внедрены в клинику, или недостаточно широко и долго применяются для того, чтобы сделать однозначное заключение об их эффективности.
В настоящее время все опубликованные методы ИСТ можно разделить на активные и пассивные, специфические и неспецифические (табл. 1) [1].
Конечной целью активной специфической ИСТ является формирование адаптивного иммунного ответа с образованием большого количества цитотоксических антиген-специфических Т-лим-фоцитов или продуцирующих иммуноглобулины плазматических клеток. Главными проблемами при разработке эффективных методов в этом направлении являются следующие: требование к сохранности ИС пациента (т. е. у него не должно быть иммунодефицита), слабая иммуногенность некоторых типов микроорганизмов и значительного числа опухолей.
Активная неспецифическая иммунотерапия менее селективна по сравнению со специфической и преследует своей целью активировать работу всей ИС с расчетом на усиление, в том числе и иммунитета против конкретного антигена (патогена или
Таблица 1
Классификация современных методов ИСТ
Активная ИСТ — стимулирующее воздействие на одно или несколько звеньев ИС:
I. специфическая — формирование антиген-специфических клонов клеток, направленных на элиминацию заданного антигена:
1)вакцины;
2) «обученные» (лимфокин-активированные, опухоль-инфильтрирующие) лимфоциты;
II. неспецифическая (адъювантная) — антиген-независимая активация ИС, направленная на усиление «общего» иммунитета:
1) цитокины (интерферон у, колониестимулирующие факторы, интерлейкин 1 и 2);
2) нецитокиновые адъюванты (иммуномодуляторы микробного происхождения, индукторы цитокинов, тимические пептиды и тимомиметики, большинство «российских» химически-синтезированных имму-номодуляторов).
ПассивнаяИСТ (заместительная) — введение в организм пациентов эндогенных иммуноактивных веществ, обладающих эффекторными функциями; не рассчитана на включение в процесс элиминации антигенов собственной ИС:
I. специфическая — антиген-специфические моноклональные терапевтические антитела, обогащенные нормальные иммуноглобулины человека;
II. неспецифическая — нормальные иммуноглобулины человека, цитокины с прямым эффекторным действием (интерферон а и в, фактор некроза опухолей а).
опухоли). Основными слабыми точками данного подхода являются, как и в предыдущем случае, требование к способности ИС пациента к ответу на стимулятор и «распыленность» этого ответа, что может привести к неэффективному расходованию ресурсов ИС и преждевременному ее истощению.
Пассивная специфическая иммунотерапия является одним из наиболее динамичных направлений развиваемых сегодня. Около 25 монокло-нальных терапевтических антител (МАТ) уже внедрено в медицинскую практику, и еще несколько десятков препаратов этого типа находится на разных стадиях клинических испытаний. Однако МАТ-технология остается достаточно дорогостоящей и несовершенной, а большинство внедренных препаратов имеет иммуносупрессивную направленность.
Наконец, как показывает опыт, пассивная неспецифическая ИСТ может использоваться лишь при очень ограниченном количестве заболеваний. Это связано прежде всего с узким спектром существующих препаратов и, к сожалению, расширения этого спектра в ближайшее время ожидать не приходится.
Если отвлечься от приведенной классификации и проанализировать усилия/вложения крупнейших мировых фармпроизводителей и биотехнологических компаний в этой области за последнее десятилетие, то можно сформулировать пять основных направлений, в которых развивается современная ИСТ [2]:
• от живых вакцин к синтетическим эпитопам;
• от трансплантации органов и тканей к клеточным технологиям;
• от бактериальных лизатов к минимальным биологически активным фрагментам (МБАФ);
• от поликлональных антисывороток к трансгенным МАТ;
• от супернатантов и экстрактов к рекомби-нантным цитокинам.
К сожалению, в рамках одного обзора невозможно описать все пять направлений. В связи с этим мы остановимся только на двух из них: МБАФ (активная неспецифическая ИСТ) и МАТ (пассивная специфическая иммунотерапия).
От бактериальных лизатов к МБАФ
Как уже упоминалось в начале обзора, история препаратов данной группы начинается с W. ^^у и его экспериментов по использованию неочищенного экстракта лизированных бактерий для терапии опухолей. Учитывая достигнутый W. ^^у успех, неудивительно, что в течение следующего столетия предпринимались многочисленные исследования, направленные на разработку новых бактериальных экстрактов или лизатов, расширение спектра их клинического применения, изучение механизмов действия как самих комплексных
препаратов, так и отдельных компонентов, входящих в их состав.
В результате этих исследований к настоящему времени появилось несколько десятков препаратов данного типа, которые нашли широкое применение в различных областях современной медицины (табл. 2). Уже в самом начале изучения влияния бактериальных экстрактов и лизатов на организм пациентов было обнаружено, что их клинический эффект реализуется через воздействие на ИС. В связи с этим они были отнесены к группе иммунотроп-ных препаратов и в современной классификации занимают в отдельную подгруппу: «Иммуномоду-ляторы микробного происхождения» (ИМП).
Несмотря на очевидный прогресс в разработке все новых ИМП и накоплении успешного опыта использования их в клинике, до последнего времени оставалось много вопросов о конкретных молекулярных и клеточных механизмах действия этих препаратов. Среди наиболее точно установленных фактов следует выделить следующие:
• ИМП влияют на ИС иначе, чем вакцины. Как известно, основной целью вакцинации является активация адаптивного иммунного ответа с образованием антиген-специфических в отношении определенного патогена клонов Т- и В-лимфоцитов, а также Т-кле-ток памяти. В случае ИМП развитие устойчивого антиген-специфического Т- и В-клеточного иммунного ответа в отношении компонентов препаратов не является лидирующим механизмом их действия.
• Факты об усилении под влиянием ИМП активности Т-эффекторов (противоопухолевый и противовирусный иммунный ответ) и В-клеток (возрастание продукции Ig) по временным и количественным параметрам скорее свидетельствуют об активации уже имеющихся зрелых антиген-специфических лимфоцитов, чем о формировании новых клонов, специализированных в отношении входящих в состав ИМП компонентов.
Таблица 2
Классификация иммуномодуляторов микробного происхождения
I поколение — лизаты микроорганизмов:
• полипатогенные (бронхо-мунал, имудон, ИРС-19, паспат);
• монопатогенные (рузам, постеризан)
II поколение — частично очищенные компоненты:
• липополисахариды (продигиозан, пирогенал, лен-тинан);
• пептидогликаны (рибомунил, иммуномакс);
• рибосомы (рибомунил);
• нуклеиновые кислоты (нуклеинат натрия, ридос-тин)
III поколение — МБАФ:
• глюкозаминмурамилдипептид — ГМДП (ликопид);
• CpG олигонуклеотиды (промун, актилон, ваксим-мун);
• монофосфорил липид А — MLP
• Эмпирически подобранный в клинике режим дозирования ИМП (как правило, длительное применение в течение нескольких дней/недель, многократные повторные курсы) не соответствует схемам вакцинации и оптимальным условиям формирования адаптивного иммунного ответа.
• Основной мишенью для ИМП в ИС являются клетки врожденной ИС: мононуклеарные фагоциты, естественные киллеры, В-лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты, эпителиальные и дендритные клетки. Под действием ИМП происходит быстрая активация этих клеток, которая наиболее часто проявляется в виде двух феноменов: в возрастании их эффекторного потенциала и продукции цитокинов.
Переломным моментом в ответе на вопрос: «что и каким образом ИМП делают с иммунной ИС?» можно считать стремительное нарастание результатов широкомасштабных исследований, посвященных ключевым молекулярным механизмам функционирования системы врожденного иммунитета [3, 4]. Значительное количество накопленного к настоящему времени фактического материала, к сожалению, не позволяет в рамках данного обзора подробно рассмотреть все тонкости «работы» этой системы. В связи с этим мы остановимся только на нескольких основных рецепторах, связывающих
воедино все компоненты системы врожденного иммунитета и координирующих ее деятельность.
Итак, в отличие от адаптивной ИС, тонко настраиваемой на каждый проникший в организм антиген, система врожденного иммунитета сфокусирована на нескольких высоко консервативных структурах. Эти структуры получили название «патоген-ассоциированные молекулярные образы» (patogen-associated molecular patterns — PAMP), а соответствующие им рецепторы врожденной ИС — «образ-распознающих рецепторов» (pattern-recognition receptors — PRR) [5].
Наиболее известными PAMP являются бактериальный липополисахарид (ЛПС) (грамотри-цательные бактерии), липотейхоевые кислоты (грамположительные бактерии), пептидогликан (грамотрицательные и грамположительные бактерии), маннаны, бактериальная ДНК, двуспираль-ная РНК (вирусы) и глюканы (грибы).
Несмотря на значительные химические различия этих веществ, все РАМР имеют общие свойства [6, 7]:
• РАМР синтезируются только микроорганизмами; их синтез отсутствует в клетках макроорганизма. В связи с этим распознавание РАМР каким-либо из PRR является сигналом о наличии в организме хозяина инфекции;
Таблица3
Классификация и специфичность рецепторов врожденной ИС
Тип PRR PRR Лиганды Тип патогена
Эндоцитозные Маннозные Углеводы и гликопротеиды с высоким содержанием маннозы (маннаны) • грам-[+], • грам-[-], • грибы
Скавенджер ЛПС, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты • грам-[+], • грам-[-]
Сигнальные TLR-1 Триациллипопептиды, модулин M. tuberculosis • грам-[+], • грам-[-]
TLR-2 Липопротеиды большинства патогенов, пептидогликаны, липотейхоевые и маннуроновые кислоты, порины Neisseria, атипичные ЛПС, факторы вирулентности Yersinia, вирионы CMV, зимозан • грам-[+], • грам-[-], • грибы, • вирусы
TLR-3 Двунитчатая РНК • вирусы
TLR-4 ЛПС грамотрицательных бактерий, HSP60, полимерные манну-роновые кислоты, флаволипиды, тейхуроновые кислоты, пневмо-лизин, оболочечный белок RSV • грам-[+], • грам-[-], • вирусы
TLR-5 Флагеллин • грам-[+]
TLR-6 Диациллипопептиды, модулин, липотейхоевая кислота, зимозан • грам-[+], • грибы
TLR-7 Однонитчатая РНК, синтетические вещества • вирусы
TLR-8 Однонитчатая РНК, синтетические вещества • вирусы
TLR-9 Неметилированная CpG ДНК • грам-[+], • грам-[-]
TLR-10, -12, -13 Неизвестны
TLR-11 Профилин Toxoplasma gondii
NOD1 Пептидогликаны (GM-TriDap) • грам-[+]
NOD2 Пептидогликаны (ГМДП) • грам-[-]
ЭНДОЦИТОЗНЫЕ PRR (enPRR)
PAMP |=> enPRR □=> Фагоцито3 CZN Презентация ,_к
У у и лизис I У антигена I У i
Адаптивный иммунный ответ
СИГНАЛЬНЫЕ PRR (sPRR)
PAMP
sPRR
I-К. Активация экспрессов
генов цитокинов
Усиление функций фагоцитов
—_К. Активация зрелых
т У лифоцитов
Прайминг наивных лифоцитов
Е И Н Е Л А
В
С О
М
Рисунок. Реализация адаптивного и врожденного иммунного ответа через эндоцитозные и сигнальные PRR.
• РАМР являются наиболее общими в мире микроорганизмов структурами, характерными для больших таксономических групп (целых классов) патогенов. Например, ЛПС входит в состав клеточной стенки всех грамотрицательных бактерий и его распознавание сигнализирует о любой грамотрицательной инфекции;
• Структуры в составе РАМР, распознаваемые PRR (а значит, и врожденной ИС), являются важными для выживания и патогенности микроорганизмов. В соответствии с этим РАМР имеют наиболее низкую скорость структурных изменений в процессе эволюции микроорганизмов. Если же изменения в РАМР все-таки происходят, то наиболее часто это сопровождается утратой агрессии патогена по отношению к организму хозяина.
PRR по структурным характеристикам относятся к нескольким классам белковых молекул. По функции PRR можно разделить на две группы: эндоцитозные и сигнальные (табл. 3).
Эндоцитозные PRR (маннозные рецепторы и рецепторы-мусорщики) представлены на поверхности профессиональных антиген-представляю-щих клеток (фагоцитов). После распознавания соответствующего РАМР они опосредуют поглощение и доставку к лизосомам патогена, где впоследствии происходит его разрушение с образованием антигенных детерминант, которые в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовмести-мости (ГКГС) класса II представляются клеткам адаптивной ИС и запускают классический иммунный ответ [8]. Очевидно, через эндоцитозные PRR преимущественно реализуются начальные этапы вакцинального иммунного ответа (см. рисунок).
Среди сигнальных рецепторов центральное место занимают так называемые Toll-like (TLR) и NOD рецепторы. У человека семейство TLR в настоящее время насчитывает 13 членов, 10 из которых распознают практически все известные РАМР
грамположительных и грамотрицательных бактерий, вирусов и грибов [9, 10]. Кроме того, среди лигандов TLR могут быть отдельные эндогенные и синтетические вещества. Лигандами для NOD1 и NOD2 рецепторов являются различные фрагменты пептидогликана — основного компонента клеточной стенки всех бактерий [11].
Интересно отметить, что TLR-3, 7, 8, 9 и оба NOD рецептора локализованы цитоплазматичес-ки. Подобная локализация и специфичность этих PRR свидетельствуют о существовании у клеток системы «оповещения о несанкционированном прорыве» любого патогена внутрь клетки или «побега» его из фаголизосомы [12].
В отличие от эндоцитозных рецепторов конечным результатом взаимодействия сигнальных PRR с РАМР является индукция экспрессии большого количества генов и, в частности, генов про-воспалительных цитокинов, которая опосредуется через активацию транскрипционного фактора NF-kB [7, 13]. Сигнал с TLR и NOD рецепторов инициирует синтез ИЛ 1, 2, 6, 8, 12, фактора некроза опухолей а, интерферона у, гранулоцитарно-мак-рофагального колониестимулирующего фактора. Помимо цитокинов мишенями для NF-kB служат гены молекул адгезии, острофазовых белков, ферментов воспаления (NO-синтазы и циклооксигена-зы), молекул ГКГС и др. [14].
На уровне организма активация синтеза и секреции перечисленных молекул приводит к развитию воспалительной реакции с подключением всех имеющихся систем защиты от патогенов. На клеточном уровне эффект реализуется в трех направлениях (см. рисунок). Во-первых, происходит активация самих фагоцитов и значительное усиление их эффекторного потенциала (фагоцитоз, переваривающая активность, продукция активных форм кислорода). Во-вторых, уже имеющиеся антиген-специфические клетки адаптивного им-
мунитета переходят в активированное состояние и усиливают свои эффекторные функции. В частности, зрелые В-лимфоциты увеличивают продукцию Ig и становятся более чувствительными к антигенной стимуляции, а Т-эффекторы наращивают киллерные функции. И, в-третьих, происходит активация (прайминг) наивных лимфоцитов и подготовка их к началу адаптивного иммунного ответа. Учитывая, что для реализации эффекта с сигнальных PRR не требуется пролиферации клеток и формирования антиген-специфического клона (необходимых при адаптивном иммунном ответе), эффекторные реакции после распознавания данными рецепторами РАМР наступают немедленно. Этот факт объясняет высокую скорость врожденных иммунных реакций.
Необходимо отметить, что исследования в области молекулярной биологии системы врожденного иммунитета еще далеки от завершения. Остается множество вопросов как по составу РАМР, так и по спектру PRR, системам передачи сигнала, взаимодействию врожденного и адаптивного иммунитета. Однако уже на основании имеющихся данных можно сделать вывод, что открытые эмпирическим путем более столетия назад ИМП - это комплексные РАМР-содержащие препараты, стимулирующие врожденную ИС преимущественно через сигнальные PRR.
Этот вывод, опирающийся на подробное исследование молекулярных механизмов врожденного иммунитета, изменил отношение к уже имеющимся ИМП и позволил наметить новое стратегическое направление в разработке препаратов данной группы. Стало очевидным, что в составе препаратов бактериальных лизатов (I поколение ИМП) и их частично очищенных компонентов (II поколение ИМП) содержится множество «дублей», которые распознаются одними и теми же PRR и, как следствие, вызывают идентичный ответ ИС. Иначе говоря, ИМП I и II поколения страдают явной избыточностью (а, как известно из опыта фармакологии, каждый лишний компонент повышает стоимость препарата и создает дополнительный риск развития побочных эффектов). Кроме того, в ряде «старых» ИМП можно обнаружить «неработающие» компоненты, для которых до сих пор не идентифицированы PRR. В связи с этим новая стратегия направлена на выявление в составе РАМР минимальной структуры (МБАФ), способной активировать ИС, и создание на ее основе лекарственного препарата (так называемое III поколение ИМП). Вторым стратегическим направлением, в соответствии с традициями фармакологии, является поиск химических агонистов PRR. Существенными преимуществами МБАФ по сравнению с ИМП I и II поколения являются следующие:
• точно известная структура (гарантированный контроль качества и стандартизации препаратов в соответствии с критериями GMP);
• малая молекулярная масса (возможность получения препаратов синтетическим путем);
• известный молекулярный механизм действия (возможность лабораторной оценки эффективности препаратов до назначения пациенту);
• возможность провести нормальные фармако-кинетические исследования (точность дозирования, комбинирование с другими препаратами и др.).
Работы в этой области только начинаются. Несмотря на это, уже имеются несколько успешных разработок (табл. 4) и, в частности, ГМДП (эмпи-рически-найденный МБАФ, успешно используемый в клинике уже более 10 лет), монофосфорил липид А (адъювант, прошедший международные клинические испытания в качестве компонента противоаллергических вакцин), неметилирован-ные CpG олигодезоксинуклеотиды (заканчивают III фазу клинических испытаний в качестве адъ-ювантов в составе вакцин и препаратов для иммунотерапии опухолей и бронхиальной астмы), имиквимод и изатарибин (более 20 лет известные как противовирусные препараты, которые сегодня модифицированы в соответствии с новыми данными о механизме действия в эффективные иммуностимуляторы) и др. [11, 15-17].
Кроме того, идентификация рецепторов врожденного иммунитета и их лигандов легла в основу
Таблица4
Известные МБАФ, химические агонисты и их рецепторы
Тип препарата Рецептор Клиническое использование
Агонисты-МБАФ
ГМДП (пептидогли-кан) NOD2 Иммуностимулятор*
GM-TriDap (пептидо-гликан) NOD1 Биотерапия опухолей
Poly IC-Poly Arg (вирусная РНК) TLR-3 Адъювант*
MPLA (ЛПС) TLR-4 Адъювант*, иммуностимулятор
CpG ODN (бактериальная ДНК) TLR-9 Адъювант, астма, онкология
Химические агонисты
CRX-675, Ribi529 TLR-4 Адъювант, иммуностимулятор
Имиквимод, изата-рибин TLR-7 и -8 Противовирусные*
ANA773 TLR-7 Противовирусный
Химические антагонисты
Налоксон/ налтрексон TLR-4 Нейропатические боли*
Eritoran (E5564) TLR-4 Кардиовоспаление
Модифицированный CpG ODN TLR-9 Энцефаломиелит
* препараты, прошедшие регистрацию.
еще одного фармакологического направления, а именно химического модифицирования МБАФ с целью получения препаратов-антагонистов PRR. Уже первые экспериментальные результаты данного направления свидетельствуют о его перспективности и возможности получения нового класса иммуносупрессивных и противовоспалительных лекарственных препаратов для терапии аутоиммунных, атопических и хронических воспалительных заболеваний.
В заключение этой части обзора следует отметить, что эволюция ИМП, произошедшая всего за столетие, является одним из наиболее демонстративных примеров «ренессанса иммунотерапии», основанного на детальном знании физиологии ИС. Другим не менее ярким примером является история терапевтических МАТ.
От поликлональных антисывороток к трансгенным терапевтическим МАТ
История исследований, которые завершились к настоящему времени введением в клиническую практику гуманизированных мишень-специфических МАТ (а именно так называется последнее поколение препаратов этой группы), начинается с первых опытов Э. Дженнера и экспериментов Э. Беринга (проведенных спустя почти 100-летие), который обнаружил, что при введении животным дифтерийного токсина у них в сыворотке появляется «антитоксин» (антитела). Перенос антиток-син-содержащей сыворотки от животных больным дифтерией приводил к быстрому улучшению состояния и излечению пациентов. В отличие от вакцинации, целью которой являлось активировать собственный иммунный ответ, подход Беринга предполагал пассивный перенос иммунитета от одного организма к другому. В связи с этим данное направление получило название «пассивной иммунотерапии» [1, 18].
Дальнейшее развитие идей Беринга привело к появлению первых направленно созданных лекарственных препаратов, в состав которых входили АТ, — поликлональных антисывороток (ПАС). Со временем для иммунизации стали использовать не только антигены патогенных микрорганизмов, но и клеточные популяции человека, а затем определенные углеводно-белковые структуры клеток. Кроме того, после развития препаративной биохимии из иммунной сыворотки научились выделять иммуноглобулиновую фракцию и препараты ПАС стали более очищенными.
Хотя эффективность ПАС была доказана со времен Беринга, в настоящее время во многих странах они почти полностью исключены из списка лекарственных средств. Это, прежде всего, связано с наличием у лекарственных препаратов ПАС серьезных побочных эффектов и целого ряда фар-макокинетических недостатков.
Прорывом в области получения новых ан-тителсодержащих лекарственных препаратов стало открытие в 1975 г. Джорджем Келлером и Цезарем Мильштейном гибридомной технологии (Нобелевская премия 1985 г.). В основе предложенного ими метода лежало слияние антиген-специфических В-лимфоцитов, продуцирующих АТ, с опухолевыми клетками той же тканевой принадлежности и последующее клонирование получившихся гибридов [19]. В результате стало возможным получение «бессмертного» клона клеток-продуцентов, производящего АТ с заданной специфичностью (моноспецифические или моноклональные АТ).
Практически сразу же данная технология была подхвачена и использована практиками. На основе МАТ был модифицирован иммунофлуоресцентный и открыты радиоиммунный и иммунофермент-ный методы, которые изменили современную лабораторную диагностику. Менее чем через 7 лет с момента открытия гибридомной технологии была сделана первая попытка использования МАТ в качестве лекарственных препаратов, но в совершенно неожиданном качестве — для иммуносупрессивной терапии при трансплантации органов [20].
Таким образом, впервые стало очевидным, что АТ могут использоваться в нескольких направлениях и, в частности, как лекарственные препараты для пассивной ИСТ (иммунопротекторы) и как иммуносупрессанты в зависимости от антигена, который был выбран для их получения. Эта универсальность АТ определила дальнейшую стратегию разработки лекарственных препаратов на их основе.
Классификация терапевтических МАТ
Первое поколение терапевтических МАТ, также как и ПАС, по происхождению и составу являлись ^ животных (в основном мыши). Несмотря на снижение частоты побочных эффектов, это поколение МАТ «унаследовало» от ПАС три основных недостатка [21]:
• ограниченная эффективность — Fc-фрагмент МАТ животных не способен полноценно участвовать в иммунологических реакциях в организме человека (за счет видовых различий);
• развитие толерантности — чужеродное происхождение приводит к распознаванию МАТ I поколения ИС человека и выработке на них блокирующих АТ;
• «слабая» фармакокинетика — МАТ животных не стабильны в кровотоке человека, быстро метаболизируются и выводятся.
После расшифровки последовательности генов ^ человека и развития технологии получения синтетической кДНК на смену МАТ I поколения пришли так называемые химерные МАТ (II поколение). В этих препаратах каждое АТ «собрано» из фрагментов молекул ^ человека и мыши (приблизительно в равном соотношении).
В разработанных во второй половине 90-х годов XX века гуманизированных МАТ (III поколение) мышиное происхождение имеют только короткие антиген-распознающие последовательности (5-10% молекулы), а более 90% молекулы АТ представлены Ig человека. В настоящее время подавляющее большинство зарегистрированных терапевтических МАТ относится ко II и III поколениям. Наконец, IV поколение МАТ представляет собой уже полностью реконструированную молекулу Ig человека. По прогнозам, именно это поколение МАТ станет лидирующим и потеснит на рынке все остальные МАТ уже в ближайшее время (табл. 5).
«Гуманизация» позволила свести к минимуму все недостатки I поколения МАТ. МАТ IV поколения можно вводить многократно практически без риска развития блокирующего иммунного ответа, и фармакокинетические параметры этих препаратов приближены к эндогенным Ig человека (т. е.
продолжительность действия 4-8 недель, а T, ,„ в
1/2
среднем составляет 20 дней).
В рамках III-IV поколения разработаны несколько структурных модификаций МАТ. К наиболее перспективным с точки зрения клинического применения можно отнести следующие:
• токсические МАТ — АТ с «пришитым» на Fc-фрагмент бактериальным токсином или радиоизотопом;
• фрагменты МАТ — специфические участки, способные связывать лиганд (минибоди — тетра-, триа-, диабоди, вариабельные фрагменты, обычные и пегилированные);
• биспецифические МАТ — каждый из Fab-фрагментов АТ имеет свою специфичность, данные АТ способны связывать 2 различных лиганда одновременно;
• фузион-протеины — химерные молекулы, в которых Fab-фрагменты АТ заменены последовательностями из других белков (например, этанер-цепт представляет собой соединение ФНО-рецеп-торов с Fс-фрагментом молекулы IgG1).
Параллельно с «гуманизацией» МАТ происходило и совершенствование технологии их производства. Сегодня альтернативой гибридомной технологии (биореакторы) является продукция АТ из фаговых экспрессионных библиотек в E. coli, создание трансгенных растений-продуцентов МАТ
Таблица 5
Классификация МАТ по составу и способу получения
Название Поколение Igмышь/Igчеловек > %
Мышиные МАТ I 100/0
Химерные МАТ II 30/70
Гуманизированные МАТ III 5/95
Трансгенные МАТ IV 0/100
и даже попытки перейти к бесклеточной системе синтеза.
Механизмы действия МАТ.
Так сложилось, что все зарегистрированные к настоящему времени МАТ относятся к ингибирую-щим лекарственным препаратам [21, 22], т.е. в результате их действия происходит или уменьшение концентрации и активности каких-либо регуля-торных молекул, или уничтожение определенной популяции клеток (табл. 6).
Вместе с тем в многочисленных экспериментах показано, что МАТ высокоэффективны в качестве индукторов и активаторов различных функций клеток (пролиферация, продукция цитокинов, провоспалительных факторов и др.) [18]. В связи с этим в скором будущем можно ожидать расширения списка МАТ за счет препаратов с активирующим механизмом действия. Уже сейчас в различных фазах клинических испытаний находятся АТ-агонисты костимулирующих рецепторов (CTLA-4, CD28, CD25) иммунокомпетентных клеток.
Механизмы действия зарегистрированных МАТ достаточно хорошо изучены и зависят от типа (конструкции) Ig (табл. 7).
МАТ, максимально приближенные по строению к нормальным Ig и имеющие неизмененный Fc-фрагмент, в большей степени направлены против рецепторов на поверхности клеток. Их основной эффект — цитотоксический (АТ-зависимая цитотоксичность). Уничтожение клеток-мишеней происходит или с помощью Т-эффекторов и макрофагов (клеточная цитотоксичность), или через подключение системы комплемента и формирование мембраноатакующего комплекса. По этому механизму работают в основном противоопухолевые и частично иммуносупрессорные (мурономаб, алефацепт) МАТ [23].
Другой механизм наблюдается при структурном несовершенстве Fc-фрагментов МАТ, а также при использовании в качестве лекарственных препаратов Fab-фрагментов (минибоди, нанободи) и фузион-протеинов [24, 25]. Эти препараты играют роль рецепторных или химических антагонистов, препятствуя связыванию эндогенного лиганда со своим рецептором и активации внутриклеточной системы передачи сигнала. В результате происходит модификация биологического ответа (отсюда и название 1-й подгруппы МАТ в табл. 6).
МАТ, к Fc-фрагментам которых присоединены токсины или радиоизотопы (гемтузумаб, озогами-цин и ибритумомаб), по сути, представляют собой систему целевой доставки токсических агентов к определенной популяции клеток. После связывания с клеточным рецептором они интернализуются и, таким образом, создают внутри клетки-мишени концентрацию токсина или изотопа, несовместимую с ее жизнью. При этом они не проникают в нормальные клетки и их С в тканях и жидкостях
■L max ~
Таблица 6
Зарегистрированные препараты терапевтических МАТ (по данным на октябрь 2008 г. Управления по контролю за лекарственными препаратами и пищевыми продуктами (FDA — Food and Drug Administration) Министерства здравоохранения США)
МНН Поколение Мишень Показания
Модификаторы биологических реакций
Абциксимаб II Gp 11Ь/111а рецептор на тромбоцитах Кардиоваскулярная патология
Адалимумаб IV Фактор некроза опухолей а Ревматоидный артрит, болезнь Крона
Алефацепт III, фузион СD2-рецепторы Псориаз
Базиликсимаб II СD25 (ИЛ2-рецепторы) на лимфоцитах Отторжение трансплантата
Даклизумаб III СD25 (ИЛ2-рецепторы) на лимфоцитах Отторжение трансплантата
Инфликсимаб II Фактор некроза опухолей а Ревматоидный артрит, болезнь Крона
Мурономаб I СD3-рецепторы на Т-клетках Отторжение трансплантата
Натализумаб III VLA4-рецепторы на Т-клетках Аутоиммунные и воспалительные заболевания
Омализумаб III ^Е Бронхиальная астма, тяжелые атопии
Ранибизумаб III Васкулоэндотелиальный фактор роста Дистрофия сетчатки
Экулизумаб III С5 компонент комплемента Воспалительные заболевания
Эфализумаб III СD11а-рецепторы Псориаз, гемолитическая анемия
Этанерцепт III, фузион Фактор некроза опухолей а Ревматоидный артрит, болезнь Крона
Антиинфекционные МАТ
Паливизумаб III Белок F респираторно-синцитиального вируса Респираторная вирусная инфекция
Противоопухолевые МАТ
Алемзутумаб III СD52-рецепторы на В-, Т-, МК-клетках и моноцитах Хроническая лимфобластная лейкемия
Бевацизумаб III Васкулоэндотелиальный фактор роста (индуктор ангиогенеза) Рак молочной железы, почки, толстого кишечника
Гемтузумаб III + токсин СD33-рецепторы на лейкемических Острая миелобластная лейкемия
озогамицин бластах
Ибритумомаб I + иттий90 СD20-рецепторы на В-клетках Неходжинские лимфомы
Капромаб I + индий111 Простатаспецифический антиген Рак простаты
Панитумумаб IV Рецептор эпидермального фактора роста Рак толстого кишечника
Ритуксимаб II СD20-рецепторы на В-клетках Неходжинские лимфомы
Тозитумомаб I СD20-рецепторы на В-клетках Неходжинские лимфомы
Трастуксумаб III Онкобелок HER2 Метастазирующий рак молочной железы
Цетуксимаб II Эпидермальный фактор роста Рак толстого кишечника, поджелудочной железы
организма значительно ниже токсической [20, 26].
Еще один интересный и очень перспективный с точки зрения повышения эффективности и уменьшения побочных эффектов механизм действия характерен для особого типа МАТ — абзи-мов, которые находятся пока в стадии разработки. Абзимы — это АТ, обладающие одновременно и антиген-связывающей, и ферментативной активностью [27]. Связываясь с лигандом, они способны необратимо его инактивировать за счет расщепления на короткие фрагменты, причем одна молекула абзима может «уничтожить» несколько молекул лиганда. В качестве примера можно привести
моноклональный протабзим, гидролизующий поверхностный антиген gp120 вируса СПИДа, в результате действия которого в течение длительного времени у больных предотвращается персистен-ция ВИЧ [28].
Таким образом, МАТ представляют собой технологию, способную обеспечить неограниченный поток высокоэффективных лекарственных препаратов в самых различных областях медицины. Накопленный к настоящему времени опыт по разработке и клиническому использованию МАТ позволяет смело назвать их «препаратами будущего». С появлением МАТ в фармакологии исчезает один
Таблица 7
Механизмы действия различных вариантов терапевтических МАТ
Тип МАТ Механизм действия
МАТ с нормальным Fc-фрагментом Клеточная или комплементопосредованная цитотоксичность
МАТ с токсином или изотопом на Fc-фрагменте Прямая цитотоксичность за счет доставки повреждающего агента в клетку
МАТ с измененным Fc-фрагментом Блокада функционально важных рецепторов на клетках, химический антагонизм
Fab-фрагменты МАТ (минибоди, нанободи) Химический антагонизм — «перехват» молекул-регуляторов (цитокинов, факторов роста и др.) до их связывания с рецептором
Абзимы Расщепление «патологических» молекул-регуляторов и срезание клеточных рецепторов
Фузион-протеины Химический антагонизм (связывание и инактивация эндогенных лигандов рецепторов)
из наиболее трудоемких и непредсказуемых этапов создания лекарственных препаратов — начальный поиск эффективных и специфических действующих субстанций. Исходя из принципов получения МАТ, теперь достаточно определить ключевую мо-
лекулу, лимитирующую тот или иной патологический процесс, и при условии ее иммуногенности получение эффективного и высокоселективного лекарственного препарата является чисто технической и быстро разрешимой задачей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Waldmann TA. Immunotherapy: past, present and future. Nat. Med. 2003; 9 (3): 269-277.
2. Reichert JM. Trends in development and approval times for new therapeutics in the United States. Nature Rev. Drug Dis-cov. 2003; 2: 695-702.
3. Wright SD. Toll, a new piece in the puzzle of innate immunity. J. Exp. Med. 1999; 189 (4): 605-609.
4. Girardin SE, Philpott DJ, Lemaitre B. Sensing microbes by diverse hosts. Workshop on Pattern Recognition Proteins and Receptors. EMBO rep. 2003; 4 (10): 932-936.
5. Sabroe I, Read RC, Whyte MKB et al. Toll-like receptors in health and disease: complex questions remain. J. Immunol. 2003; 171 (4): 1630-1635.
6. Medzhitov R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 2001; 1: 136-144.
7. Medzhitov R, Janeway C. Innate immunity. N. Engl. J. Med. 2000; 343 (5): 338-344.
8. Taylor ME, Conary JT, Lennartz MR et al. Primary structure of the mannose receptor contains multiple motifs resembling carbohydrate-recognition domains. J. Biol. Chem. 1990; 256: 12156-12162.
9. Taguchi T, Mitcham JL, Dower SK et al. Chromosomal localization of TIL, a gene encoding a protein related to the Dro-sophila transmembrane receptor Toll, to human chromosome 4p14. Genom. 1996; 32: 486-488.
10. Du X, Poltorak A, Wei Y, Beutler B. Three novel mammalian toll-like receptors: gene structure, expression, and evolution. Eur. Cytokine Netw. 2000; 11: 362-371.
11. Girardin SE, Travassos LH, Herve M et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41702-41708.
12. Boehme KW, Compton T. Innate sensing of viruses by Toll-like receptors. J Virology. 2004; 78 (15): 7867-7873.
13. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H et al. Role of adapter TRIF in the MyD88-independent Toll-like receptor signaling pathway. Science. 2003; 301: 640-643.
14. Caamano J, Hunter CA. NF-kB family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions. Clin Microbiol Rev. 2002; 15 (3): 414-429.
15. Chu RS, Targoni OS, Krieg AM et al. CpG oligodeoxynu-
cleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. J. Exp. Med. 1997; 186 (10): 1623-1631.
16. Shimizu T, Iwamoto Y, Yanagihara et al. Combined effects of synthetic lipid A analogs or bacterial lypopolysaccha-ride with glucosaminylmuramyl dipeptide on antitumor activity against meth A fibrosarcoma in mice. Int. Immunopharmacol. 1992; 14 (8): 1415-1420.
17. Levy O, Suter EE, Miller RL, Wessels MR. Unique efficacy of Toll-like receptor 8 agonists in activating human neonatal antigen-presenting cells. Blood. 2006; 108 (4): 1284-1290.
18. George AJT, Urch CE. Diagnostic and therapeutic antibodies. In: Methods in Molecular Medicine Series. Humana Press. 2000; 40: 243-266.
19. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256: 495-497.
20. Silverstein AM. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nature Immunol. 2004; 5: 1211-1217.
21. Breedveld FC. Therapeutic monoclonal antibodies. Lancet. 2000; 355: 735-740.
22. Gura T. Magic bullets hit the target. Nature. 2002; 147: 584-587.
23. Glennie MJ, van de Winkel JGJ. Renaissance of cancer therapeutic antibodies. Drug Discovery Today. 2003; 8: 503-510.
24. Hudson PJ, Kortt AA. High avidity scFv multimers; dia-bodies and triabodies. J. Immunol. Methods. 1999; 231: 177-189.
25. Jackson JM. TNF-alpha inhibitors. Dermatol. Ther. 2007; 20 (4): 251-264.
26. Goldenberg DM. Advancing role of radiolabelled antibodies in the therapy of cancer. Cancer Immunol. Immunother. 2003; 52: 281-296.
27. Abraham S, Guo F, Li LS et al. Synthesis of the next-generation therapeutic antibodies that combine cell targeting and antibody-catalyzed prodrug activation. PNAS. 2007; 104 (13): 5584-5589.
28. Planque S, Mitsuda Y, Taguchi H et al. Characterization of gp120 hydrolysis by IgA antibodies from humans without HIV infection. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2007; 23 (12): 15411554.
